卵巢脂肪垫移植试验:一种在小鼠模型中将细胞引入卵巢脂肪垫的体内技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 卵巢脂肪垫移植

NOTE: 在每次动物手术之间对器械进行消毒。提前准备和安排所有设备。右侧卵巢脂肪垫的背侧移植是优先的，因为这样可以避开脾脏。但是，受者可能会在两个卵巢脂肪垫中进行移植。

1. 使用同基因小鼠或严重联合免疫缺陷 （SCID/NCr） 小鼠作为原代细胞的受体。对于人类细胞，例如 HIO118 细胞，请使用 Nod/SCID/γ （NSG） 小鼠或 SCID 小鼠。
2. 通过单次腹膜内注射 2,2,2-三溴乙醇，剂量为 0.15 mL/10 g 体重麻醉受体小鼠。将动物放在动物罩中的加热垫上，并通过踏板反射丧失（脚趾捏）确认适当的麻醉。在动物麻醉期间，在眼睛上涂抹兽医药膏以防止干燥。以 4 mg/g 体重剂量皮下注射镇痛药酮洛芬，以治疗术后疼痛><。 注意:作为替代方案，使用异氟醚进行麻醉。将动物放入感应室中，将氧气流量计调节至 0.8-1.5 L/min，将异氟醚蒸发器调节至 2-3%。将麻醉的动物从腔室中取出，让它从面罩中呼吸异氟醚，并将氧气流量计设置为 0.4-0.8 L/min，将异氟醚蒸发器设置为 1.5%，然后开始手术。
3. 用 #40 剪刀剃掉手术区域;去除手术区域两倍部位的毛发，用三片聚维酮碘消毒磨砂膏准备剃光的皮肤，然后用 70% 乙醇，然后用无菌窗帘覆盖。
4. 将动物移动到位于生物安全柜中的解剖显微镜下。通过在卵巢脂肪垫正上方的背内侧位置切开一个切口，暴露出生殖道。
   关键步骤:精确的皮肤切口促进伤口愈合;步骤 1.4 建议使用手术刀。
5. 使用细钝钳，小心地将卵巢脂肪垫通过切口拉向中线，最大限度地减少对神经和主要血管的损伤><。 关键步骤:如果发生出血，请停止手术并考虑移植到不同的宿主动物。
6. 在解剖显微镜的控制下，在 28 号斜面针的帮助下，在卵巢脂肪垫上切开 2-4 毫米深的切口，在卵巢上方 3-4 毫米处><。 C基本步骤: 确保切口仅穿过脂肪垫的一半;刺穿底部会导致泄漏。在此步骤之后，要迅速并继续。
7. 对于细胞移植，在注射器（30 号针头）中加入 10-20 μL 细胞-基底膜基质混合物，然后将其注射到脂肪垫切口中。对于子宫管移植，用细镊子拿起子宫管，并将其放入保存在冰上的 10-20 μL 基底膜基质中。使用 0.1-10/20 μL XL 刻度滤器吸头（缩短 3 mm），吸取组织和基底膜基质悬液，并将其释放到脂肪垫切口中。
8. 等待 5 分钟，让基底膜基质凝固，并将生殖道放回腹膜中。用两针手术缝合线缝合肌肉，用两个小伤口夹或手术缝合线缝合皮肤。
9. 重复步骤 1.4-1.8，将 PBS - 基底膜基质混合物移植到动物的对侧脂肪垫中，该脂肪垫将用作对照><。 关键步骤:手术后，将动物放在加热垫上，因为麻醉小鼠的热量损失会很快。
10. 让动物在天然笼子中的加热垫上恢复，观察动物直到从麻醉中完全清醒。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。在完全康复之前，请勿将接受过手术的动物送回其他动物的陪伴处。
11. 手术后除了在笼子上的干粮外，还可以在笼子内放置一把预先湿的食物颗粒。在接下来的几天里，如果需要，请使用术后镇痛药，并每天检查伤口。如果发生伤口感染，请根据批准的动物方案使用抗生素。手术后 10 天伤口完全闭合时取下伤口夹。