通过肝动脉递送溶瘤病毒靶向肝脏肿瘤

摘要

来源：Altomonte, J. 等，经动脉给予溶瘤病毒用于大鼠原位肝细胞癌的局部区域治疗。J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了通过肝动脉注射进行溶瘤病毒的局部区域递送，作为肝细胞癌的一种治疗策略。这些病毒可在肿瘤细胞中选择性复制，诱导细胞裂解并释放肿瘤细胞相关抗原。此过程可触发免疫原性细胞死亡，从而诱导抗肿瘤免疫反应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术开始前的准备工作

1. 灭菌手术器械（即， 通过高压灭菌。
2. 将病毒稀释至适当浓度，该浓度将根据所用病毒的特异性毒性和大鼠品系的易感性而有所不同。
   注意例如，在使用水疱性口炎病毒处理雄性水牛大鼠时，我们通常注射10⁷ 在该模型中，1 毫升体积内的空斑形成单位（pfu）为最大耐受剂量。
   1. 用无菌技术将病毒预装入1 ml注射器中，并连接30 G针头，注意排除注射器和针头中的空气。
3. 在手术区域准备好所有所需材料和设备，并用乙醇喷洒消毒。取一小容器盛装无菌生理盐水溶液（0.9% 氯化钠，NaCl），用于润湿纱布拭子和棉签。

2. 大鼠的准备

1. 在开始手术程序前30分钟，按照当地动物护理与使用委员会规定，给予适当剂量的镇痛剂。例如，给予高剂量的安乃近（100-200 mg/kg）。
2. 使用吸入（异氟烷）或注射（即， 右美托咪定（0.15 mg/kg）、咪达唑仑（2 mg/kg）和芬太尼（0.005 mg/kg）混合物（又称MMF麻醉剂）。通过蒸发器给予异氟烷，浓度为1-3%，根据需要调整浓度以维持正常的呼吸和心率。
   1. 在继续操作前，通过捏压足垫并观察有无反应，确认大鼠已完全麻醉且无痛觉。
   2. 使用兽医用眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。
3. 使用小型兽用毛发剪刀从胸骨向下至生殖器上方区域进行腹部剃毛。注意贴近皮肤剃净毛发，同时避免损伤皮肤。
4. 用胶带将大鼠固定在手术台上，固定前肢和后肢；若使用吸入麻醉，则将大鼠鼻部置入合适尺寸的鼻罩中。在大鼠身下放置加热垫以维持体温。使用外科级消毒剂对腹部区域进行消毒，随后用酒精冲洗，并涂抹抗菌涂料。

3. 剖腹手术

1. 使用小型弯头手术刀（如#15），沿中线在皮肤层上做一个小的垂直切口，切口向上延伸至剑突。接着用Adson镊子轻轻提起肌肉层，用手术刀切开，再用手术剪将切口向上延伸至剑突。注意避免刺破腹腔器官，或损伤剑突两侧的小血管。
2. 将牵开器置于腹部横跨切口处，撑开肌肉和皮肤，充分暴露整个腹腔区域。
3. 用无菌生理盐水浸湿两块7.5 x 7.5 cm²的纱布，一块覆盖在手术切口上方，另一块覆盖在下方，如图1A所示。

4. 肝动脉的分离

1. 使用两根用无菌生理盐水润湿的棉签，轻轻将肠管和盲肠从腹腔中抬起，并放置在下方的纱布棉签上。将纱布折叠覆盖，以保持器官湿润并将其固定于一侧。
2. 使用两根润湿的棉签，轻轻抬起左侧肝叶（在此阶段视野中最明显的肝叶）。将肝叶向上翻起，然后使用小型弹簧剪刀剪开肝叶下方的纤维膜，使肝叶完全翻转至上方，并置于先前放置的纱布棉签之上。将纱布棉签折叠覆盖在肝叶上，以固定其位置。
3. 继续处理下一个肝叶（前尾状叶），该叶此时为视野中最靠前的肝叶。在解剖显微镜和精细镊子的辅助下，分离包绕该肝叶的薄层膜，使其松解并可自由向上翻起。将该肝叶与左侧肝叶一同置于纱布棉签下方。
4. 观察此时已可见的后尾状叶。重复步骤4.3，完全游离后尾状叶，并将其向上翻起，与先前放置的肝叶一同包裹于纱布内。
5. 在尾状叶原始位置的正下方，寻找肝总动脉，此时该动脉因明显的搏动而清晰可见且易于识别。沿动脉向解剖学右侧追踪，可见一层较厚的膜状组织遮挡了胃十二指肠动脉和肝固有动脉的视野。使用精细镊子轻轻挑起该组织并小心撕开，注意避免损伤该区域内的小血管。如有出血，使用棉签进行止血。
   1. 在膜组织被充分游离后，借助解剖显微镜可清晰观察到动脉分支。
6. 使用两把精细无创镊子，仔细游离肝总动脉、胃十二指肠动脉和肝固有动脉，使其完全脱离周围膜组织（图1B）。

