在成年果蝇中诱导穿透性创伤性脑损伤

1. 穿透性创伤性脑损伤 （PTBI;图 1）

1. 对新关闭的 F1 苍蝇进行排序。选择羽化后 6 小时内的年轻雄性。将这些雄性苍蝇放入装有食物的干净小瓶中，每瓶 40 只或更少的苍蝇。
   注： 这在上午中旬最容易完成，方法是在CO₂ 垫上麻醉苍蝇，并识别出肠道中仍有胎粪（通过腹壁可见为深绿色斑点）的成年雄性。
2. 将 ~100 个针放入装有 70% 乙醇的 1.5 mL 微量离心管中，对 Minutien 针（参见 材料表}}）消毒至少 5 分钟。
3. 喷洒 70% 乙醇对 CO₂ 垫和画笔进行消毒，然后用干净的无绒纸巾擦干。工具清洁干燥后，将 40 个或更少的分类 F1 雄性转移回干净的垫子上。
4. 在飞行垫上将 F1 雄性分成 2 组。一组将作为对照，未受伤的果蝇。第二个实验组将接受 PTBI。
5. 使用镊子，从微量离心管中拉出 4-5 个新的 Minutien 针，并将它们放在 CO₂ 垫的边缘附近。在解剖镜下，选择一个带有尖锐尖端的直 Minutien 别针。
   注意： 在实验中使用单个 Minutien 引脚将减少可变性。重复使用锋利的图钉。将损坏或钝的针放入单独的 1.5 mL 微量离心管中，其中含有 70% 乙醇，以便安全处置。
6. 如果处理来自标准十字架的苍蝇，请打开体视显微镜发光二极管 （LED） 灯，该灯配备适当的绿色荧光蛋白 （GFP） 激发和发射滤光片。这允许 440-460 nM 的激发，并允许 500-560 nM 的可视化。
   注： 使用这种灯和滤光片套装后，蘑菇体的细胞体会通过头部角质层发出绿色荧光（图 1C）。对于永久双胞胎果蝇或其他基因型的果蝇，可以使用立体显微镜的标准白光照明器来可视化头部角质层上的标志，以瞄准蘑菇体的损伤（图 1C）。
7. 使用镊子用一只手拿起并握住选定的 Minutien 别针（对于惯用右手的人来说，这通常是右手），另一只手（通常是左手）握住画笔。从实验组中选择一只苍蝇，并放置苍蝇，以便您拥有头囊的背视图，苍蝇的头部向右。将刷子放在背胸的前部，轻轻向下推以稳定苍蝇。
8. 将 Minutien 针的尖端对准头部右侧的蘑菇体细胞体，并穿透头部胶囊。如果使用标志，则瞄准眼球和眼睛背缘之间的头部背侧角质层（图 1）。
9. 完成受伤后，用画笔轻轻将头部从 Minutien 销钉上推开。
10. 如果使用大脑进行 RNA-Seq 或 qRT-PCR，请在头部左侧造成第二次伤害。
11. 重复步骤 2.8-2.10 以伤害实验组中的所有果蝇。
12. 一旦所有果蝇都受伤，将对照和受伤的果蝇放入装有食物的单独小瓶中。当果蝇从麻醉中恢复和随后的老化过程中，将小瓶水平放置（即侧放），以防止果蝇被食物夹住。
13. 将标准交叉蝇置于 25 °C 下，永久双胞胎蝇在 30 °C 下老化。
14. 对于龄超过 24 小时的果蝇，每 1-2 天将它们放在干净的食物上。

图 1：成年果蝇中枢脑的穿透性创伤性脑损伤 （PTBI）。（A） 成年苍蝇头的外部示意图。这是正面视图。因此，动物的右侧位于观看者的左侧。（B） 成年果蝇头部的内部示意图，受伤轨迹以灰色表示。这是后视图。因此，在这张图片和后续的图中，大脑的右侧是右侧的。中枢脑 PTBI 影响多个大脑结构，包括蘑菇体（绿色）和大脑外的组织，包括脂肪体（蓝色）和血细胞（红色）。CB = 中枢脑区。OL= 视叶区域。（C） 活体成虫头部的背视图，其中蘑菇体（箭头）用绿色荧光蛋白 （GFP） 标记。这是"标准基因型"（详见正文）。PTBI 方案可重复地导致蘑菇体受伤。