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Abstract

来源:Jia， Z. et al.， A 5-mC 斑点印迹测定法，量化体外软骨细胞去分化的 DNA 甲基化水平。J. Vis. Exp.（2017 年）

该视频介绍了点印迹技术，该技术通过在尼龙膜上印迹 DNA 样品并随后使用单克隆抗体进行可视化，在体外确定人软骨细胞中 DNA 甲基化水平。这有助于确定软骨细胞在培养各个阶段的表型。

Protocol

1. 人关节软骨组织采集和软骨细胞培养

1. 材料准备
   1. 制备补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 培养基。准备 1 mg/mL 胶原酶 II、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和细胞过滤器（40 μm 尼龙）。
2. 人体关节软骨组织采集
   1. 创伤后将关节软骨与供体患者的膝关节隔离。获得所有参与者的知情同意。
   2. 使用无菌手术刀将软骨切成 1-2 毫米³ 块，并在 37 °C 下用 1 mg/mL 胶原酶 II 在 DMEM 中消化切碎的软骨细胞 12-16 小时。
   3. 通过细胞过滤器 （40 μm） 过滤所得细胞悬液，并用 PBS 洗涤两次。
   4. 用血细胞计数器计数细胞，并以 20,000-30,000 个细胞/cm² 的密度接种在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素 – 链霉素的 DMEM 中。
   5. 在 37 °C 的培养箱中培养。
3. 单层软骨细胞扩增
   1. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收获亚汇合细胞，并以 6,600 个细胞/cm² 的密度重新铺板。每周更换培养基两次。
   在
   2. 单层中培养软骨细胞最多 6 次传代，并在第 1、2、3、4 和 5 次传代时进行评估。

2. 基因组 DNA （gDNA） 提取

1. 收集细胞并重悬于每 1000 万个细胞 500 μL 裂解缓冲液（15 mM Tris pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0、0.5% SDS、200 μg/mL RNase A）中。通过移液和快速倒置重悬细胞，然后在 37 °C 下孵育 1 小时。
2. 添加浓度为 160 μg/mL 的细胞裂解物蛋白酶 K，并剧烈倒置混合物。在 55 °C 下孵育 6 小时。
3. 向样品中加入一体积的 Tris pH 7.9 饱和苯酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1）。用手彻底涡旋或摇晃样品约 20 秒。
4. 在室温下以 13,000 × g 离心样品 5 分钟。去除上层水相，并将该层转移到新试管中。
5. 用等体积的氯仿提取以去除苯酚，并将顶部水相转移到新试管中。
6. 通过加入 0.1 份样品体积的 3 M 乙酸钠 pH 8.0 和 2 体积的 100% 乙醇来沉淀 DNA。
7. 将试管在 -20 °C 下储存过夜以沉淀 gDNA。
8. 将样品在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟以沉淀 gDNA。
9. 用 70% 乙醇洗涤样品 3 次，并在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 2 分钟。
10. 小心取出上清液，然后风干。将 DNA 重悬于 10 mM Tris pH 8.0、0.1 mM EDTA 中。

3. DNA 甲基化分析

1. 根据制造商的方案，使用 DNA 甲基化试剂盒使用总共 500 ng 的基因组 DNA 进行亚硫酸氢盐转化反应。在 10 μL 洗脱缓冲液 （50 ng/μL） 中洗脱。
2. 根据制造商的方案，使用市售试剂盒进行 DNA 甲基化分析。

4. 斑点印迹分析

1. 将分离的 DNA（每个样品 1 mg）在 0.1 M NaOH 中在 95 °C 下变性 10 分钟。在冰上用 1 M NH₄OAc 中和DNA，然后稀释两倍。在 N ⁺ 膜上点样 2 μL 连续稀释的基因组 DNA。
2. 在 80 °C 下印迹膜 30 分钟。
3. 通过将 N ⁺ 膜浸泡在 TBS-T 中的 5% BSA 中 1 小时来阻断非特异性抗体结合位点。在室温下使用 10 cm 培养皿作为反应室。
4. 在 TBST 中洗涤 5 分钟三次后，将膜与小鼠抗 5-甲基胞嘧啶 （5-mC） 单克隆抗体 （1:1,000） 在 TBS-T 中于 4 °C 孵育过夜。
5. 在 TBS-T 中洗涤膜 5 分钟 3 次，然后在室温下与二抗、HRP 偶联的绵羊抗小鼠免疫球蛋白-G （IgG） （1:5,000） 在 TBS-T 中孵育 1 小时。
6. 在 TBS-T 中洗涤膜 5 分钟 3 次。
7. 将酶底物添加到膜上并孵育 5-10 分钟。根据制造商的说明，使用化学发光试剂盒可视化二抗信号。

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE