口咽部气管内PAMP管理和支气管肺泡灌洗的利用率来评估小鼠宿主的免疫反应

Summary

病原菌感染宿主的免疫反应是一种严格的监管过程。利用小鼠脂多糖肺曝光模式，也能够进行与疾病的发病机制相关联的复杂机制的分辨率高的评价。

Abstract

对病原体的宿主免疫应答是一个复杂的生物过程。大多数体内研究的经典来表征宿主-病原体相互作用取小鼠选择细菌或病原体相关的分子模式（PAMP）的腹膜内注射的优点。虽然这些技术已经取得了与感染性疾病相关的病理生物学巨大的数据，腹腔注射模型并不总是适合于肺宿主 - 病原体相互作用的研究。利用小鼠的急性肺部炎症模型，可以进行先天免疫反应，利用脂多糖（LPS）的主机的高分辨率分析。在这里，我们描述的方法使用非手术口咽气管内给药管理脂多糖，监测与疾病发病机理相关的临床参数，并利用支气管肺泡灌洗液评估宿主的免疫反应。所描述的技术广泛适用于学习到的PAMP和致病菌的多元化宿主先天免疫反应。同样，用小的修改，这些技术也可以用在研究评估过敏性气道炎症和药理用途应用。

Introduction

与致病菌种引起的肺部感染是全球发病率和死亡率的常见原因。确定开车到这些病原体的宿主免疫反应的机制将促进新的预防策略和治疗药物，这将削弱这些感染影响的发展。这里所描述的协议的总体目标是为用户提供一种灵活的方法，使用一种病原体相关分子模式（PAMP）来替代活细菌来评价对病原体感染宿主先天免疫反应。大多数以往的研究评估，以细菌宿主先天免疫反应都集中在腹膜车型由于相对容易执行。虽然这些模型是非常有用的，并导致宿主 - 病原体相互作用和全身性炎症领域的显著进步，从这些模型产生的数据并不总是适合于研究involvi纳克呼吸系统。在这里，急性肺部炎症肺模型，提出为经典的腹腔内（IP）注射模型的实用性和临床相关的扩展。所提出的技术允许在一个特定器官模型系统的先天免疫应答的局部评估。

这里描述的方法的目的是提供一个简单而强大的技术，以允许用户评估为脂多糖，这是一种常见的PAMP宿主的免疫反应。该方法是基于气管内毒素，其诱导小鼠和模拟物中的许多人患呼吸道感染和急性肺损伤患¹中观察到的病理生理特征的肺部一个健壮的先天免疫反应的（它）滴入。该技术的主要优点是，它允许用户评估宿主的免疫应答，而不与导电体内研究相关 ​​的混杂因素和安全问题用活细菌。同样，在本协议中所述曝光的口咽它的给药途径比其他常用的技术，包括鼻内（中）管理和手术IT管理显著优点。例如，口咽施用它允许相对准确dosaging和肺沉积相比，在施用，其通常从肺沉积的变异性增加患有由于代理在鼻腔的损失和鼻窦^2-4。在它的给药途径规避这些空腔，并允许直接进入气管和呼吸道。同样，它的手术方法是一个显著更加病态的给药方法，需要掌握大量的培训。这里所描述的协议还包括一个描述的常用技术，并用于评估炎症的进展，并与描述正确的技术准备禄协议最终替代指标NGS的组织病理学评估。这些协议都集中在最小化通过最大限度地从每个单独的动物所产生的数据需要为每个研究的小鼠的数目。

所描述的协议是非常灵活的，可以很容易地修改，以评估各种不同的PAMP及相关损害的分子模式（D-AMPS）。此外，有一些额外的修改，这些协议也可以被应用到研究评估过敏性气道疾病的进展或与活的细菌，病毒或真菌^5-10宿主-病原体相互作用。

