本文介绍了一种从荷瘤宿主的肿瘤引流淋巴结或其他继发性淋巴组织中高效扩增肿瘤反应性T细胞的ex vivo方案。该方案可选择性扩增肿瘤特异性T细胞，用于乳腺癌的过继性免疫治疗。
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摘要
摘要
据报道，乳腺癌患者体内存在针对其肿瘤的预先免疫反应1,2然而，此类免疫反应无法完全防止乳腺癌的发生或复发。为通过增加肿瘤反应性T细胞的频率来克服这一问题，已采用过继性免疫治疗。目前已有多种方案用于扩增肿瘤特异性T细胞，但这些方案仅限于使用肿瘤抗原。 离体 用于抗原特异性T细胞的活化。最近，共同γ链细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15和IL-21被单独或联合用于增强抗肿瘤免疫应答3然而，目前尚不清楚哪种制剂最适合用于扩增肿瘤反应性T细胞。本文介绍了一种从HER-2/neu阳性乳腺癌FVBN202转基因小鼠模型中选择性激活并扩增肿瘤反应性T细胞的实验方案，可用于乳腺癌的过继性T细胞治疗。该方案包括在无肿瘤抗原存在的条件下，使用海兔毒素-1/离子霉素（B/I）联合IL-2激活T细胞16小时。B/I激活通过分别增强蛋白激酶C活性和提高细胞内钙离子浓度，模拟T细胞活化所需的细胞内信号。4该方案可特异性激活肿瘤特异性T细胞，同时清除无关的T细胞。经B/I激活的T细胞在IL-7和IL-15中培养24小时后，再加入IL-2刺激。24小时后，T细胞经洗涤、分瓶，并在IL-7 + IL-15中继续培养4天。肿瘤特异性及抗肿瘤效应的 离体 扩增的T细胞数量被确定。
方案
1. 淋巴细胞的分离5
- 从荷瘤的 FVBN202 转基因小鼠中分离肿瘤引流淋巴结或脾脏，并在冰冻的 RPMI1640 培养基（含 10% FBS）中制备单细胞悬液。与聚苯乙烯管相比，使用 50 ml 聚丙烯圆锥管进行 B/I 活化可获得更高的 T 细胞产量。腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪用于麻醉。颈椎脱位作为安乐死的方法。
- 将细胞（106 个细胞/mL）在含 15% FBS 的完全培养基中培养，加入苔藓抑素-1（5 nM）、离子霉素（1 μM）以及 80 U/mL 的 IL-2（Peprotech），共培养 16 小时。
- 用预热的培养基（37°C）洗涤细胞三次，然后以 106 个细胞/mL 的密度在含 IL-7（10 ng/mL）和 IL-15（10 ng/mL）（Peprotech）的完全培养基中继续培养 24 小时。
- 用 IL-2（40 U/mL）刺激细胞 24 小时。
- 将细胞分瓶，并在含 IL-7 和 IL-15（10 ng/mL）的培养基中继续培养 4 天。根据需要每 2 天更换培养基并分瓶传代。
2. 通过细胞计数和流式细胞术分析确定T细胞的扩增倍数5
- 显微镜下细胞计数
- 将细胞悬液用台盼蓝进行适当稀释（1:100），并加入少量 μL 置于血细胞计数板上
- 计数9个方格，将细胞计数除以计数室数量，再乘以稀释倍数，计算总细胞数。结果表示为数字 × 104 cells/mL
- 通过流式细胞术测定扩增细胞中CD8+和CD4+ T细胞的比例
- 用抗 CD16/CD32 抗体（Biolegend）在冰上孵育细胞 20 分钟，以阻断抗体与 Fc 受体的非特异性结合，随后用含有 1% 叠氮化钠的 2 mL 冰冷 PBS 洗涤细胞两次。
- 将细胞与FITC-CD4和PE-CD8抗体在冰上孵育20分钟进行染色，随后用含有1% FBS和0.1%叠氮化钠的2 mL冰浴PBS洗涤细胞两次。
- 用1%多聚甲醛固定细胞，使用Beckman Coulter FC 500流式细胞仪上样，并采用Summit 4.3软件进行分析。
3. 确定肿瘤特异性 离体 扩增的T细胞
- 培养 离体 在完全培养基中，以10:1的比例将扩增的淋巴细胞与经照射的neu阳性MMC肿瘤细胞（15,000 rad）共培养24小时。 5
- 收集上清液并于 -80°C 直至使用。 5,6
- 使用小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒（BD Pharmingen）按照制造商说明书检测 IFN-γ。 5,6
4. 确定抗肿瘤功能的 离体 扩增的T细胞5,6
- 将T细胞与肿瘤细胞以10:1的效应细胞:靶细胞比例在6孔培养板中共同孵育48小时，每孔加入3 mL完全培养基（RPMI-1640培养基，添加100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清、谷氨酰胺和β-巯基乙醇）及20 U/mL IL-2（Peprotech），于37°C、5% CO2条件下培养。
- 按照制造商说明书（BD Pharmingen），对neu（抗c-Erb2/c-neu，克隆号4，Calbiochem）进行三色抗体染色，随后使用PE标记的抗小鼠IgG、Annexin V-FITC以及碘化丙啶（PI）染色。
- 圈选neu阳性的肿瘤细胞，并分析肿瘤细胞的存活率（Annexin V-/PI-）。
5. 乳腺癌小鼠模型
FVBN202 转基因雌性小鼠（Charles River Laboratories）可用于获取肿瘤反应性T细胞。这些小鼠在MMTV启动子的调控下过表达未激活的大鼠neu转基因，因此在4至10月龄期间会自发产生乳腺癌7。在自发性癌变发生之前，这些小鼠会出现类似于原位导管癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）的癌前乳腺增生。携带自发性肿瘤的小鼠被用作T细胞的供体。
6. 代表性结果：
使用B/I激活T细胞16小时会导致未被肿瘤致敏的初始T细胞死亡 体内在B/I选择后，肿瘤反应性T细胞在含有γ链细胞因子的培养体系中培养6天，可扩增至原来的2.8倍（图1）。CD8+和CD4+ T细胞在γ链细胞因子作用下均能实现同等程度的扩增（图2）。 离体扩增的T细胞对供体小鼠致敏的肿瘤表现出高度应答性，这通过在neu阳性小鼠乳腺癌（MMC）肿瘤细胞存在下产生IFN-γ的情况进行评估（图3）。 离体 扩增的T细胞可诱导neu阳性的MMC肿瘤细胞发生凋亡，使得肿瘤细胞的存活率在48小时内从92%下降至61%（图4）。
图1. 不同时间点在B/I激活（第1天）后淋巴细胞的扩增倍数 离体 使用γ链细胞因子进行扩增（第3、5、7天）
图 2. 使用γ链细胞因子进行7天扩增前后CD4+和CD8+ T细胞的总百分比。
图3. 利用IFN-γ ELISA检测荷瘤小鼠分离的T细胞在肿瘤刺激下，经γ链细胞因子7天扩增前后IFN-γ的产生情况
图4. 细胞毒性功能 离体 针对神经母细胞瘤阳性小鼠乳腺癌（MMC）肿瘤细胞的γ链细胞因子扩增T细胞
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讨论
通过使用B/I激活方法，可选择性扩增具有效应性抗肿瘤功能的肿瘤反应性T细胞 离体 使用γ链细胞因子IL-2、IL-7和IL-15进行扩增。IL-2是一种T细胞生长因子，可促进抗原特异性T细胞的分化与扩增；IL-7可抑制T细胞凋亡，支持其在扩增过程中的存活；IL-15则可支持记忆T细胞，而记忆T细胞在过继性T细胞治疗中对于产生长期抗肿瘤免疫应答具有重要意义。9-11改变这些细胞因子的顺序和组合可能影响扩增T细胞的分化，进而可能提高或降低其抗肿瘤效果12该方案无需鉴定肿瘤抗原。通过选择性扩增肿瘤反应性T细胞，可大量获得抗肿瘤T细胞，用于癌症患者的过继性T细胞治疗。我们此前已证实 离体 扩增的T细胞在过继性T细胞治疗后保护动物抵抗乳腺癌。
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致谢
本研究由 NIH R01 CA104757 基金（M. H. Manjili）资助。我们衷心感谢弗吉尼亚联邦大学马西癌症中心（VCU Massey Cancer Center）和弗吉尼亚癌症研究基金会（Commonwealth Foundation for Cancer Research）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| 小鼠 IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| 小鼠 IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| 人IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | 健明生物制品 | 100-106 | |
| 青霉素/链霉素 | Cellgro | 30-002-CI | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030081 | |
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 抗CD16/32抗体 | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| 抗c-ErbB2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE-抗小鼠IgG | Biolegend | 405307 | |
| 甲醛 | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| 血细胞计数板 | Hycor | 87144 | |
| 光学显微镜 | VWR 国际公司 | V200073 | |
| 小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒 | BD 生物科学 | 555138 | |
| 细胞培养瓶 | Greiner Bio-One | 658175 |
参考文献
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