小鼠海马体中 θ 振荡的体外记录

所有涉及动物样本的程序均已由相应的动物伦理审查委员会审查和批准。                                                                                     

1. 急性海马体外准备

注意:分离完整的海马制剂涉及三个主要步骤:（1） 准备溶液和设备，（2） 解剖海马体和 （3） 建立产生内在 θ 振荡所需的快速灌注速率系统。在该协议中，及时执行程序 - 从解剖到记录 - 尤为重要，因为孤立的海马体构成了如此密集但微妙的准备，以至于在体外维持结构的功能连接需要非常小心。事先准备好一切，确保尽早获得足够的灌注水平，以最大限度地减少细胞损伤并维持生理功能。

1. 基于蔗糖的人工脑脊液 （aCSF） 溶液
   1. 制备 1X 蔗糖原液，用于解剖和解剖后孵育。将表 1 中列出的所有组分（除 CaCl₂ 外）混合到 1 L 去离子水中，并在 4 °C 下储存长达 2 周。
2. 标准 aCSF 解决方案
   1. 准备标准 aCSF 用于在电生理记录期间分离的海马体的高流速灌注。要制备浓缩的 （5X） 原液 aCSF，请将表 2 中列出的所有组分（CaCl₂ 除外）溶解在 2 L 去离子水中，并储存在 4 °C 下。
3. 准备设备
   1. 在开始解剖之前，用装满冰的塑料托盘 （30 x 20 x 5 cm）、碳素连接的管线和三个玻璃培养皿 （10 x 2 cm） 设置工作台区域（见图 1）。
   2. 将 300 mL 蔗糖溶液（1X 原液）加入 500 mL 烧杯中，加入碳水化合物（95% O₂、5% CO₂）鼓泡，并加入 Ca₂+ [1.2 mM]。
   3. 将 60 mL 这种蔗糖溶液转移到玻璃培养皿中，并在室温下放置。将剩余部分放入 4 °C 冰箱中 10 - 15 分钟。
   4. 在整个解剖过程中，用碳水化合物使冰冷的蔗糖溶液鼓泡。
   5. 用蔗糖溶液 （4 °C） 填充第二个培养皿（冷藏室）并将其保存在冰上。
   6. 将 30 mL 冰冷的蔗糖溶液加入 50 mL 烧杯中。

