结合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）研究X染色体失活的分化雌​​性小鼠胚胎干细胞

通过荧光的手段原位杂交（FISH）研究细胞和组织有，自20世纪70年代后期¹引言，让研究者可以研究基因，染色质组织和基因表达在亚细胞水平。 DNA FISH经常用于细胞遗传学，染色体组型^2，癌症诊断³和植入前遗传筛查^4，并具有在分子研究^5-6中起重要作用，因为它允许在其天然环境中的核酸的检测。通过RNA鱼单细胞表达分析可以检测本地初级转录和非编码RNA的染色体被转录，并提供优势的评估在群体水平上的基因表达的其他技术，例如包括定量RT-PCR，全基因组表达分析或Northern印迹。通过可视化的RNA转录直接从原产他们的网站发起，它已经例如被注意到，基因表达是随机^7，和有时是等位基因特异性^8。在技术改进甚至允许细胞^9-11内单个mRNA分子的检测和定量。

FISH的基本原理包括的小区内的核酸杂交到由高度特异性Watson和Crick碱基配对的装置的核酸探针。该探针可以是直接或间接地检测到，从而导致可在显微镜可视化的一个信号。最初的尝试包括放射性标记的探针，基于安全问题，有限的空间分辨率和探测只有一个目标在^12-14时的能力，而这是有缺陷的。的放射性标记，其中包括荧光染料，半抗原和酶的后续发展，已经允许广泛使用FISH技术作为一种常规的分子生物学技术。将FISH探针可以被直接标记与fluorochROMES由荧光分子化学连接到核酸序列¹⁵和一体化荧光标记的核苷酸^16-19，或者所述探针可以结合的半抗原（包括生物素和地高辛），并通过半抗原缀合的特异性抗体的免疫学检测半抗原后可以间接地可视化的荧光报告分子^20-21。后一种方法允许信号放大通过使用用于增强原始信号的荧光标记抗体的若干层，并且使其中被表达在低水平RNA种类的检测。通过结合直接和间接标记技术和各种半抗原，多个目标，可以同时在同一小区内的可视化。

其中一个在鱼的协议中最重要的步骤之一是探测到目标的杂交。虽然在理论上，一个探测器将仅特异性结合其靶标，在实践中，这种特异性并不总是实现，探针可结合到同源的区域，和杂交条件并不总是理想的目标DNA区域或RNA种类。因此，特别重要的是杂交后洗涤的，因为它们可以增加对FISH程序的严格性，并且可以防止FISH探针，这将导致背景噪声较高水平的非特异性结合。如RNA分子是单链，他们可以很容易地杂交到一个FISH探针。与此相反，在双链DNA分子首先需要的变性步骤，在之后的探针可以杂交。这通常是通过加热的试样，这会导致该DNA的变性来实现。然而，这些苛刻的条件下，易碎，单链RNA分子可能会丢失。因此，结合DNA-RNA FISH需要的条件显著优化，并且更具有技术挑战性相比，只有RNA或DNA的分离检测。

在这里，我们PRESEN结合起来，同时DNA-RNA的鱼让我们来研究X染色体失活（XCI）在鉴别雌性小鼠胚胎干细胞^22-24的TA详细的协议。 XCI是一个关键的表观遗传机制，为女性胚胎发育^25，结果在heterochromatinization，因此沉默，女性^26-27个人的两条X染色体中的一个。必不可少的这个过程是在非编码RNA Xist的 ^28-30，这是由RNF12 ^22-23和REX1 ²⁴蛋白调节。Xist的表达变得期间胚胎发育中或在体外 ES细胞分化的未来失活的X染色体（Xi）的上调，并且可以沿X染色体分散，从而吸引而导致的X染色体³¹的转录关机染色质重塑酶。这个扩展的Xist RNA可以通过RNA FISH被形象化为在X染色体上的涂层一些，这也被称为Xist的云。由于雌胚胎干细胞可以失去，由于基因组不稳定的X染色体之一，我们和其他人联合聘请DNA-RNA FISH研究XCI，以确保只有稳定的核型细胞在这一重要进程^22,32的分析评估^-34。如同每分子生物学技术，几种不同的优良协议已经公布^35-38。在这里，我们提出我们的方法，从分化的小鼠胚胎干细胞，细胞固定，FISH探针由尼克 - 翻译，前处理固定细胞的标记的诱导开始允许通透和随后的探头摄取，探头到杂交目标，最后检测探头通过荧光标记的抗体。在本文提出的协议允许的忠实检测的Xist RNA和一个为期两天内的X染色体，而这种技术的基础知识可能可以适应加时赛她的系统和研究领域。

