生物荧光原位模型胰腺癌进展

胰腺癌是癌症相关死亡的第四大原因，与5年生存率为^4-6％。1,2只有15％的患者及早诊断疾病获手术，肿瘤复发> 80％，这些患者^3,4吉西他滨用于治疗胰腺癌，但是，化疗是常见的药物往往有整体生存影响不大。我们亟需新的药理治疗胰腺癌的策略。他们的发展依赖于了解疾病进展的关键步骤，可能是敏感的干预治疗明显改善。

原位胰腺癌模型模拟人类疾病的关键环节，使他们的理想工具研究胰腺癌的生物学^6-9相反在体外细胞检测胰腺癌细胞的行为。ð胰腺癌的体内模型，皮下原位模型允许调查肿瘤细胞胰腺微环境的相互作用。病情恶化的动力学在原位模型和高度重复性发生在很短的时间框架（周），这使得它们非常适合新型疗法的临床前试验。这是在发病发生在一个时间更长，更可变帧（个月至1年^）10当用更积极的细胞株转基因模型，原位胰腺癌模型看到那些类似自发转移模式患者如萤火虫荧光素酶的生物发光报告基因的表达，有利于纵向监测肿瘤的生长，转移传播，复发和响应疗法^6,11

在这里，我们描述了胰腺癌原位模型，利用MATR埃吉尔局部细胞传递， 在体内生物发光成像的非侵入性的监测肿瘤进展。胰腺癌原位模型允许非侵入性的疾病进展和治疗干预在同基因或异种移植模型分析。

该协议被证明是作者的机构的动物护理和使用委员会的指导和批准下进行。所有的实验都符合所有有关准则，法规和监管机构执行。

1。转导胰腺癌细胞株

1. 混合厚膜胰腺癌细胞表达荧光素酶的如前面所述^。12,13 PANC-1和胰腺癌-1胰腺癌细胞株转导的萤火虫荧光素酶，是用在这里。

注:也可用于海肾荧光素或细菌荧光素酶。

2。胰腺癌细胞制备

1. 文化导胰腺癌细胞，直到70％汇合。
2. 提起胰腺细胞和确保生存能力大于90％。
3. 在2×10 ⁷个细胞/毫升的冷冻基质胶中的3:2混合物:磷酸盐缓冲液重悬萨尔INE（PBS）中。
4. 保持基底膜的细胞悬浮液在冰上之前注入胰腺。

注意:为了确保基质胶的快速凝固，减少PBS将细胞沉淀的体积占体积。拉手基底膜在任何时候使用冰冷的仪器和注射器，注射前防止凝固。所建议的细胞数是一个指南，应根据经验来确定每种细胞系。

3。鼠标准备

1. 使用吸入2-3％的异氟醚麻醉鼠标。确定一个温柔的脚趾捏缺乏踏板反射麻醉深度。
2. 涂抹润滑剂的眼睛，以防止脱水。
3. 将鼠标放在其背部37℃加热垫，并轻轻转动鼠标提高的腹部左侧。
4. 准备腹部有10％的聚维酮碘溶液。

注释:Injectab文件可以用来代替麻醉吸入麻醉。手术前禁食是没有必要的。

4。剖腹探查

1. 使用无菌手术器械做一个1.5厘米的切口，在皮肤约1厘米左外侧从中线。
2. 做一个1.5厘米的切口，在底层的腹部肌肉。
3. 找到脾脏，使用镊子轻轻取出脾脏从腹腔。沿着无菌棉花棒露出底层胰腺，脾脏固定。
4. 找到胰腺脾脏相邻的尾部。
5. 使用地下29 0.3毫升的胰岛素注射器，注入20μl的基底膜细胞悬液到胰腺。
6. 注射后，持注射器在胰腺，持续30-60秒，直到基底膜凝固。这一重要步骤，最大限度地减少细胞泄漏。
7. 检查注射部位的，以确保没有发生泄漏。
8. 返回到腹腔的脾脏和胰腺。

注意:要小心，以避免穿刺胰腺背侧这可能是薄。

5。腹壁封闭

1. 采用连续缝合圆针编织4-0可吸收缝合关闭鼠标的腹部肌肉。
2. 关闭外部的皮肤，用6-0不可吸收的单丝用切割针的缝合线，使用一个连续的针迹。
3. 将鼠标从吸入麻醉和注射0.05-0.1毫克/公斤丁丙诺啡皮下。
4. 让鼠标在笼子放置在37℃的加热垫，免费获得食物和水恢复。如果老鼠证明疼痛的迹象，如拱起或行动不便，丁丙诺啡可能每12小时超过36小时期间。
5. 伤口愈合后（7-10天），麻醉鼠标和消除外部缝线。

6。生物发光追踪胰腺CANCER进展

1. 使用吸入异氟醚麻醉鼠标。
2. 经尾静脉注射150毫克/千克的D-荧光素。
3. 鼠标放置在生物发光成像系统捕获白光和生物发光的图像，如前面所述^。14,15
4. 取出鼠标吸入麻醉剂，并允许它来恢复在其家笼。

注:生物发光成像的非侵入性的，可以定期进行，以探讨肿瘤的生长动力学。胰尾肿瘤图像，重要的是把鼠标放在左侧，所以肿瘤指向相机。我们想像每周一次的频率上升到每周三次的实验端点使用第二Lumina的成像系统（Perkin-Elmer公司，原卡尺生命科学版）运行生活成像4.3.1软件分级4，视场角12.5， F-STOP 1，曝光1 - 60秒（由最高地契osure不饱和像素）。

这种方法介绍胰腺癌原位模型，采用外科手术，包括诱导麻醉，剖腹探查术，注射癌细胞在基底膜和腹部闭合（ 图1A）。注入的细胞形成一个气泡在胰腺的表面（ 图1B）。胰腺癌恶化可能非侵入性监测使用在体内生物发光成像跟踪癌细胞扩散和传播（ 图2）。肝转移手术切除过程中，通过观察在肝脏中的生物发光显示（ 图2）和组织学（ 图4B），证实了体外 。原发肿瘤切除，胰尾，脾植入后6周。在此原位移植模型的肿瘤生长动力学重复性和酷似每年原位移植模型的动力学 ncreatic癌（ 图3）。胰腺肿瘤生长的局部浸润，转移至器官，包括肝脏（ 图4）。

图1。胰腺癌进展原位小鼠模型A）。麻醉鼠标固定的地方使用磁带和腹部消毒。二。纵向剖腹手术后的脾脏和胰尾轻轻形象化的地方举行在无菌棉签。 III。基底膜包埋胰腺肿瘤细胞注射到胰尾。四。腹部闭合在两层中B）的放大图像表示外置脾，胰腺。注射的细胞（箭头）形成气泡。 ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg"目标="_blank">点击这里查看大图。

图2。原位胰腺肿瘤生物发光成像（A）后十日内（B）注射液，注射后31天，及（C）肿瘤切除后五天。

图3。PANC-1和胰腺癌-1的细胞系在体内肿瘤生长的监测随着时间的推移（天注射后）为:生物发光成像组（n = 4）。基底膜嵌入的胰腺肿瘤细胞注射后的肿瘤生长动力学原位模型，使用移植胰腺肿瘤件类似。

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图4。苏木精和曙红染色切片（A）PANC-1初级胰腺肿瘤，及（B）PANC-1主要胰腺肿瘤肝转移。胰腺癌细胞的局部浸润到周围的器官。

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。