2. 全海马解剖

注意:解剖离体海马体的方法与最初开发和描述的方法基本相同，但在灌注速率和记录技术方面有额外的细节和变化。

1. 脑解剖
   用
   1. 浸泡有 1 mL 异氟醚 （100%） 的小纸巾在通风橱下麻醉小鼠，将其添加到笼中。
   2. 将麻醉的小鼠斩首，并将头部快速浸入冰冷的蔗糖溶液（50 mL 烧杯，~ 5 秒）中。转移到纸巾上。
   3. 使用手术刀做一个内侧皮肤切口（从尾部到嘴部），并推动两侧的皮肤以露出颅骨。
   4. 用小剪刀切开头骨，用抹刀快速提取大脑，并将其放入装有冰冷蔗糖溶液的培养皿中。让大脑冷却 1-2 分钟。
   5. 当大脑恢复时，将 2 - 3 mL 蔗糖溶液添加到冰上覆盖着晶状体纸的培养皿（解剖）上。
2. 隔离海马体
   1. 将大脑以直立姿势放在解剖盘上。
   2. 用剃须刀片去除小脑和额叶皮层。沿中矢状面将大脑切成两半，然后将两个孤立的半球放回保持室。再等待 1 - 2 分钟进行恢复。
   3. 将单个半切开的大脑直立放在解剖皿上。
   4. 旋转培养皿，直到中矢状结构面向观察者，并且间隔复合体的嵌入轮廓可见为丘脑前方的一层薄梨形组织。
   5. 用微型刮刀稳住半切开的大脑，并将聚四氟乙烯 （PTFE） 涂层刮刀的小端紧跟在隔膜区域后面（尾部到）放置。
   6. 将涂有涂层的刮刀插入隔膜下方，然后向下移动尖端，直到到达解剖皿。切断连接尾部隔膜区域的纤维。沿隔膜前缘重复相同的作，并切断连接到大脑额叶的纤维。
   7. 用刮刀轻轻地将海马体上方的皮层内部保持在直立位置，使用微型刮刀小心地拉下丘脑、下丘脑和剩余的脑干核。然后，用刮刀切下并去除拉出的组织。
   8. 将孤立的半球侧翻，确定海马体的轮廓。
   9. 将涂层刮刀插入海马背侧喙端下方的侧脑室中。
   10. 将刮刀与半切开大脑的中矢状面水平对齐，然后将其滑过脑室壁的光滑轮廓，直到尖端从尾部出现。
   11. 将刮刀放在海马体下方，沿着海马体与上覆皮层连接的内层轻轻按压到连接纤维上。将微型刮刀涂在该层的外侧，然后靠在涂有涂层的刮刀上滑动，以切开连接的纤维。
   12. 要完成提取，请旋转解剖皿并将涂层刮刀插入腹侧海马体下方。用刮刀轻轻握住皮质皱襞的内侧，然后用微刮刀的切片动作切开内嗅连接><。 注意:通过将涂有涂层的刮刀放在整个海马体下方，并拉出下方剩余的脑组织，可以去除整个鼻中隔海马复合体。
   13. 分离完成后，将海马体放在培养皿上，并加入一滴冰冷的蔗糖溶液以保持凉爽。小心修剪掉任何残留的皮质和纤维，并通过轻轻地将剃须刀片穿过穹窿将海马体与隔膜分开。
       注意:如果要从锥体细胞进行膜片钳记录，则可以以 45° 角横向切割分离的海马体，以暴露 Cornu Ammonis （CA）1 的锥体层（"角度切割"制备），而不会影响海马体其余部分的局部网络电路。
   14. 将制剂转移到室温蔗糖溶液中，让它恢复 15 - 30 分钟，然后再转移到记录室。

3. 设置快速灌注以记录分离的海马

1. 设置重力进料灌注系统，以 20 - 25 mL/min 的速度连续高速流入含氧 aCSF。
   1. 提前准备 aCSF （1X） 培养瓶，并在实验开始前至少 15 分钟将其浸入温浴 （~30 °C） 中。打开在线溶液加热器系统 （30 °C）。
   2. 在整个实验过程中，使用连接到碳化罐的水族箱起泡器和管道管路对 aCSF 充氧，并在灌注开始前添加 CaCl₂ [2 mM]。
   3. 停止 aCSF 流并使用玻璃移液管的宽端将海马体转移到记录室。让蔗糖饱和制剂沉入底部并沉淀。
   4. 将制备物放在记录室的中心（与入口-出口轴线对齐），CA1 和 SUB 的光滑表面位于顶部。
   在
   5. 间隔和颞端用小重量稳定海马体，并重新启动 aCSF 流动。