Protocol

所有的研究都根据机构护理和使用委员会（IACUC）的弗吉尼亚理工大学的批准，并按照健康指南的国家研究院实验动物的护理和使用进行。

1。 LPS使用口咽管理气管内（它）接种

1. 确保每个动物的特征通过使用一个耳朵打孔，耳标或其他制度上认可的方法进行唯一标识。
2. 记录基线体重和体温的每个动物。
3. 准备LPS的工作股票。每只小鼠将在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中得到1毫克/公斤的LPS的50微升的剂量。模拟处理的动物将接受1×PBS中的50微升的剂量。
4. 准备一个合适的腔异氟醚的使用下面滴法的管理。机构准则变化有关使用异氟醚和其他麻醉剂和前向initiatING任何研究，应联络动物保健/福利的机构的部门，以确保所有指导方针得到充分满足。如果降法异氟醚是不是一种选择，其他麻醉剂是可以接受的替代品。
   1. 在一个适当的安全柜，申请约3毫升异氟醚的一种折叠的吸收纸毛巾，并装在500毫升的烧杯的底部。
   2. 放置一小片铝箔的纸巾上的顶部，并盖上一个透明盖的烧杯中。
5. 准备将它在接种过程中使用的工具和试剂。定位橡皮筋，将确保动物头插管立场。这个过程需要一对直的镊子，一对成角度的或弯曲的钳子，和一个P200移液管与提示。
6. 负载50微升的LPS到枪头和发生在气管插管支架旁边一个容易到达的位置。
7. 麻醉鼠标通过将动物放入异氟烷室与覆盖所述腔室的透明盖子。观察动物的呼吸方式，这将是快速而浅时，首先放置在室内。动物将被充分麻醉时的呼吸率接近1的呼吸/ 2秒，这通常是在30秒内将在腔室的到达。如使用滴法异氟醚在批准的动物协议规定的鼠标应该被麻醉。
8. 从试验箱中取出麻醉小鼠，并暂停在插管动物站在它前面的门牙。确保该动物被牢固地约束和口腔和舌头的访问。
9. 轻轻的安全与直钳舌。抓住舌倾斜的镊子，轻轻拉出口中，直到稍微感觉到阻力。这个动作是足以阻挡会厌并获得气管。
10. 继续按住舌头在伸出位置时，管理LPS的50微升剂量到喉咙的后部，并立即覆盖动物的鼻孔用戴手套的手指。该LPS是可见的喉咙后部，直到鼠标吸入。
11. 继续覆盖鼻孔按住延长5-10额外呼吸的舌头。
12. 从插管支架移开鼠标，然后将动物放回一个新的笼子，直到它从麻醉中恢复。
13. 监测与疾病进展相关的替代指标。体重和体温，应监测，每4-8小时的学习时间。同样，评价行为特征和发病率升高相关的临床症状。
14. 以评估疾病进展，收获小鼠在以下脂多糖暴露特定的时间点。以下LPS曝光典型时间点收获包括0，6，12，18，24，和48小时。为了评估恢复和生存，评估老鼠7哒YS后接种。