1，分化的女性胚胎干细胞诱导为诱导X染色体失活

注:被女小鼠胚胎干细胞（可根据要求）​​上涂有小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）糊化培养皿标准ES细胞的条件下生长。在这里，我们假设读者熟悉标准的细胞培养技术^39-41。为了诱导分化，在T25菜生长的ES细胞会从MEF中被分离，并在分化培养基将被镀金。

1. 从ES细胞培养物中移除ES培养基，并用细胞培养PBS洗涤两次。
2. 加1.5毫升胰蛋白酶-EDTA（预热至37℃），并培养细胞，在37℃7分钟。经过3.5分钟，摇盘轻轻向上突破的殖民地。
3. 通过添加3.5毫升分化培养基对细胞灭活胰蛋白酶-EDTA。上下吸液管的细胞，以获得单细胞溶液中，并收集在一个15毫升管。自旋为5分钟在200 XG，并收集细胞于10ml分化培养基中。
4. 添加细胞悬浮液到一个非糊化的培养皿中，并孵育1小时，在细胞培养箱中。注意:MEFs细胞将能够附着到非糊化的培养皿中，而ES细胞将保持在悬浮液中。
5. 在此期间，添加无菌盖玻片（24×24毫米）到6孔板中，添加0.2％的明胶，和孵育最少5分钟，在室温下进行。
6. 1小时后，收集的预镀的ES细胞培养物的上清液，其中将主要由非粘附的ES细胞。板ES细胞于含有盖玻片的6孔​​板。注意:使用⅙ ^日汇合T25菜6口井6孔板的。这将允许一个融合后的分化以及分化3天。每天更换培养基。对于较长的微分时间的课程，板预镀ES细胞在细菌的菜肴分化培养基，并incub吃的小区摇床整合到细胞培养孵化器。这将允许细胞形成胚状体，它可在固定前1-2天接种到盖玻片。

分化的胚胎干细胞用于后续的DNA-RNA FISH分析2。固定

1. 从分化培养移除分化培养基，并用细胞培养的PBS洗两次。注:添加的PBS小心，以防止被冲走的细胞了。
2. 除去细胞培养的PBS，固定细胞，加入4％多聚甲醛（PFA）/ PBS中，并孵育在室温下10分钟。注意:PFA是有毒的，可引起显著的健康风险被吸入或接触到皮肤或眼睛时，时。此外，PFA是致癌物质。
3. 除去4％PFA / PBS中，并洗涤盖玻片3次，用70％的乙醇。注意:正确的洗涤非常重要，因为煤灰的痕迹将与随后的鱼步骤干涉。盖玻片可以在-20℃几个月前至F被存储在70％乙醇原位杂交分析。

3，标记DNA探针的FISH实验

注:获得目的基因（最小长度> 2 kb的RNA的鱼，或> 20 kb的DNA的FISH），或BAC覆盖目的基因的DNA片段。用于RNA检测，相对于DNA的检测更小的探针可以是足够的，因为最可能的转录将导致多个转录物，它可以被同时检测到。对于单拷贝DNA链上的强烈信号，较长的探针是必需的，以便能够检测结合的半抗原有足够数量。优选地，非转录的基因组区域被选择为设计上的DNA探针。此外，使用较小的探针来检测的RNA时，它会被防止被检测的结合DNA-RNA FISH方法的基因组位点从该RNA的转录，尽管这不能完全排除。来检测鼠标Xist的 ，一个5.5kb的cDNA探针使用。对于DETX染色体上的挠度，几个BAC探针都可以使用。良好的结果已获得的BAC RP23-100E1和BAC CT7-474E4，分别位于邻近的Xist位点的混合物。根据感兴趣的基因或染色体上，多个不同的探针可能需要取得最佳的效果。只要有材料，将用于RNA-FISH工作，用无菌过滤嘴，无RNA酶H ₂ O和工作在一个干净的环境。

