卵巢癌细胞原位接种小鼠卵巢:建立卵巢癌小鼠模型以研究细胞腹膜播散的程序

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 细胞悬液的制备

1. 人卵巢透明细胞癌细胞系
   1. 将 ES-2 细胞维持在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和青霉素/链霉素（青霉素:100 单位/mL，链霉素:0.1 mg/mL）的 RPMI-1640 培养基中。在 37 °C 下在 5% CO₂ 加湿培养箱中培养细胞。
   2. 在 0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA 溶液（胰蛋白酶/EDTA）中收集对数生长期细胞。
      1. 首先，从细胞培养容器中取出旧培养基，然后用 PBS 洗涤细胞一次（不含 Ca²⁺/Mg²⁺，每 25 cm² 3-4 mL 的 PBS）。
      2. 接下来，每 25 cm² 添加 1 mL 胰蛋白酶/EDTA。旋转细胞培养容器，用胰蛋白酶/EDTA 覆盖细胞单层。去除并丢弃胰蛋白酶/EDTA 后，将细胞培养容器放回培养箱中 3-5 分钟或直到细胞分离。
      3. 在显微镜下检查细胞，以确保细胞从细胞培养容器表面分离并漂浮。
      4. 加入新鲜的含血清生长培养基以灭活胰蛋白酶（每 25 cm² 5 mL）并重悬细胞。将重悬的细胞转移到 15 mL 锥形管中。
      5. 以 300 x g 离心 5 分钟。在 4 °C 或室温下进行离心。小心去除上清液，并用生长培养基（每 25 cm² 5 mL）重悬细胞。
   3. 对细胞进行计数（例如，通过台盼蓝排除），然后以 2 x 10⁸ 个细胞/mL 的密度重悬于生长培养基中。将悬浮细胞置于冰上。
2. 在冰浴中解冻基于冷冻细胞外基质 （ECM） 的水凝胶等分试样。
3. 以 1:1 的比例将细胞悬液添加到基于 ECM 的水凝胶等分试样中（最终细胞浓度:1 x 10⁵ 个细胞/μL 基于 ECM 的培养基水凝胶）并充分混合。将制备好的细胞悬液放入冰浴中直至使用。

2. 使用细胞悬液进行原位接种

注意:手术不需要专用套件。手术可以在房间内独立且活动最少的实验室工作台上进行。也可以使用层流罩。必须使用无菌手术器械，不得使用剪刀切开皮肤。

1. 使用 8 周龄的雌性裸鼠 （BALB/c nu/nu） 进行这种原位接种模型。
2. 首先，用异氟醚 （2-4%） 吸入麻醉小鼠。通过验证用力捏住脚趾时没有撤退来检查麻醉深度。麻醉小鼠后，根据需要将平淡的无菌眼药膏涂抹在眼睛上以防止干燥。
3. 将麻醉的鼠标放在手术台上，腹部朝下。用酒精和碘基或洗必泰磨砂膏对手术区域进行数次消毒。
在
4. 右肋弓和股骨之间的脊柱附近垂直做一个 2 厘米的切口。在切口部位周围使用无菌手术单。用夹子固定切开的皮肤表面以保持开口。
   注意:可以使用牵开器代替夹子。
5. 接下来，在第一个切口下的壁层腹膜上做第二个切口（约 1 厘米），以打开腹腔。夹住切开的腹表面。用夹子夹住同侧卵巢和输卵管周围的脂肪组织，以从腹腔中取出卵巢。小心地将卵巢和输卵管放在纱布上。然后，将小鼠腹部朝下放在解剖显微镜下。
6. 注射前将细胞悬液放入胰岛素注射器（1/2 cc，29 G）中。小心地将制备好的细胞悬液 （1-2 μL） 注射到卵巢中。几秒钟内，将针头保留在卵巢内，以确保基于 ECM 的水凝胶凝胶化。凝胶化后，注射的肿瘤细胞留在卵巢内。
7. 小心地将卵巢放回体内。用无菌医用丝缝合第二个切口，然后用伤口夹密封皮肤。
8. 手术后，小鼠将在最初的 24 小时内给予镇痛剂（例如，美洛昔康，肌肉注射或皮下注射，0.2 mg/kg）。