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Summary

用脐血及白血病骨髓细胞三维培养一种造血系统。该方法的基础上使用涂有细胞外基质蛋白合成的多孔聚氨酯脚手架。这种支架是适应能力，以适应广泛的细胞。

Abstract

造血干细胞需要一个独特的微环境，以维持血细胞的形成^1;骨髓（BM）是一个复杂的三维（3D）组织其中造血称为壁龛^2-4空间组织的细胞微环境监管。该组织的骨髓龛是正常或恶性骨髓⁵的功能或功能障碍的关键。因此， 在使用前体内模仿体内微的更好的理解，将有助于我们澄清⁶白血病的分子，细胞和微环境因素。

目前，造血干细胞在体外培养中的二维（2D）的组织培养瓶/要求要么与异体或异种基质细胞共培养或添加外源性细胞因子⁸孔板^7。这些条件是人工从体内不同</eM>微环境中，他们缺乏的三维细胞龛和揭露细胞，细胞因子浓度异常高，这可能会导致分化和全能性^9,10损失。

在此，我们提出了一种新的三维骨髓培养系统，模拟在体内的三维生长环境，在缺乏外源性生长因子，并支持多向造血。在聚氨酯（PU）制成的这种系统使用的脚手架高度多孔促进高密度，跨越更高的比表面积比传统2D ¹¹单层培养细胞的生长。我们的工作表明，该模型支持脐血（CB）的单核细胞（MNC）的¹²和外源性细胞因子的情况下，在原代白血病细胞的生长。这种新颖的3D模仿一个人的实验模型，研究造血和探索新的治疗白血病的发展提供了一个可行的平台。

Protocol

1。脚手架制造和生物功能化支架

1. 制作在培养皿磁盘的形式聚氨酯支架（100-250毫米孔径，孔隙率90-95％），使用热致相分离的准备聚合物溶液中二恶烷（添加5wt％），其次是¹³进程的冻结和后续溶剂升华（ 图1A）。
2. 切成0.5×0.5×0.5毫米，事先与ECM蛋白涂层（ 图1B）立方体脚手架磁盘。
3. 预湿的支架，由乙醇（70％）中浸泡1分钟，然后转移到磷酸盐缓冲液（PBS）为20分钟。然后离心10分钟，在3630 XG，并增加蛋白质的解决方案。
4. 在20分钟在1420 XG蛋白溶液离心支架。
5. 为了疏通表面的毛孔，让接种的细胞深入渗透到脚手架，离心支架在910 XG更多的时间为10分钟在PBS。
6. 消毒8分钟曝光组合使用230伏，50赫兹，0.14，紫外线灯，浸泡在乙醇2小时（70％）的支架。在此之后，支架在PBS洗两次，然后加入Iscove改性杜尔贝科中等（IMDM培养），辅以30％小牛血清（FBS）和1％青霉素和链霉素（的P / S）。 3天在37°C和5％的CO _2，使用前放置在湿润的孵化器的支架。 24良好的组织培养板（每口井脚手架）被放置在无菌的支架。

2。单核细胞的分离和脚手架直播

1. 从脐带血或白血病骨髓样本中提取人类的跨国公司，利用Ficoll分离Paque密度梯度离心（1500转35分钟）（ 图1C）。
2. 重悬在IMDM培养跨国公司含30％胎牛血清和1％，P / S
3. 种子100μL跨国公司悬架（2×10 ⁶细胞/支架）上使用一个微型的移液器支架。
4. 种子棚架5％CO ₂下孵育10分钟解决支架的细胞在37°C。
5. 每口井补足的IMDM培养1.5毫升含30％胎牛血清和1％的P / S和地方的孵化器孔板在37°C和5％CO _2的实验时间。
6. 种子棚架接受所有媒体的日变化。

