利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

摘要

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。

摘要

宿主对病原体的免疫反应是一个复杂的生物学过程。传统上，用于表征宿主-病原体相互作用的大多数体内研究通常采用向小鼠腹腔注射特定细菌或病原体相关分子模式（PAMPs）的方法。尽管这些技术已为感染性疾病的发病机制研究提供了大量数据，但腹腔注射模型并不总是适用于肺部宿主-病原体相互作用的研究。通过利用小鼠急性肺部炎症模型，可以对宿主先天免疫反应进行高分辨率分析，其中使用脂多糖（LPS）作为刺激物。本文描述了通过非手术经口咽气管内途径给予LPS的方法，监测与疾病发生相关的临床参数，并利用支气管肺泡灌洗液评估宿主免疫反应。所介绍的技术广泛适用于研究宿主对多种PAMPs和病原体的先天免疫反应。同样，经过少量修改后，这些技术也可应用于过敏性气道炎症研究以及药理学研究。

引言

与致病性细菌相关的肺部感染是全球发病率和死亡率的常见原因。明确驱动宿主对这些病原体免疫反应的机制，将有助于开发新型预防策略和治疗药物，从而减轻这些感染带来的影响。本方案的总体目标是为使用者提供一种灵活的方法，利用病原体相关分子模式（PAMP）作为活细菌的替代物，来评估宿主对病原体感染的先天免疫反应。以往大多数评估宿主对细菌先天免疫反应的研究主要集中在腹膜模型，因其操作相对简便。尽管这些模型非常有用，并已在宿主-病原体相互作用和全身性炎症研究领域取得了重要进展，但这些模型产生的数据并不总是适用于呼吸系统相关研究。本文提出一种急性肺部炎症的肺部模型，作为经典腹腔（i.p.）注射模型的一种实用且具有临床相关性的拓展。该技术能够在器官特异性的模型系统中对先天免疫反应进行局部评估。

本文所述方法旨在提供一种简单且可靠的实验技术，使研究人员能够评估宿主对脂多糖（LPS）的免疫应答，LPS 是一种常见的病原体相关分子模式（PAMP）。该方法基于经气管（i.t.）滴注 LPS，可在小鼠肺部诱导强烈的先天免疫反应，并模拟人类呼吸道感染及急性肺损伤患者中观察到的多种病理生理特征¹。该技术的主要优势在于，可在无需使用活体细菌进行体内实验的情况下评估宿主免疫反应，从而避免了与之相关的混杂因素和生物安全风险。此外，本方案中描述的经口咽部气管内给药途径相较于其他常用技术（如经鼻腔（i.n.）给药和手术途径气管内给药）具有显著优势。例如，与经鼻腔给药相比，经口咽部气....

方案

所有研究均在弗吉尼亚理工学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准下进行，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。

1. 通过经口咽给药进行脂多糖的气管内（i.t.）接种

1. 使用耳孔、耳标或其他机构批准的方法，确保每只动物具有唯一的标识。
2. 记录每只动物的基线体重和体温。
3. 准备LPS的工作液。每只小鼠将接受50 µl剂量的1 mg/kg LPS溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。对照处理的动物将接受50 µl的1×PBS。
4. 使用以下滴入法准备适合的异氟烷给药 chamber。各机构对异氟烷及其他麻醉剂的使用指南有所不同，在开展任何研究之前，相关人员应联系所在机构的动物护理/福利部门，以确保充分满足所有规定。若滴入法使用异氟烷不可行，则可采用其他麻醉剂作为替代方案。
   1. 在合适的安全柜内，将约3 ml 异氟烷滴加至一张折叠的吸水纸巾上，并将其置于500 ml烧杯底部。
   2. 将一小片铝箔放置在纸巾上方，并用透明盖子盖住烧杯。
5. 准备将在经气管接种过程中使用的工具和试剂。在插管架上安装用于固定动物头部的橡皮筋。该操作需要准备一对直头镊子、一对弯头或弧形镊子，以及一支配有吸头的p200移液枪。
6. 将50 µl LPS吸入移液枪吸头中，并放置在插管架旁易于取用的位置。<....

