人类前列腺癌转移的原位小鼠模型

前列腺癌（PCa）是最常见的癌症诊断的男人，和癌症死亡的美国¹的第二大原因。从前列腺癌的死亡不是由于形成的原发肿瘤，而是转移的形成。因此，防止患者转移是非常重要。前列腺癌的小鼠模型提供了选项来揭开这种疾病的关键生物信息的多样性。

多种前列腺癌的小鼠模型存在，每个固有的优势和局限性。而前列腺癌在人体中的频率高，自然发生前列腺癌的小鼠²极为少见的，尽管小鼠等于整体的易感性癌症^3。一种啮齿动物异常是前列腺癌的Lobund Wistar大鼠的发展，它可以通过感应methylnitrosourea和睾酮⁴达到90％前列腺癌的比率由12月龄。出于这个原因，诱发模型系统中，如在TRAMP模型（小鼠前列腺的腺癌的转基因）是常用的。流浪汉模型可以特异性地诱导转基因表达在前列腺癌和前列腺癌发生的正常发展，从增生前列腺上皮内瘤（PIN），淋巴和肺转移^5-6。这些模型提供了能够测量的全方位肿瘤进展，以及包含一个完整的免疫系统的益处。然而，相关前列腺癌发展的分子事件可以小鼠和人类之间的差异，以及小鼠和人体临床研究之间的相关性表明变性。此外，这两种模式都是费时，作为一个例子的TRAMP模型需要约28周，以发展转移。

在研究转移，经常一尾静脉或左心室注入模型被使用。这个模型受益于快速周转时间，并且还可以测量骨头metastas的存在是使用特定的细胞系和条件。 Yang 等人报告说，皮下注射GFP阳性PC3细胞可引起广泛传播骨转移^7，和尾静脉注射intercardiac也产生骨转移发展^8-9。这些模型的主要限制与缺乏居住前列腺本身内的原发肿瘤。此外，对于模型依赖于注射癌细胞进入血液循环，这也避开了转移级联的整个上半年。因此，它排除了考试的最初步骤，包括通过入侵的主要器官，它是生物转移性转型的关键措施。转移性转型的许多监管机构直接影响早期细胞的侵袭。在转移级联早期步骤构成的高优先地点的靶向治疗，因为一旦癌细胞传播，克隆变异极大地扩展，从而增加生物人的多样性和减少有效的靶向治疗。

在试图对许多这些模型的局限性回应，我们的实验室已经开发人类前列腺癌的原位模型​​中的人类前列腺癌PC3-M细胞系被直接植入的BALB / c无胸腺小鼠的前列腺。 4-6周后，肿瘤大小，循环肿瘤细胞（CTCs的）的存在下，与对肺和淋巴结转移都可以量化。我们已经有效地使用这个模型来评估4的功效'，5,7 -三羟基异黄酮（染料木素）能抑制人类前列腺癌转移^10。染料木素的饮食消费一直挂在前列腺癌转移和死亡^11-12的减少，但以前没有研究已确定染料木素的施用是否会改变前列腺癌转移在动物或人。在这个研究中，我们证明了用染料木黄酮处理大大降低肺转移的数目。此外，我们确定染料木素人tered几个重要的促转移蛋白在原发肿瘤，包括粘着斑激酶（FAK），p38促分裂原活化蛋白激酶（p38蛋白），和热休克蛋白27（HSP27）的活化和表达。

这些结果与对应在临床观察。使用从小鼠获得的血液，我们能够精确地测量染料木素的血药浓度，并观察这些是类似于人类与染料木黄酮经常饮食消费水平。此外，本集团所进行的II期研究确定，在处理与染料木素，经验丰富的人在减少与细胞的侵袭和转移相关基因的前列腺组织中的表达，特别是基质金属蛋白酶型蛋白酶^{-2（MMP-2）13。}