5. 动脉注射前的准备

1. 将7-0 Prolene缝线穿过胃十二指肠动脉下方，并使用显微持针器在远端、分叉上方处打一个永久性结扎（正确位置参见图2）。保留缝线两端约2英寸长度，并用持针器夹住，以便牵拉使动脉绷紧，如图1C所示。
2. 在肝总动脉上放置一个小夹子，以暂时阻断血流（图1C）。
   注意：此步骤至关重要，可防止针头拔出后发生大出血。此外，阻断动脉血流有助于减缓病毒注射速度，提高转导效率。
   1. 重要提示：操作应迅速，尽量缩短血流阻断时间——在夹闭肝总动脉后5分钟内完成注射及后续的动脉结扎。
3. 如条件允许，增加解剖显微镜的放大倍数，使胃十二指肠动脉清晰聚焦并显得足够大，以便准确插入30 G针头。将注射器针头插入胃十二指肠动脉管腔，缓慢推动推杆。
   注意：针头位置正确时，注入的溶液将直接经由肝固有动脉流向肝脏。
   1. 注射过程应极其缓慢，以最大化转导效率。
4. 完成全部注射体积后，缓慢将针头从动脉中撤出。
   注意：注射部位不应出现出血。若发生出血，表明夹子位置不当，需立即调整。

6. 结束

1. 在胃十二指肠动脉下方穿过第二根7-0 Prolene缝线，并在注射部位上方结扎第二个永久性结扎线。
2. 松开肝总动脉上的夹子，确认肝固有动脉向肝脏方向的血流已恢复。
   1. 剪断结扎线的游离端。
3. 在将肠道和肝脏复位至腹腔前，确认无出血；注意将阑尾恢复至其原始位置。
4. 使用带弯针的4-0 Vicryl缝线材料分层缝合肌肉和皮肤；连续缝合时针距约为1 mm，并拉紧缝线。
   1. 缝合过程中，给予镇痛药如丁丙诺啡（0.05 mg/kg）。
5. 使大鼠从麻醉中苏醒。若使用异氟烷麻醉，大鼠通常在数分钟内恢复意识；若使用MMF作为注射麻醉剂，则需皮下注射阿替美唑（0.75 mg/kg）、氟马西尼（0.2 mg/kg）和纳洛酮（9.12 mg/kg）进行拮抗，以逆转麻醉作用，使动物在20分钟内恢复意识。在初始苏醒阶段，使用红外加热灯保持大鼠体温。
   1. 在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。
   2. 接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。

结果

图1. 肝动脉灌注手术的示意图。 一只接受剖腹手术的大鼠展示了腹壁牵开器和纱布垫的放置位置（A）。在将肝叶提起后，可见并分离出肝总动脉（标注为 CHA）和胃十二指肠动脉（标注为 GA）（B）。在结扎胃十二指肠动脉远端后，暂时夹闭肝总动脉（C）。此时，胃十二指肠动脉已准备就绪，可进行注射。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兽用剪毛器	Aesculap	GT415	小巧、无线设计的修剪器，适用于手术区域去毛
体视显微镜	Zeiss	Stemi SV6
30G 针头	Braun	4656300	30G × ½"
1 ml 注射器	Braun	9161406V	结核菌素注射器
一次性手术刀	Feather	2975#15	#15 刀片
标准外科剪刀	Fine Science Tools	14001-13	尖头/钝头，用于切开皮肤和肌肉
Adson 镊子	Fine Science Tools	1101-12	带齿，用于夹持皮肤和肌肉
Alm 牵开器	Fine Science Tools	17008-07	带钝齿，用于术中撑开腹腔
纱布拭子	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 × 7.5 cm，使用前应高压灭菌
棉签拭子	Lohmann & Rauscher	11970	无菌
细尖镊子	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm，弯头尖端，用于解剖肝动脉
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	用于精细切割
微型持针器	Fine Science Tools	12076-12	用于结扎胃十二指肠动脉
持针器	Fine Science Tools	12005-15	碳化钨钳口
7-0 Prolene 缝线	Ethicon	8648H	带弯针的聚丙烯缝线，用于结扎胃十二指肠动脉
4-0 Vicryl 缝线	Ethicon	V3040H	附带弯针
红外保温灯	Beurer	IL11	用于术后维持体温