2。血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）收集

1. 使用制度上认可的方法牺牲鼠标。
2. 将动物在它的后面，并将其固定到一个尸检板，（1.27公分）0.5理想的高度。
3. 湿整个鼠标用70％乙醇。
4. 用1ml注射器，用27号针头，进行心脏穿刺进行任何切口之前。它应该是可能的退出500-800微升的全血从单个小鼠。
5. 从注射器取下针头和全血转移到一个预先标记的1.5 ml离心管。对于血清的收集，允许全血在室温下凝结至少30分钟。除了血清集合，这个过程也可以通过加入抗凝血剂的管和注射器，采集全血，来研究循环免疫细胞之前修改。
6. 做一个横向切口一穿过腹膜腔的长度和从腹膜腔的纵切口，鼠标的下颚。
7. 使用镊子，把握切口的两侧，轻轻拉扯皮肤从底层的腹腔和胸腔。
8. 使一个大切口沿腹膜腔从阴部到胸骨的长度，同时注意避免切割膜片。轻轻移肠子在腹腔内，以允许访问肾脏中的一个。
9. 切肾静脉通往肾脏作为一个排水点灌注。
10. 尼克隔膜用剪刀，小心避免肺部和心脏，在心脏的左侧露出。
11. 手动灌注使用10毫升注射器用27号针头和1x PBS溶液的心脏。避免灌注过程中用力过猛确保食盐不被强迫进入肺部。剩下的血要排出来自门静脉切开。
12. 仔细沿切使用钝/钝剪刀胸骨肋骨，同时注意避免切割的心脏和肺。在此过程中不小心切割肺部将显著降低BALF中所收集的量，并会导致无法正确地膨胀与固定液肺部。
13. 轻轻分离心脏和肺部远离使用镊子肋骨。小心切开胸腔的使用钝/钝剪刀尽量靠近脊椎尽可能每个部分和完全删除这两个部分。
14. 单独使用镊子唾液腺或用剪刀将其删除，以露出气管。
15. 小心切开用剪刀的覆盖气管肌肉。至关重要的是，气管不能在此过程中切断。
16. 用剪刀，分离锁骨上覆气管。
17. 使用镊子轻轻抓住胸腺和解除组织离心脏。用剪刀取出胸腺，同时注意避免切割心脏或肺部。
18. 做一个小切口水平在1-2环下面使用有角度的剪刀（45-90度角，锋利/锋利）喉气管。切口应足够大，以牢固地固定在套管。
19. 插入套管，使锥形端延伸下方切口2-3气管环，并用丝线缝合固定到位的套管。确保缝合气管和食道之间穿过并拉紧的套管。
20. 填写1毫升注射器1毫升汉克斯缓冲盐溶液（HBSS），并轻轻插入其鲁尔进入套管。
21. 使用缓慢，但持续的运动，注入〜900μL进气管，充气肺，并立即撤回HBSS。将回收的BALF中15毫升锥形管中。
22. 重复此灌洗2次额外收取约3毫升支气管肺泡灌洗液中，供日后分析。存储支气管肺泡灌洗液在冰上或4℃，直到准备使用。

3。组织病理学准备

1. 将10毫升注射器进入肺部通胀的立场。装配油管路厄氏，鲁尔到活门，并在活栓到注射器。确保活塞处于关闭位置。 10 ml注射器将作为一个重力流水库。贮存应附着在充气站4.75在上述动物和储层的顶部应在动物上延伸10.5。
2. 用中性缓冲福尔马林溶液填充注射器。确保该注射器是完全充满的固定液。
3. 放置吸水巾管子的开口端之下并打开活塞，使固定剂来填充管道。一旦固定液开始从管道流出，立即关闭活塞，重新填充注射器与固定液的顶部。重要的是，在注射器被完全填充，以提供压力的合适量为肺膨胀。
4. 轻轻通过第二片缝合线的气管下，约1-2个气管环下方的套管的端部。
5. 绑在缝合一个松散的结;但是，不要拉结紧。
6. 从插入鼠标通胀管子站进入套管。
7. 打开活塞，使肺部受重力通胀来填补。
8. 一旦肺部达到其最大的通胀水平，拉动缝线紧，配合第二结。
9. 关闭活塞和从所述套管移除导管。
10. 轻轻抓住缝线有一对镊子和持套管用手指从气管取出套管。小心地将缝线下来，对胸腔和插管背对着鼠标的鼻子。
11. 轻轻抓住气管或缝线用钳子和解除气管远离颈腔。
12. 割断气管尾用剪刀钝了并列缝合。
13. 一旦trache一个是免费的从下层组织，开始拉气管远离鼠标。轻轻提起肺部出了胸腔。
14. 小心切开结缔组织保持肺在胸腔。继续拉动气管远离鼠标的身体和应用稳步向上的力，同时降低相关的连接。小心避免切肺。注意，心脏应由附加到使用这种方法肺部。
15. 一旦肺部已被删除，将它们放置在10毫升福尔马林缓冲液中。
16. 拔下鼠标尾部的基因分型一节。
17. 以下适当的制度规定进行处置鼠标胴体。

