用于干细胞培养应用的3D纤维蛋白支架的制备

摘要

本研究详细阐述了用于培养和诱导多能干细胞分化的三维纤维蛋白支架的制备方法。此类支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞行为的影响，也可进行改造以包含药物递送系统。

摘要

干细胞存在于天然的三维微环境中 体内，通常被称为干细胞微环境 ¹在三维生物材料支架中培养干细胞能够精确模拟这些微环境，相较于使用聚苯乙烯的传统二维培养方法具有优势，同时也为组织工程中构建替代性组织提供了一种有效途径 ²尽管二维组织培养用聚苯乙烯已用于大多数细胞培养实验，三维生物材料支架能更接近地模拟体内所存在的微环境 体内 通过在环境中更精确地建立细胞极性，并具有与软组织相似的生化和机械特性。³ 已研究了多种天然来源和合成的生物材料支架作为支持干细胞生长的三维环境。尽管合成支架可被制备成具有更广泛的机械和化学特性，且通常具备更高的可重复性，但天然生物材料通常由细胞外基质中存在的蛋白质和多糖组成，因此含有细胞黏附的结合位点，能更有效地支持细胞培养。纤维蛋白支架由血浆中提取的纤维蛋白原聚合而成，在多种组织工程应用中已被广泛研究 体外 和 体内 ⁴此类支架可通过多种方法进行修饰，以整合可控释放系统，用于递送治疗因子 ⁵先前的研究表明，此类支架可用于成功培养胚胎干细胞，且基于支架的培养系统可用于筛选各种生长因子对支架内接种的干细胞分化的影响。 ^6,7.

本实验方案详细描述了利用凝血酶的酶活性从纤维蛋白原溶液中聚合形成纤维蛋白支架的过程。整个过程需要2天完成，包括对纤维蛋白原溶液进行过夜透析，以去除抑制聚合的柠檬酸盐。这些详细方法所采用的纤维蛋白原浓度已被确定为适用于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞培养的最佳条件。其他研究团队已进一步探索了纤维蛋白支架在多种细胞类型和应用中的使用，充分展示了该方法的广泛适用性^8-12。

方案

开始实验方案前的注意事项：纤维蛋白原是一种来源于血液的蛋白质，因此在操作前必须完成适当的安全培训。本实验方案需要两天时间完成，因此应合理安排干细胞培养的时间，以确保其在接种时处于合适状态。关于所需纤维蛋白原的用量计算，将110–130 mg纤维蛋白原溶解于3 mL三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS, pH 7.4）中，配制成三份35 mm培养皿中的溶液，足以制备一块24孔板，每孔含有400 μL纤维蛋白支架。

1. 第一天：制备纤维蛋白原溶液并进行过夜透析

1. 将冻干纤维蛋白原从冰箱中取出，静置20分钟，使其恢复至室温。
2. 向每个35 mm培养皿中加入3 mL Tris缓冲盐水（TBS）。每板纤维蛋白原可获得2至3 mL浓度为12至20 mg/mL的纤维蛋白原溶液，所需纤维蛋白原的总量可根据上述估算值进行计算。
3. 称取约100–130 mg纤维蛋白原（Fg），撒入各培养皿中的TBS液面上。静置5分钟，使纤维蛋白原开始溶解。用培养皿盖盖好。
4. 将培养皿在37°C条件下孵育2小时，使纤维蛋白原充分溶解于TBS溶液中。
5. 用TBS润湿透析管（截留分子量7000），将透析管底端折叠并用透析夹夹紧封口。
6. 用移液器将各培养皿中的纤维蛋白原溶液转移至透析管中，将顶端折叠后用透析夹夹紧封口。
7. 将装有纤维蛋白原溶液的透析管放入盛有4升TBS的容器中，使用设置为低速（100 rpm）的磁力搅拌器搅拌溶液。
8. 在磁力搅拌器上透析过夜，至少12小时。在此期间无需更换TBS溶液。

