将癌细胞静脉注射到鸡脉络膜尿囊膜脉管系统:建立绒毛膜尿囊膜癌模型以研究癌症侵袭和转移的程序

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 注射用癌细胞的制备

注意:转移性集落选择基于荧光癌细胞建立的表型，来自表达文库或用荧光蛋白（如绿色或红色荧光蛋白）标记的载体（参见图 1A 中的整个筛选流程）。不建议使用瞬时转染荧光蛋白或用细胞渗透性荧光染料标记的细胞，因为癌细胞增殖和染色不均匀会导致信号快速褪色。

1. 注射时培养癌细胞至 60-70% 汇合。使用较高汇合水平的癌细胞会降低其活力，导致转移集落形成效率低下。确保使用的癌细胞不含支原体，因为支原体污染可能导致鸡胚胎活力降低。
2. 用 1x PBS（pH 7.4）冲洗细胞两次。去除剩余的 PBS，然后加入 0.5% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育 2-5 分钟，直到所有细胞从培养皿表面提起。
3. 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并在室温下以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
将
4. 细胞重悬于 10 mL PBS 中，并按照步骤 1.3 再次离心细胞，以去除胰蛋白酶和其他培养基成分，如抗生素><。 注意:癌细胞悬液中存在胰蛋白酶或细胞培养成分（如抗生素）可能导致鸡胚胎活力降低。
5. 小心吸出上清液并用 1 mL 冰冷的 PBS 重悬细胞。
6. 使用血细胞计数器或任何其他可用的细胞计数设备对细胞数量进行计数。
   注意:该筛选方案要求每个转移集落由单个细胞启动。对细胞进行计数时，确保细胞完全胰蛋白酶消化并以单细胞悬液形式存在（不存在细胞团块）。
7. 对于静脉内 （IV） 注射，将细胞浓缩至 0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10^{6 个}细胞/mL。使用冰冷的 1x PBS 稀释和/或重悬细胞浓缩物。预计每 10 个胚胎大约需要 1 mL 细胞悬液。
   注意:悬浮液中所需的细胞悬液浓度主要取决于实验者的经验水平。有关更多详细信息，请参阅下一节。

2. 静脉注射癌细胞以形成转移性集落

注意:按照此方案，一天内可以注射多达一百个胚胎。分离转移集落通常需要比注射癌细胞更长的时间，因此，建议进行初始实验以估计完成所有步骤所需的时间。使用差异癌细胞荧光标记有助于减少动物数量和每次实验所需的时间。例如，对照细胞可以用 RFP（红色荧光蛋白）标记，而突变的肿瘤细胞可以用 GFP（绿色荧光蛋白）替代标记。在这种情况下，每个实验都有一个内置控件，用于校正胚胎间的变异性。

1. 如图 1B 所示组装注射装置。首先，将针头安装到注射器上，然后用一根 3-5 cm 长的管子延长注射器针头。
2. 使用细镊子（~20–60 μL 宽）折断硼硅酸盐针头的尖端。
3. 在注射器中加入癌细胞悬液 （50–200 μL），然后将硼硅酸盐针头插入管中（图 1B）。
4. 检查硼硅酸盐针头是否有细胞堵塞和气泡。将细胞作为单细胞悬液注射以确保每个转移集落由单个细胞启动至关重要。
   注意:癌细胞往往在胰蛋白酶消化后 1-2 小时内聚集在 PBS 中，因此应在注射前立即制备。如有必要，可以使用用于注射的 1 mL 注射器（不使用硼硅酸盐针头）定期重悬细胞。
5. 如果在毛细管内观察到细胞堵塞，请取出毛细管，重悬细胞，然后用新的毛细管替换。使用柱塞推出任何气泡。如果未观察到细胞堵塞或气泡，请继续执行下一步。
6. 取下盖子，将胚胎转移到立体镜下。确定要在 CAM 表面上注射的适当静脉。静脉和动脉在 CAM 组织内形成错综复杂的网络（图 1C）。静脉的特点是较亮的红色，因为它们将富含氧气的血液输送到胚胎。
   注意:对于一般胚胎作、癌细胞注射和转移集落切除，请使用配备 0.8 倍和 1.5 倍物镜和 10 倍目镜的荧光立体显微镜进行可视化。不太先进的显微镜也可以成功地用于这些程序，具体取决于用户的经验水平。读者可以联系作者以获取更详细的建议。
7. 找到理想的静脉来注射细胞，该静脉通常仅比硼硅酸盐针尖的直径略宽 （10-20%），并且位于胚胎和称重皿壁之间的中间。通常更容易在紧邻静脉分叉处的点注射。
   注意:注射到更大的静脉中可能看起来更容易，但会导致出血过多和胚胎存活率降低。
8. 将针尖压在血管壁上，并沿与血流相同的方向轻轻按压。如有必要，使用棉签（另一只手握住）帮助锚定或稳定正在注射的血管。
9. 轻轻按下注射器柱塞。当癌细胞悬浮液进入血液时，可以通过观察血管的"清除"来可视化注射成功。
10. 继续按下注射器柱塞 2-10 秒，直到将所需的悬浮液体积注射到静脉的血液中。总共需要 1-10 分钟的注射，具体取决于用户的经验水平。如果注射部位出现出血过多或透明液体积聚，请丢弃胚胎。
    注意:胚胎很容易 "过度注射"。应牢记的一般考虑因素是，转移性集落在 4-5 天的生长期后不应相互接触。理想情况下，~5-10% 的末端 CAM 静脉毛细血管在注射成功后应有细胞固定在其中（图 1D、E）。如第 1 节所述，可以使用一系列细胞浓度（0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10⁶ 个细胞/mL）。较低的浓度需要更长的注射时间，但会减少针头堵塞。较高的浓度需要更短的注射时间，但会增加针头堵塞。建议尝试几种浓度，以找到对作者来说最舒适的浓度。通常，较高的浓度 （1.0 x 10⁶ 个细胞/mL） 可缩短进样时间。
11. 从 CAM 上取下针头，然后用棉签轻轻擦拭注射部位，以去除任何血液或多余的癌细胞。
12. 用盖子盖住称重盘中的胚胎，然后将注射的鸡胚放回培养箱中。
13. 对下一个胚胎重复该过程，直到注射所有胚胎。

图 1:癌细胞注射和转移集落分离概述。（A） 概述鸡胚胎筛查平台步骤的流程图。（B） 在立体荧光显微镜载物台上设置的癌细胞注射。（C） 将癌细胞注射到 CAM 脉管系统中。（D） 注射后立即拍摄的癌细胞注射成功（可接受的癌细胞密度）的图像。（E） 显示癌细胞注射不良的图像，被视为过度注射的胚胎。注意癌细胞在毛细血管中的积聚（白色箭头）。比例尺 = 1 厘米。