3， 原位细胞增殖和形态:MTS，扫描电镜和Cytospins

1. MTS实验:从文化非种子和两个种子棚架和地方在一个干净的新24井板。加入1毫升的媒体和MTS的解决方案，并为3小时孵育200μL，在37°C和5％的CO _2。
   1. 在96孔板和使用酶标仪在490 nm处测量吸光度，以8×100μL上清样品;的地方。
2. 扫描电子显微镜（SEM）:在不同时间点的日ê文化，消除从媒体与跨国公司接种支架，并固定在4分40 2.5％PBS缓冲戊二醛溶液°C间，然后用PBS洗两次。
   1. 脱水乙醇梯度系列（25，50，70，80，90，95，和100％），10分钟和4小时的无菌环境中干各的支架。
   2. 部分标本，然后溅射涂层在氩气气氛的黄金前2分钟，扫描电镜评价，使用一个20千伏的加速电压。
3. cytospins:收集吸气文化在不同的时间点从脚手架的细胞2.0×10 ⁴细胞/幻灯片。
   1. 到3分钟1500转离心玻片的细胞。
   2. 赖特 – 姬姆萨染色的修改，并使用光学显微镜观察染色的幻灯片。的F-查看软成像系统，可用于拍照。
   3. 洗滑动之前，显微镜下观察。
4. 中号 ultiphoton分析:在不同的时间点，直到进一步的分析与乙醇蒸气（70％）过夜，然后干燥，储存于-20°C间的固定支架。在此之前与多光子显微镜的部分脚手架为30微米厚的幻灯片，并用PBS湿的可视化。
   1. PBS在室温下30分钟与10％的胎儿牛血清阻断种子棚架。
   2. 孵育4°C在黑暗中一个主要的单克隆抗体1:50稀释:小鼠抗人CD71的支架过夜。
   3. 在PBS洗样品三次，染色二抗:抗鼠的Alexa Fluor 488室温在黑暗中1小时。
   4. 用PBS洗样品三次，使用水排放X60物镜共焦显微镜观察。
   5. 由脉冲激光器在488 nm荧光的Alexa Fluor 488是兴奋。 volocity 5.3.2软件可用于后续的图像分析。

jove_title”> 4。流式细胞仪分析细胞人口

1. 在流式细胞仪的细胞分析（下称”财委会”）之前，与相应的免疫抗体检测标记的细胞。根据选定的抗体检测的样品准备。对于跨国公司检测的抗体以下组合:CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5。
2. 吸在不同的时间点和离心机的从脚手架细胞。一个约1×10 ^6个细胞的细胞沉淀溶于100μLFC缓冲液（PBS + 0.1％的叠氮化钠）和添加10μL每个抗体的荧光染料。 30分钟在4°C孵育细胞，用PBS洗两次，终于重新暂停在FC缓冲区。
3. 流式细胞仪染色装入样品与同型对照设置的”消极”的抗体表达和校准流式细胞仪控制与检测渠道。
4. 阅读的样品染色瓦特随着三种不同的抗体和终于代表使用WinList软件数据。

5。代表结果

没有添加外源性生长因子对造血细胞生长动力学的一个例子如图2所示。由于造血功能的异质性，两种不同的细胞:正常和异常造血干细胞进行了阐述。 图2A中，人类CBMNC的细胞增殖是显而易见的，经过28天中文化图2B显示在模仿的人原代白血病细胞的生长动力学。测量细胞代谢活性的关系，以吸收使用MTS检测细胞增殖评估。在这两种情况下，细胞增殖，并在模型建立。生长动力学的差异观察，建立了文化的正常造血细胞的速度比白血病细胞。

_content”收获细胞的形态，即使经过28天的文化，在缺乏外源性生长因子是典型的正常造血干细胞（ 图3A）和白血病细胞（ 图3B）。支架的中央部分进行了分析后由SEM支架被从文化和显示的传播种子细胞整个脚手架，在集群和”利基，像”结构（ 图3A”与乙”）上立足。 图C显示的孔隙大小和分布在1非种子选手支架作为对照，经过28天的多光子显微镜被用来突出三维支架原位细胞内的分布，这表明在中央部分的脚手架红岛屿的存在标记的表达（ 图4）在红细胞CD71的，这是积极的。这证明了的成熟和成熟细胞杜的重要性环红细胞。最后，流式细胞仪检测细胞前播种图显示:人类CBMNCs和图5B说明异常造血细胞的原代白血病细胞中的造血细胞， 图5A代表正常的造血干细胞表型的差异。的CD235a各级⁺和CD45 ⁺相应的红细胞和白细胞分别高于正常样本中突出的白血病hemoblastic性质的白血病。

