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Abstract

来源:Hillert-Richter， L. K. et al.， 测量 CD95 死亡诱导信号复合物的组成和该复合物中 procaspase-8 的加工。 （2021 年）。

该视频描述了免疫沉淀裂解物的基于化学发光的蛋白质印迹。该技术有助于确定蛋白质加工和活化。检测到的化学发光信号与其激活过程中的蛋白质加工水平成正比。

Protocol

T 细胞实验根据伦理协议 42502-2-1273 Uni MD 进行。

1. 为实验准备细胞

注意:该免疫沉淀的平均细胞数为 1 × 10⁷。贴壁细胞必须在实验前一天接种，以便在实验当天有 1 × 10⁷ 个细胞。

1. 为实验准备贴壁细胞
   在
   1. 实验开始前一天，将 5-8 ×¹⁰ 6 个贴壁细胞接种在 20 mL 培养基中（成分见材料表），在 14.5 cm 培养皿中
   。
   2. 在实验当天，确保细胞 80-90% 汇合并粘附在培养皿上。弃去培养基，向贴壁细胞中加入新鲜培养基。
2. 为实验准备悬浮细胞
   在
   1. 实验开始前，将 1 × 10⁷ 个悬浮细胞小心地放入 10 mL 培养基中（成分参见材料表）中，置于 14.5 cm 培养皿中。
   2. 如果使用原代细胞，请根据先前描述的程序分离原代 T 细胞。用 1 μg/mL 植物血凝素处理原代 T 细胞 24 小时，然后用 25 U/mL IL2 处理 6 天。
   在
   3. 实验开始前，将 1 ×^{10 个 8} 个原代 T 细胞小心地放入 10 mL 培养基中（成分参见材料表）中><，放在 14.5 cm 培养皿中。 注意:建议增加原代 T 细胞的数量，因为这些细胞较小。

2. CD95L 刺激

1. 用 CD95L（如前所述生产或市售（参见材料表）刺激细胞><。 注意:CD95L 的浓度和刺激时间取决于细胞类型。准备一个刺激条件两次，以平行生成”珠子对照”样品。
   1. 用选定浓度的 CD95L 刺激贴壁细胞。以一定角度握住板，将配体移液到培养基中，不要接触贴壁细胞。
   2. 通过将配体溶液移液到细胞悬液中，用 CD95L 刺激悬浮细胞。

3. 细胞收获和裂解

1. 将细胞培养皿置于冰上。
   注意:不要丢弃培养基。垂死的细胞漂浮在培养基中，对分析很重要。
2. 向细胞悬液中加入 10 mL 冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS），并将附着的细胞从板上刮下。将细胞悬液收集在 50 mL 试管中。
3. 用 10 mL 冷 PBS 洗涤细胞培养皿两次，然后将洗涤液放入同一 50 mL 试管中。将细胞悬液在 500 × g 下离心 5 分钟，4 °C。
4. 弃去上清液，用 1 mL 冷 PBS 重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移到 1.5 mL 试管中。
5. 将细胞悬液在 500 × g 下离心 5 分钟，4 °C。弃去上清液，用 1 mL 冷 PBS 重悬细胞沉淀。
6. 将细胞悬液在 500 × g 下离心 5 分钟，4 °C。弃去上清液，用 1 mL 裂解缓冲液（含有 4% 蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。在冰上孵育 30 分钟。
以
7. 最大速度 （~17,000 × g） 离心裂解物，4 °C 15 分钟。
8. 将上清液（裂解物）转移到干净的试管中。丢弃沉淀。在另一个试管中取 50 μL 裂解物。通过 Bradford 测定法分析蛋白质浓度，并在小瓶中取相当于 25 μg 蛋白质的裂解物量。向小瓶中加入上样缓冲液（成分参见材料表）。将其储存在 -20 °C 作为裂解物对照。

4. 免疫沉淀 （IP）

1. 向裂解物中加入 2 μL 抗 APO-1 抗体和 10 μL 蛋白 A 琼脂糖珠（按照制造商的建议制备）。将 10 μL 微珠添加到含有裂解物（刺激样品）的单独试管中，以产生”微珠对照”
   注意:在处理蛋白 A 琼脂糖凝胶珠时，通过切割吸头或购买用于 IP 的特殊吸头，使用宽孔移液器吸头。
2. 将裂解物与抗体/蛋白 A 琼脂糖珠的混合物在 4 °C 下轻轻混合孵育过夜。将裂解物与抗体/蛋白 A 琼脂糖珠以 500 × g 离心 4 分钟，4 °C。弃去上清液，向珠子中加入 1 mL 冷 PBS，并重复此步骤至少 3 次。
3. 丢弃上清液。最好使用 50 μL Hamilton 注射器吸出珠子。

5. 蛋白质印迹

1. 向微珠中加入 20 μL 4x 上样缓冲液（成分参见材料表），并在 95 °C 下加热 10 分钟。在 95 °C 下加热裂解物对照 5 分钟。
2. 将裂解物、IP 和蛋白质标准品加载到 12.5% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 凝胶上（参见凝胶制备材料表），并以 80 V 的恒定电压运行。
3. 将蛋白质从 SDS 凝胶转移到硝酸纤维素膜上。
   注意:在这里，使用针对目标蛋白质优化的半干技术进行 12 分钟的转印（25 V;2.5 A = 常数）。在蛋白质印迹前，将硝酸纤维素膜和两个微型转移膜组浸泡在电泳缓冲液中（成分参见材料表，根据制造商的说明准备）几分钟。
4. 将印迹膜放入盒子中，并在封闭溶液（PBS （PBST） 中的 0.1% 吐温-20 + 5% 牛奶）中封闭 1 小时。在轻轻搅拌下将膜与封闭溶液一起孵育。
5. 用 PBST 洗涤膜 3 次，每次洗涤 5 分钟。

6. 蛋白质印迹检测

1. 将指定稀释度的第一一抗（参见材料表）添加到膜中，并在 4 °C 下轻轻搅拌孵育过夜。
2. 用 PBST 洗涤膜 3 次，每次洗涤 5 分钟。
3. 将膜与 20 mL 二抗（在 PBST + 5% 牛奶中以 1:10,000 稀释）在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。
4. 用 PBST 洗涤膜 3 次，每次洗涤 5 分钟。
5. 弃去 PBST，向膜上加入大约 1 mL 辣根过氧化物酶底物。
6. 检测化学发光信号（参见材料表）.
   注意:曝光时间和捕获图像的数量取决于细胞中蛋白质的量和所用抗体的特异性。必须根据经验为用于检测的每种抗体确定它。

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000