病原菌感染宿主的免疫反应是一种严格的监管过程。利用小鼠脂多糖肺曝光模式,也能够进行与疾病的发病机制相关联的复杂机制的分辨率高的评价。
对病原体的宿主免疫应答是一个复杂的生物过程。大多数体内研究的经典来表征宿主-病原体相互作用取小鼠选择细菌或病原体相关的分子模式(PAMP)的腹膜内注射的优点。虽然这些技术已经取得了与感染性疾病相关的病理生物学巨大的数据,腹腔注射模型并不总是适合于肺宿主 – 病原体相互作用的研究。利用小鼠的急性肺部炎症模型,可以进行先天免疫反应,利用脂多糖(LPS)的主机的高分辨率分析。在这里,我们描述的方法使用非手术口咽气管内给药管理脂多糖,监测与疾病发病机理相关的临床参数,并利用支气管肺泡灌洗液评估宿主的免疫反应。所描述的技术广泛适用于学习到的PAMP和致病菌的多元化宿主先天免疫反应。同样,用小的修改,这些技术也可以用在研究评估过敏性气道炎症和药理用途应用。
与致病菌种引起的肺部感染是全球发病率和死亡率的常见原因。确定开车到这些病原体的宿主免疫反应的机制将促进新的预防策略和治疗药物,这将削弱这些感染影响的发展。这里所描述的协议的总体目标是为用户提供一种灵活的方法,使用一种病原体相关分子模式(PAMP)来替代活细菌来评价对病原体感染宿主先天免疫反应。大多数以往的研究评估,以细菌宿主先天免疫反应都集中在腹膜车型由于相对容易执行。虽然这些模型是非常有用的,并导致宿主 – 病原体相互作用和全身性炎症领域的显著进步,从这些模型产生的数据并不总是适合于研究involvi纳克呼吸系统。在这里,急性肺部炎症肺模型,提出为经典的腹腔内(IP)注射模型的实用性和临床相关的扩展。所提出的技术允许在一个特定器官模型系统的先天免疫应答的局部评估。
这里描述的方法的目的是提供一个简单而强大的技术,以允许用户评估为脂多糖,这是一种常见的PAMP宿主的免疫反应。该方法是基于气管内毒素,其诱导小鼠和模拟物中的许多人患呼吸道感染和急性肺损伤患1中观察到的病理生理特征的肺部一个健壮的先天免疫反应的(它)滴入。该技术的主要优点是,它允许用户评估宿主的免疫应答,而不与导电体内研究相关 的混杂因素和安全问题用活细菌。同样,在本协议中所述曝光的口咽它的给药途径比其他常用的技术,包括鼻内(中)管理和手术IT管理显著优点。例如,口咽施用它允许相对准确dosaging和肺沉积相比,在施用,其通常从肺沉积的变异性增加患有由于代理在鼻腔的损失和鼻窦2-4。在它的给药途径规避这些空腔,并允许直接进入气管和呼吸道。同样,它的手术方法是一个显著更加病态的给药方法,需要掌握大量的培训。这里所描述的协议还包括一个描述的常用技术,并用于评估炎症的进展,并与描述正确的技术准备禄协议最终替代指标NGS的组织病理学评估。这些协议都集中在最小化通过最大限度地从每个单独的动物所产生的数据需要为每个研究的小鼠的数目。
所描述的协议是非常灵活的,可以很容易地修改,以评估各种不同的PAMP及相关损害的分子模式(D-AMPS)。此外,有一些额外的修改,这些协议也可以被应用到研究评估过敏性气道疾病的进展或与活的细菌,病毒或真菌5-10宿主-病原体相互作用。
所有的研究都根据机构护理和使用委员会(IACUC)的弗吉尼亚理工大学的批准,并按照健康指南的国家研究院实验动物的护理和使用进行。
1。 LPS使用口咽管理气管内(它)接种
2。血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)收集
4。细胞因子的评价
5。鉴别染色法和BAL细胞性评价
6。组织病理学评估
成功地评估在小鼠肺部宿主的免疫反应中最关键的步骤如下:1)选择合适的小鼠品系,性别为被评估的模式; 2)优化PAMP输送到肺部; 3)正确收集和处理的支气管肺泡灌洗液; 4)固定好,并准备对肺组织病理学评估。
小鼠品系的选择是在评价宿主免疫反应的重要因素。 C57BL / 6小鼠通常被认为是最佳的鼠标背景用于研究天然免疫由于大多数的PAMP其Th1型偏斜和强有力的反应。同样地,BALB / c小鼠通常用于研究过敏性疾病模型,由于其Th2的倾斜。在肺癌模型的第三个常用的应变是老鼠的129SvEv背景下,由于产生转基因动物的共同使用。在所有情况下,应谨慎在实验设计和只要有可能,年龄和性别马应采取tched升的队友控制的动物应该用于与野生型动物比较转基因小鼠的研究。典型地,对于LPS协议描述这里,6-12周龄的性别相匹配的C57BL / 6小鼠,应使用与应权衡至少为20克。这可能是LPS暴露将导致高水平的发病率和死亡率在敏感的小鼠品系或基因型。如果发生这种情况,则可能需要调整一些方面中,此协议,包括降低了LPS的剂量,使用较大的动物,并切换在实验中使用的动物的性别。小规模实验应进行初步确定动物的敏感性和对每个实验的条件,应根据最易感基因型或实验条件。
口咽施用它已被认为是比其他形式剂递送至肺部2更准确。这在很大程度上是由于直达AIrway和规避与鼻腔,鼻窦腔沉积有关的问题。然而,与所有动物的程序,它的管理需要大量的手工技巧和练习达到熟练。技术不当会导致低效率的肺沉积和在某些情况下会导致动物损伤。通常,伊文思蓝染料(EBD)可以有效地利用作为一个训练工具此过程或解决与沉积4相关联的潜在问题。 EBD可以施用它,并随后用甲酰胺从组织中提取。 EBD的数量可以用吸收水平进行计算比对的标准曲线。在我们的手中,典型EBD恢复之间90-98%的范围。预计未收回染料的体积要与泄漏到食道相关联。由于它的精度,它的管理技术是理想的输送剂量敏感的药物不同范围的肺,如药剂或感染性微生物。