我们也使用这个模型来评估对人前列腺癌转移¹⁴原发肿瘤的改变的基因产物的表达的效果。肿瘤supprESSOR内皮糖蛋白是TGF-β超家族的一员，并通过改建Smad信号¹⁵抑制人前列腺细胞体外侵袭。我们扩展了这些研究，以确定内皮糖蛋白对人前列腺癌转移的效果。稳定内皮糖蛋白敲除，矢量控制或内皮糖蛋白过表达细胞株植入小鼠。内皮糖蛋白敲低的细胞显示在小鼠的38％的最大数目肺转移，以及的CTC。小鼠植入控制向量呈中等响应，每只小鼠少肺转移，并在车辆检验中心仅18％的小鼠。高内皮糖蛋白植入小鼠表现出肺转移几乎完全抑制，车辆检验中心的完全抑制。

这些是在各种各样的应用中，这种技术具有的两个例子。从药物发现，在分子生物学模型的变化，这种模式提供评估对肿瘤生长和摩尔各种功能的效果的高通量方法丘拉尔变化的CTC的存在，且在肺和淋巴结形成鲜明的转移。

对于涉及动物的所有程序，协议获得批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在西北大学。手术技术和动物保健条件由兽医人员进行了观察和修改，以尽量减少动物的紧张和死亡率。个别机构可能有不同的要求，并与IACUC和动物的工作人员制定和执行这种手术方法时，工作是很重要的。

1。细胞注射液的制备

1. 这一步应该进行尽可能接近到开始手术。胰蛋白酶消化细胞被用于该实验中，从板取下，并用中和介质。的PC3-M人类前列腺癌细胞株稳定转染GFP已经被成功地用于这些实验中，由于PC3-M细胞的快速生长的条件。 GFP加入额外的易用性检测肺组织样本，与快速测定肺转移的癌细胞与从血液和骨髓，以确定循环肿瘤细胞中获得的免疫细胞在培养物。如果修改的感兴趣的特定基因，然后建立稳定的细胞系与该基因改造的首先执行，然后转染GFP。如果GFP将改变感兴趣的该基因的功能，GFP它可以省略。这将使检测肺转移比较困难，但还是可以实现的。此外，如果使用特定的成像技术使用荧光标记物，如荧光素酶为基础的IVIS，可以使用其它荧光蛋白代替。
2. 离心5分钟，在225×g的。
3. 分离2.5×10 ⁵个细胞，并离心5分钟，在225×g下。
4. 在20微升无菌盐水除去上清，重悬细胞。
5. 吸出细胞悬液加入0.5 ml注射器具有永久28½号针头（推荐:肯德尔MONOJET，其他品牌造成的问题），确保没有空气进入针人翁的悬浮液。
6. 注射器包装在无菌铝箔和冰上储存直至使用。

2。人类前列腺癌细胞原位移植

1. 雄性6-8周龄的BALB / c无胸腺小鼠的使用。理想的小鼠体重的手术是19-21克，和鼠标应该被允许在手术前将增长到至少有18克小动物在技术上比较难操作的。较大的动物往往会遇到较慢的肿瘤生长和转移的动力学。动物应该被安置在至少一个星期在手术前，尽量减少动物应激的动物设施。根据实验设计，药物治疗可能1周开始在手术前。
2. 根据动物设施的指示，注射手术前的止痛药。使用连接到1毫升注射器30½号针头0.1毫克/千克体重皮下注射BUPRENEX建议。
3. 将动物进入异氟醚室，等到动物是完全一nesthetized。肌张力无趾反射应该出席了这一点。建议使用此方法，但如果无法使用，麻醉等方法可以根据动物设施的使用说明书操作。
4. 移动动物出来的异氟烷室的进入无菌程序罩。将动物入鼻锥设备，并重新确保动物是在全麻醉，然后再继续。
5. 用优碘擦洗消毒棉球消毒下腹部区域，用酒精擦拭擦拭，并用聚维酮碘溶液最终喷雾。晾干。
6. 无论是使用消毒的手术刀或削尖的无菌手术剪，约3-4毫米低中线腹部切口而成。使用镊子轻轻提起膀胱和识别前列腺腹叶。这两个波瓣位于膀胱正下方。有些鼠标将有一个小的脂肪层覆盖，可轻轻移动一边用消毒棉签前列腺。 Minimiz机关电子所有的运动和肌肉组织，如果可能的。
7. 注入20微升体积的细胞溶液进入前列腺，最大限度地减少泄漏，并确保小泡被观察到。
8. 更换膀胱和使用4.0薇乔可吸收缝合线的单丝在一个简单的中断模式关闭肌肉层。
9. 使用无菌9毫米钉合皮肤层。
10. 从异氟醚麻醉取出动物和监控，直到清醒和正常转动。在恢复期放置在加热垫。
11. 如果多次手术正在执行，手术，清洁所有工具之间用70％的乙醇，并用消毒的玻璃珠灭菌。让工具下的动物在充分冷却。请勿重复使用缝线，棉球或无菌拭子。

3。监测动物

1. 基于动物设施的指示管理止痛药。皮下美洛昔康的一剂4小时手术后施用1毫克/千克体重ü唱连接到1毫升注射器30½号针头，建议，由一个附加的剂量为每12-24小时在未来48小时。
2. 史泰博可以从动物7-10天手术后取出，一旦伤口愈合。
3. 监测动物体重，摄食量，和触诊老鼠的肿瘤，每周两次，直至终止实验。增加频率可达每一天，当肿瘤变成可见的检查下显著肿瘤负荷或胁迫的动物。早期死亡从这个模型是由于大的原发肿瘤的负担，因为原发肿瘤可以阻止尿流，因此具有大于15％的体重，或原发肿瘤达到直径为1.5厘米的损耗的任何动物，应立即进行尸体剖检，以防止尿路梗阻和动物死亡。
4. 监测需要对动物环境的进一步浓缩。手术的压力增加动物的明争暗斗。而不是一个和其他行为增加了两个塑料小屋每笼人的富集可以减少这些事件。讨论与可在动物被安置在该设施的兽医工作人员的选择。由于缺乏对这个品系小鼠的睫毛，小屋和富集纸做的，不推荐，因为它们会刺激眼睛。

4。剖检程序

1. 4-6周后，肿瘤完全明显，动物开始减肥，由于增加肿瘤负荷。肿瘤通常可触诊和/或在视觉上是明显的。尸体剖检应在此时进行。在使用连接到1毫升注射器30½针头260毫克/公斤体重进行腹腔注射戊巴比妥，并让动物成为完全无意识，无趾反射或肌张力存在。
2. 一旦动物被麻醉，用无​​菌手术剪刀或手术刀，剪水平穿过直接在左肋动物的躯体，然后垂直地沿着动物的侧腋下，暴露心脏。执行使用连接到1毫升注射器用4％枸橼酸钠的DPBS冲洗，防止凝血，获得尽可能多的血液尽可能从动物30½号针头终端心脏穿刺。
3. 通过切割气管手术剪刀或手术刀从动物取出肺，并立即放置到组织培养盒和在10％福尔马林中。
4. 通过单独地切断附连到任何肿瘤的血管并确保没有额外的器官如输精管或精囊从动物取出原发性前列腺肿瘤相连。
5. 记录肿瘤的重量和体积。测量肿瘤的重量在以实验室规模克。用卡尺测量肿瘤的以厘米为单位的最长径的长度，以及相应的垂直轴。乘这些值来获得肿瘤的大小。根据不同的使用目的，马上急速冷冻在液氮中，和/或地方到组织盒放入10％福尔马林。
6. 暴露髋关节和膝关节手术剪刀或手术刀，并断开腿关节，注意要保持股骨完好。从动物中取出股骨并放入无菌盐水。
7. 取得任何其他器官或感兴趣的材料，并根据您的机构的指示处置动物。特别地，区域淋巴结往往有转移，往往如果窝藏它们被放大，并且可以收获。然而，应该注意，因为这可能会受到所引起的外科手术过程中的变化的静水压力。

5。加工和肺组织免疫染色样品

1. 在24-48小时将组织成PBS中10％的甲醛，嵌入肺石蜡。
2. 第肺部在45微米步路段，采取2-3个相邻的4微米的肺组织切片。
3. 如果使用GFP阳性细胞（推荐），进行免疫染色绿色荧光蛋白。如果没有，执行标准苏木精和曙红（H＆E）染色。

注:Dako公司设想+套件结合来自Invitrogen的GFP抗体已成功地用于根据制造商的说明，但是这可以被修改为任何免疫程序。

4. 以盲分数转移。如果GFP阳性，肿瘤细胞会弄脏褐色除了拥有庞大而独特的细胞核。当第一次得分转移，咨询病理学家，以确保正确的得分，并用H＆E染色的肺组织，以确认肿瘤细胞的存在，并没有浸润的免疫细胞。