2. 第2天：纤维蛋白支架的聚合及将干细胞接种至支架中

该过程所述所有步骤均应在无菌细胞培养罩内进行，因为这些支架将接种干细胞培养物。

1. 将纤维蛋白原溶液从透析管中取出，放入适当大小的锥形管中（15 mL 或 50 mL）。
2. 使用 5.0 μm 注射式滤器过滤纤维蛋白原溶液，以去除溶液中的大颗粒杂质。根据溶液的体积，可能需要使用多个滤器才能完成全部溶液的处理。
3. 使用 0.22 μm 滤器对纤维蛋白原溶液进行无菌过滤，收集至 50 mL 锥形管中。使用合适规格的移液器测定过滤后纤维蛋白原溶液的体积，以便后续计算时使用。根据溶液的体积，可能需要使用多个滤器处理全部溶液。
4. 使用分光光度计测定纤维蛋白原溶液在 280 nm 处的吸光度。通常需要将样品稀释 50 倍，以获得低于 1 的吸光度值。
5. 使用以下公式计算纤维蛋白原溶液中蛋白质的浓度：[纤维蛋白原浓度（mg/mL）] = (A₂₈₀ × 稀释倍数) ÷ 1.55，其中 1.55 为人纤维蛋白原在 A₂₈₀ 处的消光系数¹³。随后根据初始体积，计算所需 TBS 体积，将溶液稀释至纤维蛋白原浓度为 11.1 mg/mL。纤维蛋白支架在聚合后的最终蛋白浓度将为 10 mg/mL。
6. 取无菌凝血酶和氯化钙溶液。首先，在 24 孔板第一行每孔的右侧加入 15 μL 凝血酶溶液（浓度：40 U/mL，支架中最终浓度为 2 U/mL）。然后，在每孔左侧加入 15 μL 50 mM 氯化钙溶液。最后，向每孔中加入 270 μL 纤维蛋白原溶液。先将板左右晃动，再前后晃动，以确保溶液充分混合。
7. 在室温下静置 5 分钟，使第一行中的混合物发生聚合。随着聚合进行，支架会逐渐变得不透明。
8. 重复步骤 2.6 和 2.7，直至完成所需数量的纤维蛋白支架的聚合。
9. 最后一次孵育 5 分钟后，将板放入 37°C 培养箱中，使支架完全聚合。
10. 一小时孵育结束后，下一步是将拟胚体接种至支架中。使用 20 μL 移液器挑选单个拟胚体，置于纤维蛋白支架中央。在显微镜下检查，确保每个孔中仅含有一个拟胚体。
11. 在每个拟胚体上方加入 5 μL 凝血酶溶液（浓度：40 U/mL）和 5 μL 50 mM 氯化钙溶液，随后每孔加入 90 μL 纤维蛋白原溶液。溶液应形成一个包裹拟胚体的液滴。
12. 将板重新放入 37°C 培养箱中继续孵育 1 小时，以确保完全聚合。
13. 孵育结束后，向每孔中加入 1 mL 适当的细胞培养基，并将板放回 37°C 培养箱中。

3. 代表性结果

图1展示了含有接种了类胚体的三维纤维蛋白支架培养系统的单个孔的侧视示意图。图2A展示了小鼠诱导性多能干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的代表性图像。随后，这些细胞通过为期8天的视黄酸处理方案诱导形成类胚体，即含有神经前体细胞的细胞聚集体（图2B），该方法此前已有描述¹⁴；而图3展示了诱导性多能干细胞来源的类胚体在三维纤维蛋白支架内培养3天后的形态。此前使用小鼠胚胎干细胞也获得了类似结果⁷。此外，该方法已被用于在三维纤维蛋白支架内培养通过另一种涉及视黄酸和嘌呤霉素的方案所产生的诱导性多能干细胞来源的类胚体¹⁵，表明该培养系统具有良好的适用性。

图 1. 示意图显示了一个含有三维纤维蛋白支架并接种了类胚胎体的单个孔的侧视图。

图 2. 小鼠诱导性多能干细胞（iPS 细胞）的培养与分化。为了将这些细胞分化为神经表型，将 iPS 细胞在悬浮培养中培养，形成称为拟胚体（EB）的细胞聚集体。随后用视黄酸处理这些拟胚体以诱导神经分化，该方案此前已被用于诱导胚胎干细胞的神经分化。A）在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的未分化小鼠 iPS 细胞克隆。B）小鼠 iPS 细胞在悬浮培养中形成的拟胚体，取自视黄酸处理以诱导神经分化后的第 8 天。比例尺为 100 μm。

图 3. 小鼠诱导性多能干细胞拟胚体在三维纤维蛋白支架中培养 3 天后的示例结果。细胞已开始在纤维蛋白支架内迁移并发生分化。比例尺为 500 μm。

讨论

上述方案提供了一种用于多能干细胞培养的三维纤维蛋白支架制备方法，特别适用于小鼠胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。这种基于三维生物材料的培养系统能够更准确地模拟干细胞所处的微环境 体内 因此，它可用于筛选生物信号，以确定这些信号对干细胞分化的影响 ⁶我们的观察表明，这些支架在接种干细胞来源的类胚体后，可在体外维持2周，随后完全降解。为进一步提高这些支架的稳定性，可在细胞培养基中添加抑肽酶（一种蛋白酶抑制剂），以减缓其降解速度。^7,16 这些支架还已成功应用于神经组织工程，特别是用于生成类似于中枢神经系统中所发现的组织。¹⁷. 尽管其他研究团队已将诱导多能干细胞与纤维蛋白胶结合用于治疗缺血性脑卒中¹⁸这项工作是已知首个将iPS细胞与纤维蛋白支架相结合用于神经组织工程应用的报道。该研究也为将多种干细胞类型与纤维蛋白支架结合用于其他组织工程应用奠定了基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
所需设备：
分析天平 pH计 组织培养箱（37°C，5% CO2） 磁力搅拌器 分光光度计 无菌组织培养操作台
Tris缓冲盐水（pH 7.4）（需4 L，另加溶解纤维蛋白原所需量） 50 mM 氯化钙溶液 无菌锥形离心管（15 或 50 mL） 35 mm 培养皿 透析袋（截留分子量 7,000） 透析夹 5.0 μm 注射式滤器 独立包装的无菌 0.22 μm 注射式滤器 注射器 24孔组织培养板
纤维蛋白原（人源）	Calbiochem	341578
凝血酶（人源）	Sigma-Aldrich	T7009