1. 取1的DNA微克和稀的H _{2 O}的在16微升的总体积。加入4微升地高辛或生物素标记液（见试剂），涡旋混匀，于16℃下90分钟。注:生物素或地高辛标记的核苷酸将通过缺口平移纳入。
2. 在此期间，准备G50柱以除去非集成核苷酸。取2毫升的注射器，取出模具，并添加消毒棉入注射器。加入G50球在溶液吨Ø填充注射器，将注射器在15毫升管和离心642×g离心1分钟。注意:大约80％的注射器现在应该充满G50。当重复G50少存在。
3. 90分钟后，加入40微升H ₂ O到缺口平移反应混合物，并添加反应到G50柱。添加一个空管栏下，并在离心642×g离心2分钟。通过在一个反应​​管中收集的流动。
4. 通过用移液管测量流量的容积，并添加H _{2 O}至达到200μl的总体积。通过加入13.3微升的鲑精DNA（10毫克/毫升），13.3微升酵母tRNA（10毫克/毫升），26.7微升小鼠摇篮-1 DNA（1毫克/毫升）和28微升的2M乙酸钠，pH值沉淀出流5.6。通过涡旋混合，并加入533微升冰冷的100％乙醇。摇管中，离心16,200×g离心30分钟，在4℃下
5. 去除上清，并用70％乙醇洗两次沉淀。离心机在16,200×g离心5分钟，4℃，空气干燥沉淀。添加50微升50％+的杂交溶液中，在37℃下进行30分钟，以促进溶解。注意:标记探针可存储数年，在-20℃下注意:50 +杂交溶液中含有甲酰胺，它是有毒的，会刺激皮肤，眼睛和呼吸系统，也是致畸。

4，通透，前处理固定细胞，并用于杂交组合DNA-RNA鱼

1. 再水化的固定的细胞在盖玻片上，通过除去70％的乙醇和另外的细胞培养物的PBS于6孔板中。孵育5分钟。在重复共三次。
2. 除去细胞培养PBS中，并加入0.2％的胃蛋白酶于6孔板中，可渗透细胞。孵育6孔板中在水浴中于37℃持续4分钟。除去胃蛋白酶，和失活与无RNA酶的H ₂ O。
3. 定位后的细胞用4％PFA / PBS中温育5分钟，在室温下进行。之后fixati上，用细胞培养的PBS洗两次，每次5分钟。
4. 通过用70％乙醇温育3分钟，90％乙醇中3分钟，100％乙醇中3分钟，脱水的细胞。转让盖玻片的6孔​​板上，并空气干燥盖玻片几分钟。
5. 年龄细胞孵育盖玻片，在65℃下进行1小时的热板。
6. 加在一起，每盖玻片进行分析预杂交用鼠标COT-1的DNA FISH探针，25微升50 +杂交液，0.5μL鼠标COT-1的DNA，1微升生物素标记的Xist探头和1μl地高辛的标记的BAC探针检测X染色体上。通过涡旋混合，并在变性99℃5分钟。立即在37℃保持45分钟，以允许摇篮-1的DNA杂交，重复存在于探针的序列。
7. 老化后，发现将50μl变性缓冲液（由70％formamide/2x SSC/10 mM磷酸盐缓冲液），在载玻片上，并置于盖玻片上顶用细胞面临towarDS变性缓冲。孵育在65℃持续2分钟。
8. 通过温育在冰冷的70％乙醇5分钟加盖玻片回6孔板中，并定位后的细胞。
9. 通过随后的温育在70％乙醇脱水的细胞为3分钟，90％乙醇中3分钟，100％乙醇中3分钟。从6孔培养板除去盖玻片，并让空气干燥几分钟。
10. 发现在载玻片上预杂交探针，并孵育盖玻片上顶。放置玻片在湿盒填充50毫升50％formamide/2x SSC，孵育过夜，在37°C。