6。从血液和骨髓循环肿瘤细胞的识别

1. 添加从尸检收集到1.5 ml离心管中所有的血。离心5分钟，在800×g的。
2. 去除血浆和加入1 ml的ACK裂解缓冲液（154.95毫米氯化铵，9.99毫米钾Bicarbo内特，0.0995毫米EDTA）。让血液在室温下放置3-5分钟。
3. 离心5分钟，在800×g的。
4. 去除上清，加入1 ml含抗生素的细胞培养基。加细胞含有9毫升细胞培养基的T75烧瓶中。
5. 培养细胞在37℃，在含5％CO ₂中培养10天，检查的CTC的存在下，每2-3天的潮湿气氛中。
6. 对骨髓，从使用剪刀，刀片或手术刀股骨移除所有的肌肉组织。除去骨的端部，尽可能靠近端部尽可能。
7. 使用23¾号针头，轻轻弹出骨髓从股骨到1.5ml的离心管中。
8. 添加到1ml细胞培养基，并轻轻吸取良好混合。
9. 加细胞含有9毫升细胞培养基的T75烧瓶中。

7。肿瘤的分子特征

1. 用于聚合酶链式反应（PCR）测定秒，肿瘤样品是快速冷冻在液氮中首先被粉碎的干冰上，然后使用组织匀浆3-5分钟，用1ml TRIzol试剂均化。的TRIzol提取是根据制造商的说明书进行。根据制造商的说明使用RNeasy RNA提取试剂盒纯化的RNA。进行cDNA的合成和定量实时根据制造商的说明书，使用TaqMan试剂PCR（定量RT / PCR）的建议，但是可以修改为任何目前使用的PCR方法。
2. 对于Western印迹分析，使用组织匀浆3-5分钟用1ml裂解缓冲液中匀化组织:PBS（137 mM氯化钠，10mM的磷酸钠，2.7毫米氯化钾），0.5％的Triton X-100，1mM EDTA中，的2.5mM焦磷酸钠，1mM的β-磷酸甘油，并加入蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3，10mM的氟化钠，和1mM原钒酸钠。细胞裂解物混合物置于1.5毫升离心管中。
3. 一分钱rifuge细胞裂解液混合物在13,000×g的10分钟。
4. 除去上清液并置于一个新的1.5毫升离心管中，以13,000×g下再离心10分钟。如果细胞碎片仍然存在，另外的离心步骤可以被执行。
5. 除去上清液，进行蛋白质印迹按正常的实验室条件。

在这个实验中，我们将展示一组有代表性在这些手术过程中获得的小鼠。五个小鼠植入GFP阳性含有对照载体的PC3-M细胞。肿瘤被允许生长了六个星期，然后多个参数进行了评价。在图1A和1B中，我们显示体重和小鼠的食物消耗的改变，分别。有因麻醉一个小坑体重和周围手术日期的食品消费。在实验的过程中，体重缓慢增加手术后，然后开始下降朝向实验结束时作为肿瘤负荷达到临界水平。这将与在这些小鼠的食物消费。

在图2A和2B，示出了获得的代表性肿瘤的大小。个别肿瘤大小各不相同，但平均我们达到约1克肿瘤，具有之间0.5-1.5克，以及1厘米2的肿瘤大小标准方差，以0.5-1.5厘米2的正常变异。虽然肿瘤的大小而变化，这些不相关与所得的转移的数量，无论在本文中与我们先前发表的作品10所示。然而，从这个模型，可以确定药物治疗或肿瘤的重量和体积的分子变化的影响。在该模型中的一个重要考虑是，当用于实验的相应端点。在图2C和2D中，我们显示在一个特定的PC3-M细胞系在第4周稳定转染GFP和对照载体和6周时的改变在肿瘤重量和肿瘤的大小。在过去的两个星期，平均瘤重增加2.7倍，肿瘤大小1.9倍。这说明在实验中加入额外的1-2周可以显着地影响结果。由于多种因素可以改变肿瘤的生长，包括年龄和小鼠的大小，该细胞的传代次数等建议不要终止实验，直到可见的肿瘤中大多数小鼠均观察到。

