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小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

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DOI：

10.3791/2307

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2010年10月22日

 ,  ,  , 
1NYU Cancer institute, New York University School of Medicine, 2Program in Structural Biology, New York University School of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案

摘要

T细胞受体（TCRs）在免疫系统中发挥核心作用。T细胞表面的TCRs能够特异性识别由抗原呈递细胞（APCs）呈递的肽类抗原1。这种识别可导致T细胞的活化以及一系列功能效应（例如细胞因子的产生、靶细胞的杀伤）。深入理解TCRs的功能作用，对于利用免疫系统的潜力来治疗多种免疫相关疾病（如癌症或自身免疫性疾病）至关重要。

在小鼠模型中研究 TCR 具有便利性，可通过多种方式实现。制备 TCR 转基因小鼠模型成本较高且耗时较长，目前可用的此类模型数量有限。2-4或者，可通过骨髓嵌合体方法制备含有抗原特异性T细胞的小鼠。该方法同样需要数周时间，且需要专业技术。5. TCRs 的逆转录病毒转导 体外 活化的鼠源T细胞是一种快速且相对简便的方法，用于获得具有特定肽-MHC特异性的T细胞。抗原特异性T细胞可在一周内生成，并可用于任何后续应用。对转导T细胞的研究也直接应用于人类免疫治疗，因为过继性转移经抗原特异性TCR转导的人源T细胞正成为一种新兴的癌症治疗策略6.

在此，我们介绍一种通过逆转录病毒将TCR转导至T细胞的实验方案 体外 活化的鼠源T细胞。可使用人或鼠的TCR基因。通过生成携带特异性TCR基因的逆转录病毒，转导经抗CD3和抗CD28抗体激活的鼠源T细胞。之后 体外 扩增后，通过流式细胞术分析转导的T细胞。

方案

1. 准备逆转录病毒载体

  1. 将目标 T 细胞受体（TCR）基因亚克隆至逆转录病毒载体中（图 1，示例载体 pMSG7、pMIGII5,8、Cellbiolabs 公司的 pMXs）。TCR 的 α 链和 β 链基因应位于同一载体上，并由同一启动子调控，以确保表达水平一致。若目标 TCR 为人类来源，则需将人恒定区结构域替换为小鼠恒定区结构域9。我们观察到，全长的人源 TCR 在小鼠 T 细胞上无法稳定表达。
  2. 使用 Qiagen Maxi Prep Kit 或类似产品制备高质量质粒 DNA。质粒浓度应约为 1 μg/μL。

2. 转染与T细胞分离

第 -1 天（铺板包装细胞）

  1. 使用胰蛋白酶-EDTA 消化 Platinum-E（Plat-E，Cellbiolabs）逆转录病毒包装细胞，并用 DMEM 培养基中和。
  2. 以 1000 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 DMEM 培养基中。
  3. 测定细胞数量，将细胞稀释至 0.6×106/mL。取 10 mL 细胞悬液接种于 10 mm 多聚赖氨酸包被的组织培养皿中，于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中培养过夜。

第0天（转染）

  1. 次日早晨，在光学显微镜下观察细胞，细胞融合度应约为80%。
  2. 轻柔地从培养板中移除培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后加入10 mL预热的新鲜DMEM培养基（不含青霉素-链霉素，Pen/Strep）。
    （注意：Pen/Strep可能干扰转染过程）
  3. 制备转染复合物。

    按以下方式制备混合液A和B：

    混合液A：质粒DNA9 μg
    pCL-Eco辅助质粒6.3 μg
    OptiMEM1.5 mL
     
    混合液B：Lipopfectime 200060 μL
    OptiMEM1.5 mL

    将A和B在室温下分别孵育5分钟。

    轻柔混合A和B，室温孵育20分钟以形成转染复合物。
  4. 将混合液（总体积3 mL）缓慢滴加至Plat-E细胞中，轻轻前后摇动培养板，使转染混合物均匀分布。
  5. 将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育。
  6. 6–8小时后，更换为10 mL新鲜DMEM培养基（含Pen/Strep），用于病毒生产。

用抗体包被板

  1. 在进行病毒转导之前，需要先激活小鼠 T 细胞。激活 T 细胞的方法有多种。本实验中采用包被于培养板的抗-CD3e 和抗-CD28 抗体。用无菌 PBS 配制含有 1 μg/mL 抗-CD3e 和 2 μg/mL 抗-CD28 的抗体混合液。
  2. 向 24 孔组织培养板的每孔中加入 250 μL 抗体混合液。包被过程可在 4 °C 过夜，或在 37 °C 孵育 2 小时完成。

