Generating Dorsal Root Ganglion Explant and Dissociated Cell Culture

doi:10.3791/31095

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Research Article

产生背根神经节外植体和解离的细胞培养物

July 8, 2025

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Abstract

来源:Fornaro， M. et al.，成年小鼠 DRG 外植体和解离细胞模型，以研究神经可塑性和对环境损伤（包括病毒感染）的反应。J. Vis. Exp. （2018 年）。

该视频演示了一种使用分离的小鼠 DRG 组织开发背根神经节或 DRG 外植体培养和 DRG 解离细胞模型的方法。这些模型有助于研究受控环境中神经元-胶质细胞相互作用的各种机制。

Protocol

1. 成年小鼠 DRG 的外植体培养

将收集的 DRG 放入含有 3 mL 冰冷无血清培养基（SFM）的 35 mm 培养皿中。
将每个单独的 DRG 转移到干燥的玻璃培养皿中，并在手术显微镜下，使用刀片清洁和修剪掉仍附着在 DRG 上的多余纤维和结缔组织。DRG 很容易识别为沿白色脊神经/神经根的凸起透明结构。DRG 周围经常有血管。
将清洁后的 DRG 放入装有冰冷 SFM 培养基的新培养皿中。
在冰冷的 SFM （1:1）中稀释凝胶状蛋白质混合物（参见材料表）。
将 DRG 离体接种在预涂有 10/20 μL 凝胶状蛋白质混合物的 12 孔板中，并将它们置于 37 °C 和 5% CO 2 的培养箱中 30-60 分钟。
向培养系统中轻轻添加 1.5-2 mL SFM 以覆盖整个外植体，并将外植体保持在培养条件（37 °C 和 5% CO2）
注意:这是一个关键步骤，因为 DRG 仅通过聚合的凝胶状蛋白质混合物锚定在玻璃培养皿上。聚合时间和移液技能对于避免漂浮至关重要。
每 72 小时更换一次生长 DRG 的培养基，并根据需要让 DRG 生长。

2. 从 DRG 中分离单细胞神经元

将所有收集的 DRG 放入装有 1.2 mL含有 1.25 mg/mL 胶原酶 IV 的 F12 培养基的 1.5 mL 无菌管中，并在 37 °C 和 5% CO 2 下孵育 45 分钟。第一次孵育后，再重复此步骤 45 分钟。
原酶 IV 处理后，在 37 °C 和 5% CO 2 下，立即用 2 mL 含有胰蛋白酶（0.025%）的 F12 培养基处理外植体 30 分钟。
与 2 mL 含有胎牛血清（FBS;33%）的 F12 培养基在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 15 分钟。
用 2 mL F12 培养基洗涤外植体 3 次，然后用玻璃移液管机械解离它们，直到培养基变得浑浊。
注意:该程序涉及从动物身上收集干净/修剪的 DRG，如上一节所述。对外植体进行机械解离时，要轻柔，不要用力过猛，因为这会导致溢出和工作材料的损失。
通过 0.22 μm 过滤器过滤解离的细胞培养物，以去除任何杂质和多余的结缔组织。将过滤后的细胞裂解物以（2,500 x g）离心 2 分钟。
去除上清液，将细胞沉淀重悬于 500 μL 神经基础培养基中，该培养基含有神经元培养补充剂（1x）、抗生素混合物（1x）、L-谷氨酸（0.5 mM）和神经生长因子（5 μg/mL）（参见材料表）。
将解离的细胞以首选的细胞密度接种在层粘连蛋白包被的盖玻片（50 μg/mL;参见材料表）上。使用细胞计数仪测定细胞密度。
注意:我们以 25,000 个细胞/盖玻片的密度接种细胞。该技术允许神经元和神经胶质卫星细胞解离。与假单极神经元共培养的神经胶质成分在神经元存活中起关键作用。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 成年小鼠 NIH/瑞士 Harlan 实验室 35mm 培养皿细胞治疗 229635 基质胶 ECM 西格玛-奥德里奇 E1270 系列凝胶状蛋白质混合物 F12 媒体吉布科编号 11765-054 *部分无血清培养基胶原酶 IV 西格玛-奥德里奇编号 C5138 胰蛋白酶西格玛-奥德里奇 25200-056 胎牛血清（FBS）西格玛-奥德里奇 F6178 0.22um 过滤器 BD 猎鹰 352350 Neurobasal 培养基吉布科编号 10888-022 B27 补充剂吉布科编号 17504-044 神经元培养添加剂 PSN 抗生素吉布科编号 15640-055 *部分无血清培养基
抗生素混合物 L-谷氨酸西格玛-奥德里奇 G7513 系列 *部分无血清培养基 NGF 系列 Alomone 实验室 N-100型神经生长因子层粘连蛋白包被的盖玻片中性体外 GG-14-层粘连蛋白 ONPG 订阅刺 34055 X-gal Invitrogen 公司 15520034 BSA 西格玛-奥德里奇编号 A2153-100G *部分无血清培养基生物元吉布科编号:21010-046 *部分无血清培养基葡萄糖西格玛-奥德里奇 G7021-1公斤 *部分无血清培养基 KIT（胰岛素-转铁蛋白-硒-A）吉布科 51300-044 *部分无血清培养基维生素 C-C 西格玛-奥德里奇编号 A4403 *部分无血清培养基腐胺西格玛-奥德里奇 P7505 *部分无血清培养基 PBS 系列吉布科编号 10010-031 海卫一 X 西格玛-奥德里奇 T9284-500毫升

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