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Abstract

来源:Ketelboeter， LM et al.， 抑制细菌性幽黑素产生并确定对氧化应激敏感性的相应增加的方法。J. Vis. Exp. （2015）

该视频演示了一种专为评估细菌菌株的氧化应激反应而定制的点板检测。一些菌株会产生幽黑素，这是一种抗氧化色素。相反，用测试剂处理的菌株导致脓黑素产生减少，表现出对氧化应激的敏感性增加，与产生幽黑素的菌株相比，导致细胞活力降低。

Protocol

1. 培养基、抗生素和 2-[2-硝基-4-（三氟甲基）苯甲酰基]-1,3-环己二酮 （NTBC） 的制备

1. 制备 Luria-Bertani （LB） 肉汤（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.25% 氯化钠、H₂O 中的 NaCl）并分装成适当的体积。通过高压灭菌器灭菌。在室温下储存。
2. 在 250 ml 烧瓶中制备 100 ml LB 琼脂（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.25% NaCl、1.5% 琼脂在 H₂O 中）。通过高压灭菌器灭菌并在室温下储存。确保在倒入板中之前琼脂已熔化。
   注意:含有 100 ml LB 琼脂的培养瓶将产生 4 个板。LB 琼脂的量可以改变以对应于测定所需的平板数。
3. 制备磷酸盐缓冲盐水，PBS（137 mM NaCl，2.7 mM 氯化钾，KCl，10 mM 磷酸氢二钠，Na₂HPO_4,2 mM 磷酸二氢钾，KH₂PO₄）。通过高压灭菌器或过滤灭菌并在室温下储存。
4. 准备庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的抗生素储备溶液。
   1. 为含有 100 mg/ml 庆大霉素、30 mg/ml 卡那霉素和 10 mg/ml 妥布霉素的铜绿假单胞菌菌株制备适当的抗生素原液浓度。将抗生素溶解在水中，过滤灭菌（0.2μm），并在4°C下储存。根据研究的细菌改变抗生素和浓度。

2. 氧化应激反应的点板测定

1. 设置待测菌株的过夜培养物。将 2 ml LB 肉汤加入 16 x 150 mm 试管中（每个菌株一个），并接种来自每个菌株的 1 个分离菌落。在 37 °C 下孵育过夜，并在空气培养箱中的组织培养旋转器上充气。
2. 测量过夜培养物的 OD₆₀₀。在测量 OD₆₀₀ 读数之前洗涤培养物，以消除培养基中存在的脓黑素。
3. 通过在微量离心机中以 16,000 x g 的速度离心 1 ml 培养物 2 分钟来洗涤培养物。用微量移液器去除上清液和任何松散沉淀的细胞，并将固体细胞沉淀重悬于 1 ml LB 中。
4. 第二天，准备含有 H₂O₂ 作为氧化应激源的 LB 琼脂平板。H₂O₂ 浓度范围为 0 至 1 mM 是一个很好的起点。
   1. 熔化 LB 琼脂培养瓶。在室温下将培养基冷却至约 50 °C。
   2. 将 H₂O₂ 以所需浓度直接添加到冷却的培养基中。旋转培养瓶混合。参见表 1 了解 H₂O₂ 的浓度和要添加的浓 H₂O₂ 的体积。这些值基于 100 ml LB 琼脂。
   3. 加入 H₂O₂ 后立即倒入板，并对表面进行火焰以去除气泡。产量为每 4 ml LB 琼脂 100 个板。用 H₂O₂ 浓度标记板。
   4. 将未覆盖的板放入生物流罩中，风扇运行 30 分钟，以去除板中多余的水分。
      注意:在准备好板的同一天使用它们。否则可能会导致数据不一致。
      注意:在该检测中，百草枯等氧化应激源可以替代 H₂O₂。用于其他氧化应激源的浓度可能与用于 H₂O₂ 的浓度不同。
5. 洗涤并测量过夜培养物的 OD₆₀₀
。
6. 将所有过夜培养物的 OD₆₀₀ 标准化为正在测试的菌株组的最低值。铜绿假单胞菌在 LB 中过夜生长时，OD₆₀₀ 通常约为 2.5。
   1. 确定将培养物稀释至最低 OD₆₀₀ 所需的培养物体积，总体积为 1 ml。例如，如果培养物的 OD₆₀₀ 为 3，而该菌株组的最低 OD₆₀₀ 为 2.5，则执行以下计算:（2.5）（1 ml） = （3）（x）。x = 0.833 ml。将 0.833 ml 培养物置于微量离心管中。
   2. 计算使培养体积达到 1 ml 所需的 LB + DMSO 量。对于步骤 4.4.1 中的示例，添加到培养物中的 LB + DMSO 的量为 0.167 ml（1 ml 总体积 – 0.833 ml 培养物）。根据稀释所有菌株所需的体积，制作用于这些稀释的 LB + DMSO 储备液。
   3. 通过涡旋混合培养物和 LB + DMSO。
7. 为了将培养物维持在恒定浓度的 DMSO 中，请在 PBS + DMSO 中对归一化过夜培养物进行 10 倍连续稀释。
   1. 制备 PBS + DMSO 的储备溶液。对于一个菌株的一组稀释液，将 300 μM 体积的 DMSO 与 PBS 混合，得到 720 μl 的总体积。根据测试的菌株数量增加或缩小这些库存。
   2. 标记微量离心管，进行 ^10-1 至 ^10-7 次连续稀释。将 90 μl PBS + DMSO 添加到适当的试管中。将 PBS + DMSO 用于在 LB + DMSO 中生长的菌株。
   3. 将 10 μl 培养物添加到适当的 ^10-1 稀释管中。涡旋混合，并将 10 μl ^10-1 稀释液转移到 ^10-2 稀释管中。重复直到完成所有稀释。在两次稀释之间更换移液器吸头。
对于每个
8. 菌株，在 LB + H₂O₂ 平板上点样 5 μl ^10-3 至 ^10-7 稀释液，一式两份。如果斑点从最稀到最不稀（^10-7 到 ^10-3）铺板，请使用一个移液管吸头。在液体干燥到板中之前，不要倾斜板。
9. 将板在 37 °C（空气培养箱）下孵育 24-48 小时，具体取决于菌株><。 注意:铜绿假单胞菌 PAO1 在孵育 24 小时后将在 LB 上产生大小适中的菌落。孵育菌株，直到它们具有与 PAO1 大小大致相同的菌落。
10. 使用透射器上方的 CCD 相机拍摄板。（可选）编辑照片以进行对比，并将其裁剪为相同大小。计算每个点的菌落数以确定对氧化应激敏感性的变化。

表 1:添加到用于氧化应激斑点板测定的 LB 琼脂中的 H₂O₂ 浓度。该表给出了各种 H₂O₂ 浓度和相应量的浓缩 H₂O₂ 原液添加到 100 ml LB 琼脂中。

H₂O₂ 的最终浓度 （mM） 添加量为 9.79 M H₂O₂ （30% wt） （μl） 0 0 0,2% 2,04 0,4 4,09 0,6 6,13 0,8 8,17 1 10,21

Materials

2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone. Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt.% in H2O. Stabilized.