4. 离体海马体的电生理学

1. 体外海马 θ 振荡的细胞外记录
   1. 为了对体外分离的海马体的局部场电位 （LFP） 或单单位活性进行细胞外监测，请使用装有 aCSF 的玻璃微量移液器 （1 - 3 MΩ）。使用增益为 x1000 的膜片钳放大器、0.1 - 500 Hz 的在线带通滤波和 5-20 kHz 的采样率记录低噪声交流耦合场电位信号><。 注意:该方案中使用的定制显微镜配备了低 （2.5X） 和高放大倍率 （40X） 物镜，用于海马体的低放大倍率视图，以及用于单细胞识别的红外视频显微镜和落射荧光。该系统的组件包括正置荧光显微镜、荧光滤光片立方体、模拟摄像机和带成像软件的数字图像采集卡、舞台上定制灌注室（图 2A，插图 i）以及用于神经元记录和光纤放置的高精度显微纵器。
   2. 使用安装在显微镜上并连接到计算机显示器的相机在低倍率 （2.5X） 下检查海马体准备工作，并快速检查外表面是否有底切或损坏。当透射光穿过海马体时，沿 CA1 光滑表面的肺泡纤维的对角线排列应该是可见的（图 2A，插图 ii）。
   3. 使用低放大倍率宽视场物镜查看离体海马体和 LFP 电极在特定记录位置的位置><。 注意:图 2A 说明了将多个电极放置在不同记录位置的离体海马制备物的布局。
   4. 将 LFP 电极放入浴槽中，直到它接触到 CA1 区域的表面（牙槽）。
      注意:这通常会在 AC 耦合记录中产生快速瞬变，类似于电极与记录介质接触时发生的情况。在此步骤之后，音频监视器可用于收听 LFP 通道信号。
      注意:通常，活动的早期迹象仅在 10 - 15 分钟后出现，因此重要的是不要快速进入准备阶段。如果在此期间之后，表面 LFP 电极仍然没有获得活性，请进一步向下推进穿过层口并定期暂停，以查看在接近主细胞层时是否出现任何形式的活动。如果再过 5 - 10 分钟后未检测到任何内容，请小心地缩回电极并将其沿同一区域放置在其他位置。
   5. 将 LFP 电极推进穿过金字塔层。观察到细胞外加标活性最初随着检测到单个神经元（主要是锥体和抑制篮状细胞）的单单位放电而增加。进一步降低电极，并注意当尖端穿过放射线时，尖峰再次开始消失。观察一下，当记录位置通过辐射度降低时，θ 频率范围 （4 - 12 Hz） 中清晰可见的网络振荡变得明显并达到最大振幅 （~100 - 300 μV）。
2. 跨单个区域的 Theta 振荡
   1. 为了测试跨 CA1 区域的自发 θ 振荡的空间特性，将参考 LFP 电极的尖端置于内侧 CA1 部位（内侧沿纵向隔颞轴内侧）并将其降低到放射中，如前所述。
   2. 将第二个 LFP 电极放入 CA1 位点（距第一个 LFP 200 - 800 μm 隔膜或颞部），并观察 CA1 θ 振荡可以在相对较长的距离内同步。
3. 跨层的 Theta 振荡
   1. 为了测试跨海马层的 θ 振荡的特性，请在 CA1 放射位点留下参考 LFP 电极。从孔层上方开始，将第二个电极降低到锥体细胞层中并穿过放射体。观察 LFP 信号在金字塔层上的逐渐反转><（相对相位反转）。 注意:有关这些类型活动的代表性示例，请参见图 2B。之前已经发表了说明离体海马体相位反转部位的层/深剖面和电流源密度 （CSD） 分析的示例。

表 1.

表 2.

图 1:分离完整海马制备的解剖程序。

（a） 解剖设置的一般视图。右上:碳化冰冷的蔗糖溶液瓶 （1）;左下:装满冰的塑料托盘 （2），里面装着覆盖有镜头纸 （3） 的解剖皿;含有蔗糖溶液的冷藏室 （4）;和一套手术工具 （5）。（b） 在解剖皿上半切前小鼠大脑的视图。（c） 在冷藏室中恢复半切脑和左脑半球的放大视图（插图），然后将涂层刮刀的小端插入隔膜下。（d） 将涂层刮刀放置在离体海马体下，沿 CA1/SUB 区域，从下方拉出剩余的脑组织。

图 2:在水下记录室中记录来自完整海马制剂的体外 Theta 振荡的设置配置。

（a） 孤立的海马体以海马区域的布局和放置在四个不同记录位点的多个电极显示在隔间颌骨分布（用白色星号表示）。在上面显示的记录室平台（插图 i）的视图中，快速灌注流的入口和出口由数字 （1， 2） 表示。在下图所示的海马体放大图像中（插图 ii），单个电极放置在颞中 CA1 中，肺泡的纤维很容易看到，沿对角线朝向颞下部。S:隔膜，T:颞叶，f/fx:穹窿。（b） CA1 层组织的示意图，同时从层 oriens （灰色） 和 radiatum 层 （黑色） 记录了代表性 LFP 迹线。请注意两层之间信号的倒置相位。Alv: 肺泡层， PR: 锥体层， SR: 放射层。SLM: 层状分子。（c） LFP 曲线示例，显示了从未滤波信号的 CA1/SUB 区域（20 秒片段）和 2 秒扩展片段（下图）记录的自发 θ 振荡;对 θ 频率 （0.5 - 12 Hz） 进行带通滤波;慢速伽马 （25 - 55 Hz）;和快速 Gamma （125 - 250 Hz）。