在图3A-3C，转移灶的数量进行定量三种不同的方式。在图3A中 ，GFP阳性的人类前列腺癌细胞的总数来表示。在图3B中 ，细胞基因座，或转移性沉积物存在的位置的数目，被示出。最后，在图3C中，不同的转移的数量，由一个清晰的约束组的细胞示出5个或更多的GFP阳性人前列腺癌细胞的定义，被显示出来。这些不同的条件代表性图片示于图4A-4D。在图4A中 ，在40倍的数量级的单个单元格被突出显示带有箭头。注棕色染色和独特的大核。使用H＆E染色染色相邻肺段如图4B所示 ，证实了没有GFP，检测癌细胞仍是容易实现的。此照片是在40倍的数量级和该信元被用箭头突出显示。在图4C中 ，将显示不同的细胞数在10倍大小的几个位点，每个位点突出显示一个箭头。 。最后，在图4D，示出了10个细胞的转移性沉积物。这些方法如何影响数据所表现出的鼠标1和鼠标3的差异。鼠标1具有总细胞的数量较少的肺，平均每肺段21.5的细胞相比，小鼠3，其具有平均每肺部700细胞。然而，鼠标具有3个位点少，或细胞存在比鼠标1的位置。鼠标3具有转移的相对较少的位点，但每单位面积细胞的数量，是由于一些非常大的细胞数目的转移非常高，每个位点82的细胞。相比之下，鼠标1具有更加独特的基因位点，但显著f每个地点壶细胞只是一个平均每个位置两个单元格的。这些不同的参数，可以对细胞贩运到肺和他们开始生长和增殖能力的动力学揭示。

另外，在图3D中，我们显示在尸体剖检在4与6周小鼠变化每肺总转移性细胞。如在图2C和2D描述的，显著变化观察到的肿瘤重量和大小中的最后两周的实验。这被概括在图3D中。剖检小鼠4周均未见转移的发展，而小鼠6周呈转移性细胞在评估所有小鼠。这进一步表明了确保小鼠尸检是在后期阶段端点执行，以确保发生形成转移的重要性。

在这个模型中添加的测量是在里面发生的分子变化原发肿瘤。在图5A-5C我们展示三个示例定量RT / PCR实验测量的转移进程的兴趣三个基因，基质金属蛋白酶型蛋白酶-2（MMP-2），基质金属蛋白酶类蛋白酶9（MMP-9）和热休克蛋白27（HSP27）分别。可以使用这种技术来检测利益通过定量RT / PCR检测的任何基因。此外，蛋白质水平可使用免疫印迹方法进行量化。

图1。观察到体重和在动物中的食物消耗。AB）的体重（克），或在每克小鼠每天平均摄食量，被记录在整个实验和在A中所示）和B）分别。

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图2。肿瘤大小和肿瘤重量在个人和小鼠组。 AB）肿瘤重量（g）和肿瘤大小平方厘米的五个有代表性的对照组小鼠和5只小鼠在六个星期结束时，平均都显示在A）和B）分别光盘）的肿瘤重量以克为单位的比较和以厘米为单位的小鼠组间平方肿瘤大小在尸体剖检四到六个星期。 点击这里查看大图 。

图3。转移扩散的个人和组小鼠。 AC）的平均转移性sprea每五个人的小鼠和5只小鼠在5 +细胞中的定义表示为细胞的任一数目（A），转移细胞的位置（B）中 ，或不同的转移六周端的平均肺D节明确定义群集（C）D）每鼠肺段小鼠之间转移细胞的平均数比较剖检在四个和六个星期。 点击这里查看大图 。

图4。肺转移的代表性图像。 A）在40倍物镜的个人GFP阳性肺癌细胞与箭头:B高亮显示）的邻近肺从A）部分，显示在H＆E染色，C型相同的细胞）在10倍的目标的一个肺段与含有不同数量的细胞。 的D）一个明显的转移在10倍物镜含10癌细胞明确定义为一组七个人的基因位点。

图5。的三个需要关注的转移基因的PCR分析。定量RT / PCR技术从小鼠收集在6周个别肿瘤样本进行的。 MMP-2（A）的相对mRNA转录水平，MMP-9（B）和热休克蛋白27（C）计量，标准化为GAPDH。 点击这里查看大图 。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。