小鼠脾脏单细胞悬液的制备

  1. 取小鼠脾脏并转移至 RPMI 培养基中。
  2. 将脾脏置于细胞滤筛中，用注射器活塞充分研磨，使细胞进入 5 cm 组织培养皿中。用无菌 PBS 冲洗细胞滤筛，将细胞冲洗下来。
  3. 以 1000 ×g 离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 ACK 裂解缓冲液中（每只脾脏加 2 mL）。室温孵育 2 至 3 分钟。加入 RPMI 培养基至总体积达 20 mL，再以 1000 ×g 离心 5 分钟。
  5. 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于无菌 PBS 中。计数细胞数量后，于 4 °C 下以 1000 ×g 离心 5 分钟。随后进行 T 细胞的分离。

小鼠T细胞的分离与活化

  1. 根据产品说明书（Miltenyi Biotec公司CD8+ T细胞分离试剂盒）对细胞进行磁性标记。
  2. 将LS柱（Miltenyi Biotec公司）置于磁场中。将标记后的细胞悬液加至柱上，收集流穿液（富集的小鼠CD8+ T细胞）。根据产品说明书，用3 mL缓冲液洗涤柱子三次，并将洗涤液与之前的流穿液合并。
  3. 用抗CD3e和抗CD8a抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析（图2a）。典型分离结果为：可获得约占总细胞数8-10%的细胞，其中约90%为CD8+ T细胞。
  4. 将细胞以1000 ×g离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含重组人IL-2（rhIL2，20 ng/mL）的RPMI培养基中，细胞密度为1×106 /mL。
  5. 在加入细胞前，从培养板（先前在步骤2.11中制备）中移除抗体溶液。每孔用无菌PBS洗涤一次，随后吸去PBS。
  6. 每孔加入1 mL细胞悬液。将培养板置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中孵育。

3. （第2天和第3天）活化T细胞的感染

  1. 病毒产生2天后，Plat-E细胞培养板中的培养基应变为黄色。将病毒上清液转移至15 mL锥形管中。向培养板中加入10 mL新鲜DMEM培养基，以继续产生病毒（可选）。
  2. 以1000 ×g离心病毒上清液5分钟，以去除细胞碎片。小心地将病毒上清液转移至新管中。保留管底少量液体，避免扰动沉淀的细胞碎片。
  3. 将激活的T细胞从培养板中收集至50 mL锥形管中，测定细胞数量。另取部分细胞保存于单独的管中，作为阴性（未转导）对照。以1000 ×g离心5分钟，弃去上清液。
  4. 用病毒上清液重悬细胞沉淀，调整浓度为每1 mL含106个细胞，并加入20 ng/mL rhIL-2和10 μg/mL鱼精蛋白硫酸盐。将1 mL细胞悬液加入24孔板的每孔中。将对照管中的细胞用RPMI培养基按相同细胞密度及相同量的rhIL-2和鱼精蛋白硫酸盐重悬，加入同一块板中。
  5. 用塑料封口膜包裹培养板，于32 °C、无刹车条件下以2000 ×g离心90分钟。
  6. 离心结束后，移除塑料封口膜。向每孔加入1 mL含20 ng/mL rhIL-2的新鲜RPMI培养基，将培养板放回培养箱中继续培养。
  7. （可选）在第3天收集病毒上清液并重复感染步骤，可获得更高的TCR表达水平。

4. 细胞扩增与转导效率评估

  1. 每日观察转导后的T细胞。当细胞需要时，在含重组人IL-2的RPMI培养基中以1:3的比例进行传代。切勿让细胞过度生长（培养基变黄）。
  2. 在第6天或第7天，使用针对TCR的抗体和MHC四聚体对细胞进行染色，以评估TCR在T细胞表面的表达情况。以未转导的T细胞作为对照（图2c）。
  3. 转导后的T细胞已可用于后续的下游应用。

5. 典型结果

在转导前纯化T细胞亚群通常具有优势，尽管脾细胞无需纯化也可进行转导。使用商用磁珠可获得高纯度的T细胞亚群（图2a）。

为了评估T细胞上TCR的表达水平，可以使用针对TCR α链或β链的特异性抗体。通常，30%至80%的细胞可表达转导的TCR（图2b），具体比例取决于TCR基因和病毒滴度。此外，可使用针对该TCR的MHC四聚体进一步验证TCR的功能性表达（图2c）。

显示LTR、Ψ信号、肽连接子的基因表达示意图，展示DNA序列元件。
图1. T细胞受体基因构建体亚克隆至逆转录病毒载体的示例。 全长的α链和β链基因通过一种可自剪切的2A肽连接子相连8。

使用抗CD8、抗Vbeta、抗CD3抗体进行T细胞分析的流式细胞术图谱。
图2. 小鼠T细胞成功分离与转导的示例。 (a) 使用CD8a+ T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从小鼠脾细胞中分离CD8 T细胞，并用抗CD3e和抗CD8a抗体染色。分离的CD8 T细胞转导了针对人源gp100:209-2174 肽段的R6C12 TCR，随后用抗人源Vbeta 8抗体（b）和HLA-A2kb gp100四聚体（c）进行染色。

讨论

为获得最佳结果，有几个步骤至关重要。Plat-E 包装细胞系应保持在健康状态。如有必要，可在含 1 μg/mL 嘌呤霉素和 10 μg/mL 杀稻瘟菌素的 DMEM 培养基中传代数次，以防止逆转录病毒结构蛋白表达的丢失。转染当天，细胞融合度应约为 80%。细胞过少或过多均可能降低病毒滴度。可通过易被转导的细胞系检测病毒质量。由于 T 细胞受体（TCR）需要 CD3 复合物才能在细胞表面表达，我们通常使用 58α-/β- 杂交瘤细胞10（一种不表达内源性 TCR α 或 β 链但表达 CD3 复合物的细胞系）。使用 1 mL 病毒上清液转导时，杂交瘤细胞的转导效率接近 100%。最后，T 细胞必须处于激活并增殖状态，因为逆转录病毒只能感染正在活跃分裂的细胞。

本文介绍的抗原特异性T细胞制备方法存在若干局限性。首先，难以实现原代小鼠T细胞100%的转导效率，部分细胞不表达目标T细胞受体（TCR）。其次，转导的TCR α链和β链可能与内源性TCR发生错配9，这可能会降低目标TCR的表达水平。此外，错配的TCR可能引发自身免疫反应 体内11最后，转导的T细胞只能在有限的时间内使用。大约一周后，除非重新刺激，否则这些细胞会经历凋亡。然而，反复的重新刺激可能导致细胞耗竭，从而失去功能。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH，资助号：5U01CA137070）和美国癌症协会（资助号：RSG-09-070-01-LIB）、癌症研究所研究员奖（M.K.）、美国心脏协会博士前奖学金（K.M.）以及西班牙教育部和科学部奖学金（A.P.G.）资助。

我们感谢美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）的 Nicholas Restifo 博士和 Zhiya Yu 博士对本实验方案提出的宝贵建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CD8a+ T细胞分离试剂盒IIMiltenyi Biotec130-095-236
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
细胞筛Fisher Scientific08-771-2
1× PBS（不含钙和镁）Invitrogen10010-049
裂解缓冲液InvitrogenA10492-01
重组人IL2PeproTech Inc200-02
抗CD3e抗体BD 生物科学553057
抗CD28抗体BD 生物科学553294
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Plat-E 包装细胞系Cell BiolabsRV-101
OptiMEM培养基Invitrogen31985-062
10 cm 多聚赖氨酸包被培养皿BD 生物科学356469
pCL-Eco 辅助质粒Imgenex10045P
硫酸鱼精蛋白APP Pharmaceuticals22905
DMEMInvitrogen12491-023
FBSHycloneSH3008803
青霉素-链霉素液体Invitrogen15140-122
L-谷氨酰胺Invitrogen35050-061
丙酮酸钠溶液Invitrogen11360-070
非必需氨基酸溶液Invitrogen11140-050
RPMIInvitrogen12633-020
β- 巯基丙酸–乙醇Invitrogen21985-023

媒体：

DMEM 培养基（DMEM + 10% 热灭活 FBS + 青霉素/链霉素 + L-谷氨酰胺 + 丙酮酸钠 + 非必需氨基酸）

不含青霉素/链霉素的DMEM培养基（成分与DMEM培养基相同，但未添加青霉素/链霉素）。

RPMI 培养基（RPMI + 10% 热灭活 FBS + L-Glu + 非必需氨基酸 + β- 巯基乙酸–乙醇 + 青霉素/链霉素 + 丙酮酸钠

DMEM 培养基（DMEM + 10% 热灭活 FBS + 青霉素/链霉素 + L-谷氨酰胺 + 丙酮酸钠 + 非必需氨基酸）

不含青霉素/链霉素的DMEM培养基（与DMEM培养基相同，但未添加青霉素/链霉素）。

RPMI 培养基（RPMI + 10% 热灭活 FBS + L-Glu + 非必需氨基酸 + β- 巯基丙酸–乙醇 + 青霉素/链霉素 + 丙酮酸钠

不含青霉素/链霉素的DMEM培养基（成分与DMEM培养基相同，但未添加青霉素/链霉素）。

RPMI 培养基（RPMI + 10% 热灭活 FBS + L-Glu + 非必需氨基酸 + β- 巯基乙酸–乙醇 + 青霉素/链霉素 + 丙酮酸钠

RPMI 培养基（RPMI + 10% 热灭活 FBS + L-Glu + 非必需氨基酸 + β- 巯基丙酸–乙醇 + 青霉素/链霉素 + 丙酮酸钠

参考文献

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T T MHC
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