4。细胞因子的评价

1. 离心分离全血，在步骤2.5收集，以12,000×g离心5分钟以分离血清。血清转移至预先标记的1.5 ml离心管中并储存于-80℃。
2. 评估塞鲁米的细胞因子水平通过ELISA或其他类似的试验。稀释血清1点05 - 1:20适当的稀释缓冲液，这取决于测定中，下列的制造的说明。这些稀释液应在运行批量样品之前，根据经验来确定。
3. 由于血清收集量低，减少了一半装载到ELISA板的样品体积。例如，大多数商业ELISA试剂盒利用的标准和样品100微升体积。为了节省标本，负荷标准50微升稀释的血清，每孔。
4. 离心机在冷冻台式离心机在200 XG 5分钟的支气管肺泡灌洗液。转移的无细胞上清液分成两个预先标记的1.5 ml离心管中并储存于-80℃。
5. 不稀释用ELISA或其他类似的分析评估BALF中细胞因子。
6. 将未使用的血清和支气管肺泡灌洗液在-80°C。

5。鉴别染色法和BAL细胞性评价

1. 以下BALF离心和完整的HBSS中去除，溶解用低渗盐水沉淀的红细胞。重新悬浮于900微升蒸馏水中的细胞。立即加入100微升10倍的PBS。
2. 单独裂解每个样品。如果样品含有红细胞过多，细胞可在400×g离心5分钟，将红细胞溶解协议可以反复进行沉淀在台式离心机。
3. 确定在1毫升悬浮液的总BALF细胞含量下使用10X或20倍放大用台盼蓝染色法血细胞计数器。评估和展示这些数据作为细胞/ ml。
4. 准备材料的细胞离心涂片和鉴别染色。用铅笔或耐溶剂笔标注标准显微镜载玻片。确保滑入一个细胞离心涂片支架和漏斗。固定滑动组件中的细胞离心涂片转子。
5. 细胞离心涂片器150微升BALF中，在100×g离心5分钟。如果细胞密度过大，有效地评估细胞形态，减少降速到幻灯片的体积。允许的幻灯片空气干燥过夜。
6. 鉴别染色的幻灯片下面的生产协议。允许的幻灯片空气干燥过夜。用Permount盖玻片的载玻片并用配有20倍和40倍物镜的显微镜评价的幻灯片。
7. 收获供后续分析，其余的细胞，如流式细胞仪，电子显微镜，共聚焦显微镜，RNA提取用于基因表达的评估，和/或蛋白质提取用于蛋白印迹分析。

6。组织病理学评估

1. 准备肺部组织病理学评估。后24-48小时，福尔马林固定的腹侧定向整个充气肺和石蜡包埋。切产生的块暴露的主要传导气道。
2. 以提高评分的精度，定位在相同位置的肺和修剪每个块以得到吨的最大纵向的可视化他肺内主要轴向气道。从这个角度，切5微米连续切片和染色用苏木精和伊红（H＆E）。额外的部分可以被切割，并使用标准方案制备用于原位杂交。
3. 使用基于以下的炎性参数，这些参数计分0（不存在）和3（重度）之间的半定量评分系统评价组织病理学:单核和多形核细胞浸润;气道上皮细胞增生和损伤;外渗;血管周围和peribroncheolar袖套;和涉及炎症的肺的百分比。肺组织病理学应该由有经验的病理医师进行评估。
4. 平均的所有参数的分数，以产生一个总的组织病理学得分或使用个人的分数量化疾病进展的特定方面。进行所有得分在双盲的方式，与审稿蒙蔽两个基因型和治疗。此评分系统已经前情Ÿ描述^6,7,10。

Results

革兰氏阴性菌的细胞壁是由LPS，这是环境中的高丰度的。 LPS的敏感人群吸入加剧气道反应性，并能引发强烈的免疫response11的。 LPS也是在小鼠模型中用于引发一个健壮的先天免疫反应的共同PAMP。在这里描述的协议中，小鼠接受LPS的剂量是孤立的从大肠杆菌埃希氏菌 （血清型0111:B4）使用口咽IT管理。在LPS暴露的车型，无论是体温和体重是动物发病和病情恶化的典型的替代指标。在LPS刺激会引起体温显著下降的最初6小时内，这将逐渐增加返回到基线在24小时（ 图1A）的过程。然而，体重将稳步下降超过24小时的过程中（ 图1B），在那里将达到顶峰，逐步恢复了n个分机48-72小时。因此，体温是一个比较合适的标记物来评估炎症引发的早期阶段;然而，在后来的发病机制和恢复阶段的体重是更可靠的。

气道LPS暴露将导致白细胞的显著涌入到肺部。内的最初6小时，与宿主先天免疫应答有关的细胞可以在BALF中（ 图1C）进行观察。在BALF细胞含量不断增加，在未来24-48小时...