结果

革兰氏阴性菌的细胞壁由脂多糖（LPS）组成，而LPS在环境中广泛存在。在敏感人群吸入LPS后会加重气道反应性，并可触发强烈的免疫反应11。LPS也是一种常用于小鼠模型中的病原体相关分子模式（PAMP），以诱导强烈的先天免疫反应。在本方案中，小鼠接受了经气管给予的来自 E. coli （血清型 0111:B4）通过经口咽部气管内给药。在LPS暴露模型中，体温和体重均为反映动物发病情况和疾病进展的典型替代指标。LPS攻击后，体温在最初6小时内显著下降，随后在24小时内逐渐恢复至基线水平。图1A）。然而，在24小时过程中，体重将稳步下降（图1B），在此期间体温将达到峰值，并在随后的48–72小时内逐渐恢复。因此，体温是评估炎症早期启动阶段更合适的指标；而体重则在疾病发生后期及恢复阶段更具可靠性。

气道暴露于LPS可导致大量白细胞浸润至肺组织。在暴露后的最初6小时内，可在支气管肺泡灌洗液（BALF）中观察到与宿主固有免疫反应相关的细胞（图1C）。在随后的24至48小时内，.......

讨论

成功评估小鼠肺部宿主免疫反应最关键的步骤如下：1）为所评估的模型选择合适的小鼠品系和性别；2）优化PAMP向肺部的递送；3）正确收集和处理支气管肺泡灌洗液（BALF）；4）正确固定肺组织并为其组织病理学评估做好准备。

小鼠品系的选择是评估宿主免疫反应的重要因素。C57Bl/6 小鼠通常被认为是研究固有免疫的理想小鼠背景，因其具有 Th1 偏向性以及对大多数病原体相关分子模式（PAMPs）产生强烈的免疫反应。同样，BALB/c 小鼠通常用于研究过敏性疾病模型，因其具有 Th2 偏向性。在肺部模型中另一种常用的小鼠品系是 129SvEv 背景小鼠，因其广泛用于基因修饰动物的制备。在所有情况下，实验设计时应谨慎，尽可能使用年龄和性别匹配的同窝出生对照动物，以比较基因修饰小鼠与野生型动物。通常，对于本文所述的 LPS 实验方案，应使用 6–12 周龄、性别匹配的 C57Bl/6 小鼠，且体重应不少于 20 g。LPS 暴露可能导致对 LPS 敏感的小鼠品系或基因型出现较高的发病率和死亡率。若发生此类情况，可能需要调整本实验方案的多个方面，包括降低 LPS 剂量、使用体型更大的动物，或更换实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57Bl/6J	杰克逊实验室	库存编号 000664
紧凑型天平	Ohaus 天平公司	71142845
小型动物直肠温度计	Braintree Scientific	TH 5
啮齿类动物直肠探头	Braintree Scientific	RET 3
耳标钳	Braintree Scientific	EP-S 901
来自 E. coli 0111:B4 的脂多糖	InvivoGen	LPS-EB
1× 磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-023
异氟烷	Baxter	40032609
气管内给药与肺膨胀支架	ICAP 制造公司	n/a
啮齿类动物插管支架	Braintree Scientific	RIS 100
剪刀（钝头/锐头）	费舍尔科学公司	13-806-2
镊子（直头）	费舍尔科学公司	22-327-379
镊子（45º，弯头）	费舍尔科学公司	10-275
剪刀（钝头/钝头）	费舍尔科学公司	08-940
移液器（200 µl 容量）	Gilson	F123601
乙醇	Sigma	459844
1 ml 注射器	BD 医疗	301025
10 ml 注射器	BD 医疗	301604
27 G × 0.5 英寸针头	BD 医疗	305109
制冷微量离心机	费舍尔科学公司	13-100-676
带鲁尔接头的 1.2 mm 气管套管	哈佛仪器公司	732836
汉克平衡盐溶液	Life Technologies	14025-076
4-0 编织丝线外科缝合线	Ethicon	A183
鲁尔接头至管路连接套件	哈佛仪器公司	721406
鲁尔三通阀套件	哈佛仪器公司	721664
Tygon E-3603 型实验室管路	Sigma	R-3603
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma	HT501128-4L
小鼠 IL-1β OptEIA ELISA 试剂盒	BD 生物科学	559603
小鼠 IL-6 OptEIA ELISA 试剂盒	BD 生物科学	550950
小鼠 TNF-α OptEIA ELISA 试剂盒	BD 生物科学	560478
血细胞计数板	Hausser Scientific	3520
血细胞计数板盖玻片	Thermo Scientific	22-021-801
台盼蓝	Thermo Scientific	SV3008401
细胞学漏斗夹	费舍尔科学公司	10-357
细胞学漏斗	费舍尔科学公司	10-354
滤纸卡	费舍尔科学公司	22-030-410
显微镜载玻片	费舍尔科学公司	12-544-1
盖玻片	费舍尔科学公司	12-540A
Cytospin 细胞离心涂片机	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick 染色试剂盒	费舍尔科学公司	47733150
Permount 封片介质	费舍尔科学公司	SP15-500