将BALF和BALF细胞含量的分析可以提供显著量洞察到宿主免疫应答的总体进展。在刺激后的肺中局部释放的炎症介质,可以在BALF中使用共同的免疫学技术,如ELISA和Western印迹有效量化。同样,BALF中的细胞组合物可以使用任一差动细胞染色或流式细胞术进行评价。开发适当的技术和手巧是进行支气管肺泡灌洗(BAL)的最关键的部分。其中一个BAL期间发生的最常见的问题是未能充分提取液原本放在肺部最大音量。这通常与不当抵押插管相关的或当针代替实际插管的使用。专门气管插管是市售的。它也是重要的运动和力用来插入和取出的盐水在整个过程顺畅和一致的。这里描述的协议进行了优化的收集BALF中细胞的鉴别染色法。鉴别染色法是一种改性莱特Giemsa染色,并且是一种非常有效的技术来进行基于形态学的小区标识。此染色技术允许基于其独特的颗粒污染性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分化。单核细胞来源的细胞也很容易识别和BALF中被观察到。这些包括巨噬细胞和树突状细胞。同样地,T细胞和B细胞通常也观察到。然而,这些单核细胞和淋巴细胞往往难以仅根据形态学大多数研究人员能够准确区分。流式细胞仪的使用可以增加更高的分辨率,以这些评估。然而,从对照组动物中回收低细胞数量通常是一个限制因素。因此,如果流量cytomETRY是要使用的,实验设计应该包括附加的阴性对照组动物以增加细胞的恢复。
肺组织病理学评估是该协议的另一个重要组成部分,并允许对疾病进展的直接可视化( 图3A和3B)。当肺部得到适当准备,组织病理学检查可以准确的评估,量化和表征。在编制肺部组织病理学中最关键的一步是正确充气他们固定液。通货膨胀的手动方法通常会导致肺是过度膨胀,在膨胀的或部分膨胀的,这会导致次优的可视化和形态学评估( 图3C和3D分别 )。同样,之前不固定充气肺是很难准确地评估和经常导致高度可变的组织病理学评分( 图3 E)。通胀的严重性方法这里讨论提供了以最小的可变性通胀的高度重复性的方法。使用这种技术,可以评估特定地标是实验动物之间是一致的肺部。此外,通过使用吹胀支架重力通货膨胀已经显示出膨胀的肺部以20mm 12上的固定剂的压力。这种技术允许肺的可视化在其最生理学相关的尺寸和形状,并已被证明是对敏感病理生理过程12的评价非常有效的。至关重要的是,通胀的立场被设定在鼠标产生适当的压力适当的高度。如果不理想的通胀观察,通胀支架的高度应根据经验来确定。使用市售的小型啮齿动物的肺胀的立场,这将确保适当的高度,值得推荐。
T”>这个程序已被优化,交付LPS和其他的PAMP对小鼠的肺部。一旦这些技术被掌握,另外的研究也可以使用修改后的协议有效评估用活病原体的宿主 – 病原体相互作用启动。同样,这里所描述的技术是高度通用的,并且可以被应用到感兴趣的评估实验或药剂的临床和生理相关性进行研究,因为在计量精度,这种技术也是理想的体内研究需要高精密的代理人交付水平。这个过程经过优化,交付LPS和其他的PAMP对小鼠的肺部。一旦这些技术被掌握,另外的研究也可以使用修改协议使用活的病原体,有效地评估宿主 – 病原体相互作用启动。同样,此处所描述的技术是高度灵活和可以bË适用于有意评估试验或药物的临床和生理相关的任何研究。因为在计量精度,这种技术也是理想的体内研究中 ,需要在剂输送高水平的精度。
The authors have nothing to disclose.
C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 | |
Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 | |
Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 | |
Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
Lipopolysaccharide from <em>E. coli</em> 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | |
Isoflurane | Baxter | 40032609 | |
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a | |
Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 | |
forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 | |
Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 | |
Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
1 ml Syringe | BD Medical | 301025 | |
10 ml Syringe | BD Medical | 301604 | |
27 G x 0.5 in Needle | BD Medical | 305109 | |
Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 | |
4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 | |
Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 | |
Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 | |
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing | Sigma | R-3603 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
Hemocytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 | |
Cytology Funnel Clips | Fisher Scientific | 10-357 | |
Cytology Funnels | Fisher Scientific | 10-354 | |
Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A | |
Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |