氧通量测量以评估活细胞和透化细胞中的线粒体呼吸

1. 将 HEK 293T 细胞添加到高分辨率呼吸室中

1. 将线粒体呼吸培养基MiR05加入干净的Oroboros室中。通过插入塞子关闭腔室，并使用抽吸系统从塞子容器中吸出多余的介质。
2. 要通过部分体积替换将 HEK 293T 细胞添加到腔室中，请计算达到 100 万/mL 的实验细胞浓度所需的细胞储备悬液的体积。
3. 从腔室中取出塞子。
4. 使用移液器从腔室中取出与计算的细胞原液悬浮液体积相对应的 MiR05 体积。
5. 用移液器彻底重悬细胞原液悬浮液。
6. 将计算出的细胞原液悬浮液体积添加到腔室中。
   注意： 呼吸测量室应清洁并充满 MiR05，极谱氧传感器应在稳定温度下校准，并应事先在软件 DatLab 中加载底物-解偶联剂-抑制剂滴定 （SUIT） 协议。实验样品/细胞浓度可能因具体样品或细胞类型而异。 图 1 显示了 HEK 293T 细胞的高分辨率呼吸测定示例。
7. 插入塞子并确保腔室内没有气泡滞留，从而关闭腔室。
   1. 从塞子容器中吸出多余的液体。
8. 等待氧通量稳定，这通常需要大约 15 分钟。

2. 微量注射器处理

1. 准备微型注射器。
   1. 根据要滴定的化学品类型和体积选择并清洁合适的微量注射器。将微型注射器放在注射器架上。
   2. 填充注射器，注意避免出现气泡。
      注意： 如果形成气泡，请通过缓慢向上和快速向下移动柱塞数次来消除气泡。
2. 检查 SUIT 方案以了解要滴定的化学品所需的体积。
   1. 填充注射器中至少比所需体积多 1 μL。
   2. 按下柱塞，直到达到玻璃桶上所需的标记，确保针尖出现一小滴（底漆）。
   3. 在进行滴定之前，擦去化学瓶壁上的液滴。

3. 按照 SUIT 协议对化学品进行滴定

1. 滴定 SUIT 方案指示的化学物质。
   注意： 在滴定之前，通过单击协议侧边栏中的事件来打开 DatLab 事件窗口。
   1. 将针头完全插入塞子毛细管，直到玻璃桶的端接器与塞子接触。
   2. 迅速将化学品注入腔室。​
      注意： 进样后，快速、瞬时的滴定伪影可能表现为 O₂ 通量中的尖峰（图 2A）。
   3. 加入洋地黄皂苷至终浓度为 5 μg/mL。
      谨慎： 吞咽后，洋地黄素有毒。
   4. 在事件窗口中点击确定，设置相应的事件。
   5. 从塞子容器中吸出多余的液体。
   6. 等待氧通量稳定并记录至少 2 分钟。
   7. 将丙酮酸加入腔室中，达到 5 mM 的最终浓度。在事件窗口中点击确定，设置相应的事件。
      注意： 立即进行下一次滴定。
   8. 在丙酮酸后立即加入苹果酸，以达到2mM的终浓度。在事件窗口中点击确定，设置相应的事件。
   9. 从塞子容器中吸出多余的液体，等待助焊剂稳定，并记录约 2 分钟。
   10. 加入二磷酸腺苷（ADP）至终浓度为2.5mM。在事件窗口中点击确定，设置相应的事件。
   11. 从塞子容器中吸出多余的液体，等待助焊剂稳定，并记录约 2 分钟。
       注意： 添加ADP后，助焊剂可能会继续缓慢增加，最多需要20分钟才能稳定下来。
   12. 以0.5μM的增量加入羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）以达到最大通量。单击事件窗口中的“确定”以设置每次滴定后的相应事件。
       谨慎： CCCP 如果吞咽是有毒的。
       注意： 快速连续进行 CCCP 滴定（间隔约 1.5 分钟）。当后续添加没有进一步增加通量时停止滴定。通过将 * 替换为累积 CCCP 浓度来修改事件窗口中每个 CCCP 滴定的名称。
   13. 从塞子容器中吸出多余的液体并记录约 2 分钟。
   14. 加入抗霉素A至终浓度为2.5μM。
       谨慎： 如果吞咽抗霉素 A 是致命的。
       注意： 响应时间可能因样品而异。
   15. 从塞子容器中吸出多余的液体并记录约 2 分钟。
   16. 单击标有停止测量的按钮。

4. 数据分析

1. 分析数据。
   1. 在通量图的稳定和代表性部分设置标记。
      注意： 避免在迹线分析中包括滴定伪影（图2B）。
2. 从顶部菜单中选择“标记”，然后选择“标记统计信息”。选择所需的统计模式，然后单击复制到剪贴板以传输数据以进行进一步分析。

图 1： HEK 293T 细胞的高分辨率呼吸测量。痕量 O2 浓度 [μM]（蓝线）和体积特异性 O2 通量 [pmol∙s-1∙mL-1]（红线;针对仪器背景 O2 通量进行了校正;消除了滴定引起的尖峰）。SUIT-002_O2_ce-pce_D007是一个广泛的方案，包括添加细胞ce1，活细胞的常规呼吸 R 。+Dig，洋地黄汀 10 μg·mLL-1;质膜的透化（CE 到 PCE），残余的内源性呼吸 任任。+D，ADP 2.5 mM 刺激残留的内源性底物消耗。+M.1，苹果酸 0.1 mM 和 1Oct，辛酰肉碱 0.5 mM;F 通路 OXPHOS 容量，1c，细胞色素 c 10 μM;测试线粒体外膜完整性，2M2，苹果酸 2 mM，支持同步 N 通路;F（N）P.3P 和 4G，丙酮酸 5 mM 和谷氨酸 10 mM，逐渐激活为 FNP。5S，琥珀酸盐 10 mM，FNSP。6Gp，甘油磷酸盐 10 mM，FNSGpP。7U4.5，解偶联滴定至最佳CCCP浓度4.5μM;FNSGpE.8腐烂，鱼藤酮0.5μM SGpE。9Ama，抗霉素 A 2.5 μM，rox。10AsTm，抗坏血酸 2 mM 和 TMPD 0.5 mM，O2 光通量 121 pmol·sL-1·mLL-1。11Azd，叠氮化物 200 mM，化学背景 chb。 细胞浓度100万/mL，培养基MiR05，温度37°C。通过间歇性再氧合（空气，开放室，蓝色阴影）将氧气浓度保持在60μM以上。

图2： 使用 HEK 293T 细胞简化底物解偶联剂抑制剂滴定 （SUIT） 方案，以突出化学滴定的适当时间。（A）显示了滴定引起的尖峰，这些尖峰在（B）中被删除。腔室 A（洋红色线）和腔室 B（绿线）的每体积 O2 通量痕迹叠加 [pmol∙s-1∙mL-1]。添加细胞 （ce1） 并测量常规呼吸 R。+挖掘，滴定洋地黄豆素5μg·mL-1 以透化质膜（ce至pce）并测量残留的内源性呼吸 任任。1PM，加入丙酮酸 （5 mM） 和苹果酸 （2 mM） 的紧密序列以刺激 N 通路 LEAK 呼吸 NL。2D，添加ADP 2.5 mM;N 通路 OXPHOS 容量NP。3U5，以0.5μM步长快速解偶联滴定至最佳CCCP浓度;NADH 链接的 ET 容量 NE。4Ama，滴定抗霉素 A 2.5 μM 以评估残余耗氧量 rox。细胞浓度 100 万/mL，培养基 MiR05，温度 37 °C