图1。插图在PU脚手架制造和生物功能化所涉及的过程。一）PU溶解在二恶烷（添加5wt％）和热致相分离过程和随后的溶剂升华脚手架生产，由Safinia 等 ^13。二）脚手架磁盘，然后切成诠释Ø立方体0.5×0.5×0.5毫米，然后涂上与细胞外基质（ECM）的蛋白质离心。 c）跨国公司提取人脐CB或使用了微管密度梯度离心法和种子在PU支架（2×10 ⁶细胞/支架）从骨髓的愿望。

图2细胞增殖测定，使用MTS检测:A）使用人类脐带血跨国公司，B）使用人原代白血病细胞。列显示在聚氨酯支架生长的细胞随着时间的推移，当无外源性细胞因子除了接种。

图3:细胞形态和支架周围分布，使用cytospins，scanni纳克电子显微镜。 （AB）的代表赖特 – 姬姆萨染色cytospins一）脊髓从聚氨酯棚架收集外周血单个核细胞经过28天的文化，和B）骨吸气白血病细胞收集聚氨酯支架，经过14天的文化。细胞因子条件下进行了两个实验。 （A'-B”））种子脐血跨国公司和B'），白血病细胞培养后28天，和C）控制支架无细胞的PU支架A的SEM照片代表中央部分”。

图4。多光子显微镜与脐血跨国公司的一个PU脚手架播种后28ð在文化和红标记CD71的染色。

<bR /> 图5。流式细胞仪三维点图染色CD45，CD71和CD235a表面表达标记。还提出了相对荧光强度比较获得的同型对照。 A组显示上述标记阳性的脐血单核细胞，B组显示了人类主要的白血病细胞。

Discussion

这里介绍的体外三维培养系统使我们能够建立一个造血的三维仿生概括了原始的BM结构和独立外源性细胞因子的细胞表型。三维模型提供的结构和微环境，使正常和异常造血细胞的增殖在体内遇到类似的条件。

聚合物支架材料的选择代表了仿生学设计的关键步骤。生物材料中重要的优势，已导致越来越大的兴趣在聚合物模仿体内环境提供所需的建筑，结构性能和必要的生理讯号。因为他们始终是在直接接触活细胞，这是他们的直接环境敏感的聚合物必须满足他们在生物医学中的应用所必需的最低要求。在一般情况下，一个I交易支架应具有良好的生物相容性，高度多孔，有足够的机械强度保持定义的三维结构，每单位体积的表面积高和重复性制造。聚氨酯包括所有这些特性，虽然高孔隙度和机械强度取决于淬火温度在提示过程中，可以调整和改变。仿生学作为一个结果，这可以适应其他类型的细胞，需要增加或减少的孔隙度和孔径。

在这个实验的支架涂有ECM的胶原蛋白I型，这种蛋白质，连同其他ECM蛋白进行了测试与以前我们的三维模型^11。这表明，胶原蛋白I型加速细胞粘附，并为此选择。该涂料可根据正在研究的细胞类型，采用不同的细胞外基质蛋白改性。的优势，结合ECM蛋白合成支架我S认为，他们不仅提供细胞粘附的细胞结合序列，而且还提供与其他细胞外基质蛋白和生长因子的相互作用，从而提高细胞的黏附，从而更好的细胞生长和成熟的细胞结合稳定的二级相互作用。

许多研究已完成体外造血功能，同时使用二维和三维系统;所有，其中包括增加外源性细胞因子的异常高浓度。这些研究有助于阐明造血分子的决定因素，但这一进程的组成部分的细胞和微环境要素已经难以破译基于这些技术的局限性。

这里介绍的方法，仿生学的BM高度加之流脑涂层的多孔聚合物支架是最佳的维持和稳定增长不正常和异常造血需要加入任何细胞因子。模仿支持多直系的造血功能，使系统适合作为一个平台，进入正常和不正常的造血前体的科学机制，为药物发现和研究使用。

Materials

Dioxan	Invitrogen	D20,186-3
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14190-094
IMDM	Invitrogen	12440-053
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
MTS	Promega Corp.	G3580
Glutaraldehyde	Fluka	49624
Wright-Giemsa	Sigma-Aldrich	WG32
Fetal bovine serum	GIBCO, by Life Technologies	10108-165
CD71	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-32272
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
CD45-FITC	BD Biosciences	74895
CD71-PE	BD Biosciences	555537
CD235a-PE-Cy5	BD Biosciences	555570
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S-8032