Discussion

成功地评估在小鼠肺部宿主的免疫反应中最关键的步骤如下:1）选择合适的小鼠品系，性别为被评估的模式; 2）优化PAMP输送到肺部; 3）正确收集和处理的支气管肺泡灌洗液; 4）固定好，并准备对肺组织病理学评估。

小鼠品系的选择是在评价宿主免疫反应的重要因素。 C57BL / 6小鼠通常被认为是最佳的鼠标背景用于研究天然免疫由于大多数的PAMP其Th1型偏斜和强有力的反应。同样地，BALB / c小鼠通常用于研究过敏性疾病模型，由于其Th2的倾斜。在肺癌模型的第三个常用的应变是老鼠的129SvEv背景下，由于产生转基因动物的共同使用。在所有情况下，应谨慎在实验设计和只要有可能，年龄和性别马应采取tched升的队友控制的动物应该用于与野生型动物比较转基因小鼠的研究。典型地，对于LPS协议描述这里，6-12周龄的性别相匹配的C57BL / 6小鼠，应使用与应权衡至少为20克。这可能是LPS暴露将导致高水平的发病率和死亡率在敏感的小鼠品系或基因型。如果发生这种情况，则可能需要调整一些方面中，此协议，包括降低了LPS的剂量，使用较大的动物，并切换在实验中使用的动物的性别。小规模实验应进行初步确...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J	杰克逊实验室	库存000664
紧凑型秤	Ohaus Scale Corporation	71142845
小动物直肠温度计	Braintree Scientific	TH 5
直肠探头 用于啮齿动物	Braintree Scientific	RET 3
耳打孔	Braintree Scientific	EP-S 901
来自 E. coli 0111：B4 的脂多糖	InvivoGen	LPS-EB
1x 磷酸盐缓冲盐水	Life Technologies	10010-023
异氟醚	Baxter	40032609
气管内给药和肺充气支架	ICAP 制造	n/a
啮齿动物插管支架	Braintree Scientific	RIS 100
剪刀（钝/锐）	Fisher Scientific	13-806-2
镊子（直）	Fisher Scientific	22-327-379
镊子（45º，弯曲）	Fisher Scientific	10-275
剪刀（钝/钝）	Fisher Scientific	08-940
移液器（200 µl 容量）	Gilson	F123601
乙醇	Sigma	459844
1 ml 注射器	BD 医用	301025
10 ml 注射器	BD 医用	301604
27 G x 0.5 in 针头	BD 医用	305109
冷冻微量离心机	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 毫米气管插管，带鲁尔适配器	哈佛仪器	732836
Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14025-076
4-0 丝绸编织手术缝合线	Ethicon	A183
鲁尔到管连接器套件	哈佛仪器	721406
鲁尔旋塞套件	哈佛仪器	721664
Tygon 配方 E-3603 实验室管	Sigma	R-3603
福尔马林溶液，中性缓冲，10%	Sigma	HT501128-4L
小鼠 IL-1&β;OptEIA ELISA 试剂盒	BD Biosciences 559603
小鼠 IL-6 OptEIA ELISA 试剂盒	BD Biosciences	550950
小鼠 TNF-α;OptEIA ELISA 试剂盒	BD Biosciences 560478
血球计数器	Hausser Scientific	3520
血球计数器 盖玻片	Thermo Scientific	22-021-801
台盼蓝	Thermo Scientific	SV3008401
学漏斗夹	Fisher Scientific	10-357
细胞学漏斗	FisherScientific	10-354
滤卡	Fisher Scientific	22-030-410
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-1
盖玻片	Fisher Scientific	12-540A
细胞离心涂片细胞离心机	Thermo Scientific	A78300003
diff 快速染色试剂盒	Fisher Scientific
Permount 封固剂	Fisher Scientific	SP15-500