诱导成年个体穿透性创伤性脑损伤 果蝇 果蝇

摘要

来源：Crocker, K. L.，等。果蝇中枢脑中成年神经发生的刺激与分析。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在果蝇大脑中诱导穿透性创伤性脑损伤的方法。选取新羽化的果蝇，进行麻醉后置于配备荧光装置的体视显微镜下定位。识别表达GFP的蘑菇体，并插入微型针以造成损伤。随后让果蝇恢复，以供后续研究使用。

方案

1. 穿透性创伤性脑损伤（PTBI；图1）

1. 筛选新羽化的F1代果蝇。选择羽化后6小时内年轻的雄性个体，将其放入装有食物的洁净小瓶中，每瓶不超过40只果蝇。
   注意： 这最容易在上午进行，通过使用 CO₂ 对果蝇进行麻醉来实现₂ 用垫子垫住并识别肠道内仍含有胎粪（透过腹壁可见为深绿色斑点）的成年雄性个体。
2. 消毒微型针（参见 材料表) 将约100个针头放入盛有70%乙醇的1.5 mL微量离心管中，浸泡至少5分钟。
3. 消毒 CO₂ 用70%乙醇喷洒垫板和画笔进行消毒，并用干净无绒的纸巾擦干。待工具清洁干燥后，将40只或更少的已分选F1代雄性个体转移回清洁的垫板上。
4. 在果蝇操作板上将F1代雄性分为两组。其中一组作为对照组，即未受伤的果蝇；另一组为实验组，将接受PTBI处理。
5. 使用镊子从微量离心管中取出4-5枚新的Minutien针，并将其放置在CO的边缘附近₂ 垫板。在解剖显微镜下，选择一根尖端锋利的直头微型针。
   注意： 使用单个微型钉进行实验可减少变异性。重复使用锋利的微型钉。将损坏或变钝的微型钉放入单独的1.5 mL离心管中，管内盛有70%乙醇，以安全处理。
6. 若使用标准杂交的果蝇，打开配....

结果

图1：成年黑腹果蝇中枢脑的穿透性创伤性脑损伤（PTBI）。（A）成年果蝇头部外部结构示意图。此为正面视图，因此动物的右侧位于观察者的左侧。（B）成年黑腹果蝇头部内部结构示意图，灰色线条表示损伤路径。此为后视图。因此，在本图及后续图中，脑的右侧位于右侧。中枢脑PTBI会影响多个脑结构，包括蘑菇体（绿色）以及脑外组织，如脂肪体（蓝色）和血细胞（红色）。CB = 中枢脑区域。OL = 视叶区域。（C）活体成年果蝇头部的背侧视图，其中蘑菇体（箭头）被绿色荧光蛋白（GFP）标记。此为“标准基因型”（详见正文）。PTBI实验方案可重复地造成蘑菇体损伤。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二氧化碳气泡器	Genesee Scientific	59-181	用于麻醉
二氧化碳垫	Genesee Scientific	59-114	用于麻醉
棉塞	Genesee Scientific	51-101	用于EdU标记
果蝇培养管	Genesee Scientific	32-109	用于EdU标记
甲醛	Sigma Aldrich	252549	用于固定成年果蝇脑组织，添加至PEM中
显微操作针（Minutien针）	Fine Science Tools	26002-10	用于脑损伤实验；针尖直径12.5 μm，针杆直径100 μm
NIGHTSEA体视显微镜荧光适配器	Electron Microscopy Sciences	SFA-GR	解剖显微镜的荧光装置
磷酸盐缓冲液（PBS）	组分来自不同公司		用于脑组织解剖，以及配制免疫组织化学的封闭和洗涤溶液；含100 mM K2HPO4、140 mM NaCl，pH 7.0
含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PT）	组分来自不同公司		用于洗涤解剖后的脑组织
两把#5号钟表匠镊子	Fine Science Tools	11255-20	用于夹持Minutien针及进行脑组织解剖