5，杂交后的洗涤和抗体介导的检测探头

1. 填6孔板用2×SSC，和预暖至42℃。隔夜培养后加入盖玻片，孵育在42℃下5分钟。
2. 除去2×SSC，和孵育盖玻片，用50％formamide/2x SSC中10分钟，在42℃下在重复共3次（共洗30分钟）。 除去50％formamide/2x SSC，并用Tris-生理盐水吐温（TST）为2×5分钟，在室温下洗幻灯片。
3. 点50微升的Tris-盐-BSA（TSBSA）每盖玻片上新的载玻片，并孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗室阻塞。
4. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。
5. 点50微升羊 - 抗-DIG抗体（以TSBSA 1:500）的每盖玻片上新的载玻片，并在30分钟内于室温下，在TST-加湿暗室第一孵育步骤孵育盖玻片倒置。
6. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。
7. 点50微升的兔抗羊抗体每盖玻片上新载玻片结合有FITC（在TSBSA 1:250），并孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗室第二孵育步骤。
8. 反式FER盖玻片回6孔板中，并洗涤2×5分钟，用TST。
9. 点50微升的山羊抗兔抗体每盖玻片上新载玻片结合有FITC（在TSBSA 1:250），并孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗室第三孵育步骤。
10. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。
11. 点50微升小鼠抗生物素抗体（在TSBSA 1:200）每盖玻片上新载玻片，并孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗室第四孵育步骤。
12. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。
13. 点50微升的驴抗小鼠抗体的每盖玻片上新载玻片结合有若丹明（在TSBSA 1:250）孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗CHAMB第五孵育步骤呃。
14. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。
15. 点50微升的山羊抗马抗体的每盖玻片上新载玻片结合有若丹明（在TSBSA 1:250）孵育盖玻片倒置时30分钟，在室温下，在TST-加湿暗室的潜伏期第六步骤。注意:在山羊抗马抗体将识别驴抗小鼠抗体;提供给研究者时，一个山羊抗驴抗体将正常工作。
16. 转让盖玻片回6孔板，洗2×5分钟，TST。用Tris-生理盐水（TS）的额外洗5分钟。
17. 通过随后的温育在70％乙醇脱水的细胞为3分钟，90％乙醇中3分钟，100％乙醇中3分钟。从6孔培养板除去盖玻片，并让空气干燥几分钟。
18. 发现一个下拉安装介质用DAPI（见试剂）在载玻片上，并加盖玻片上顶倒置。滑动密封用指甲油和通过荧光显微镜评估FISH结果（ 图1）。

采用上述协议，用于结合DNA-RNA鱼，我们已经能够以可视化的X染色体失活在鉴别雌性的胚胎干细胞， 图1示出了DNA-RNA FISH实验中，我们发现这两种Xist的 （这是一个有代表性的例子作为一个所谓的Xist RNA云在失活的X染色体上和活性X染色体一个基础转录针尖），和X染色体上，这是作为一个定点信号可见的区域中可见。注意，针尖信号中的一个位于所述的Xist云内，由此表明该Xist的云确实定位沿，并将其涂覆在X染色体上。在超过99％的细胞，我们发现使用我们的协议正确的DNA的信号（数据未显示）。相较于RNA的鱼，Xist的云使用组合DNA-RNA鱼过程看有时大，因为变性的DNA似乎占据了较大的可视面积。我们的OBtained类似的结果使用人类胚胎干细胞，人淋巴细胞和不同种类的各种成纤维细胞系，并且在同一协议已经被用于研究各种X-连锁的基因位点，其中包括Rnf12的基因的表达。此外，当这个协议被施加到未分化的雌性的胚胎干细胞，来自两个X染色体基底Xist的表达可被检测到，这表明使用该协议也表示在低水平的基因可以被可视化（数据未显示）。

图1:联合DNA-RNA的鱼在分化的雌性胚胎干细胞。本文描述的协议相结合的DNA-RNA的鱼后获得的代表性成果。 X染色体（倍CHR）是使用地高辛标记的BAC探针，它是用FITC偶联的抗体可视化（绿色符号检测人）。几乎在每一个细胞，两条X染色体检测。 的Xist RNA是用生物素标记的cDNA探针，它是用共轭罗丹明（红色信号）抗体的可视化检测。检测在失活的X染色体（Xist的云），并从积极的X染色体（Xist的精确定位）基础Xist的表达既有大Xist的积累（注意:在分化此基础Xist的表达不再是对未来活动的X染色体，因此未检出在每一个核）。细胞核经DAPI染色（蓝色）。标尺为10微米。 点击这里查看大图。

作者什么都没有透露。