荧光原位杂交（FISH）可在细胞内天然环境中检测核酸。本文介绍一种通过FISH同时联合检测RNA和DNA的实验方案，可用于研究小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活。
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本文内容
摘要
摘要
荧光原位杂交（FISH）是一种能够在细胞中检测核酸的分子技术。DNA FISH 常用于细胞遗传学和癌症诊断，可检测基因组的异常，这些异常通常具有重要的临床意义。RNA FISH 可用于检测细胞中的 RNA 分子，在基因表达调控研究中提供了重要的见解。在同一细胞中联合进行 DNA 和 RNA FISH 在技术上具有挑战性，因为适用于 DNA FISH 的条件可能对脆弱的单链 RNA 分子过于剧烈。本文介绍了一种易于应用的实验方案，可实现Xist RNA 与 X 染色体编码 DNA 的联合同步检测。该 DNA-RNA 联合 FISH 方案也可能适用于其他需要同时检测 RNA 和 DNA 的研究体系。
引言
通过荧光方法研究细胞与组织 原位 杂交（FISH）自20世纪70年代末引入以来1，使研究人员能够在亚细胞水平上研究基因、染色质结构和基因表达。DNA FISH 常用于细胞遗传学和核型分析2，癌症诊断3 和胚胎植入前遗传学筛查4，并在分子学研究中发挥重要作用5-6 因为它能够在天然环境中检测核酸。通过RNA FISH进行单细胞表达分析，可检测染色体上正在转录的天然初级转录本和非编码RNA，相较于在群体水平上评估基因表达的技术（如定量RT-PCR、全基因组表达分析或Northern印迹）具有优势。通过直接可视化源自其转录位点的RNA转录本，研究人员已发现基因表达具有随机性7，并且有时具有等位基因特异性8该技术的改进甚至实现了对细胞内单个mRNA分子的检测与定量9-11.
荧光原位杂交（FISH）的基本原理是利用高度特异性的沃森-克里克（Watson-Crick）碱基配对，使细胞内的核酸与核酸探针发生杂交。探针可通过直接或间接方式被检测，从而产生可在显微镜下观察到的信号。早期尝试使用放射性标记探针，但存在安全性问题、空间分辨率有限以及每次只能检测一个靶标等缺点12-14。随后发展出的非放射性标记物，包括荧光染料、半抗原和酶，使得FISH得以广泛应用于分子生物学常规实验中....
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方案
1. 诱导雌性胚胎干细胞分化以启动X染色体失活
注意：雌性小鼠胚胎干细胞（可应要求提供）在经明胶包被并接种小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的标准胚胎干细胞培养条件下培养。本文假设读者已熟悉标准的细胞培养技术39-41。为诱导分化，将在T25培养瓶中培养的胚胎干细胞从MEFs中分离，并接种至分化培养基中。
- 从 ES 细胞培养物中移除 ES 培养基，并用细胞培养用 PBS 洗涤两次。
- 加入1.5 ml胰蛋白酶-EDTA（预热至37 °C），于37 °C孵育细胞7分钟。孵育至3.5分钟时，轻轻摇动培养皿以分散细胞集落。
- 通过加入3.5 ml分化培养基中和胰蛋白酶-EDTA活性。轻轻吹打细胞以获得单细胞悬液，并收集至15 ml离心管中。在200 × g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于10 ml分化培养基中。
- 将细胞悬液加入未包被明胶的培养皿中，在细胞培养箱中孵育1小时。注意：MEF细胞能够贴附于未包被明胶的培养皿，而ES细胞则保持悬浮状态。
- 同时，将灭菌的玻璃盖玻片（24 × 24 mm）放入6孔板中，加入0.2%明胶，室温下孵育至少5分钟。
- 1 小时后，收集预包被的 ES 细胞培养物的上清液，其中主要含有未贴壁的 ES 细胞。将 ES 细胞接种至含有盖玻片的 6 孔板中。注意：使用 ⅙th 一个融合的T25培养瓶....
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结果
利用上述联合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）方案，我们已能够在分化中的雌性胚胎干细胞中可视化X染色体失活过程。图1展示了一个典型的DNA-RNA FISH实验示例，其中我们同时检测到了Xist（在失活X染色体上表现为所谓的Xist RNA云状信号，在活性X染色体上则表现为基础转录的点状信号）以及X染色体上的一个区域，该区域呈现为点状信号。请注意，其中一个点状信号位于Xist云状信号内部，表明Xist云确实沿X染色体定位并包被其表面。使用本方案时，在超过99%的细胞中均可检测到正确的DNA信号（数据未显示）。与单独的RNA-FISH相比，采用联合DNA-RNA FISH方法所观察到的Xist云状信号有时显得更大，这可能是由于变性的DNA占据的空间更大所致。我们已在人类胚胎干细胞、人类淋巴细胞以及多种物种来源的不同成纤维细胞系中获得类似结果，并且该相同方案已被用于研究多个X染色体连锁位点的基因表达，包括Rnf12。此外，当该方案应用于未分化的雌性胚胎干细胞时，可检测到两个X染色体上均存在基础水平.......
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讨论
联合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）在技术上具有挑战性，因为适用于DNA FISH的条件可能对稳定性较差的RNA分子过于剧烈。已有多种方法被用于在同一个细胞中同时研究DNA和RNA，从而避免了必须在同一时间使用探针同时检测DNA和RNA的需求。例如，在叠加法中，首先进行RNA FISH，对细胞成像并记录坐标；随后，使用同一张载玻片进行DNA FISH，此过程中RNA FISH的信号会丢失；完成DNA FISH后再次对细胞成像，然后将RNA FISH和DNA FISH获得的图像进行叠加。尽管该方法在几乎所有情况下均可行，因为固定后的细胞DNA较为稳定，不会受到初始RNA FISH处理的影响，但该方法非常耗时，至少需要四天时间。另一种方法是先进行RNA FISH，然后通过添加固定剂来固定RNA FISH信号，再进行DNA FISH。虽然这种方法也可行，但在固定过程中可能会损失部分来自RNA FISH的荧光信号，这尤其会影响低水平表达转录本的检测。本文所介绍的方法经过优化，可在一次FISH实验中同时检测一个RNA靶标和一个DNA靶标，其优势在于仅需两天即可在单次实验中获得可靠的结果。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢过去和现在伊拉斯姆斯医学中心生殖与发育系所有成员在过去几年中提供的有益且富有启发性的讨论。我们还要感谢三位匿名审稿人提供的宝贵反馈意见。Gribnau 实验室的工作得到了荷兰研究委员会（NWO-VICI）资助以及欧洲研究理事会（ERC）启动基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雌性小鼠胚胎干细胞 | 可根据要求提供 | ||
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | 可从E13.5胚胎中分离获得，或通过商业来源获取 例如 Millipore | ||
| 胚胎干细胞培养基 | DMEM、15% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、非必需氨基酸、0.1 mM γ-巯基乙醇和 1,000 U/ml LIF。过滤除菌后于 4 °C 保存，最多保存 2 周。 | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10099141 | |
| 青霉素–链霉素 (100x) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140-050 | |
| γ-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| 胚胎干细胞分化培养基 | IMDM-Glutamax、15% 热灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、非必需氨基酸、37.8 μl/L 单硫代甘油和 50 μg/ml 抗坏血酸 | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| 抗坏血酸 (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 细胞培养皿 | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6 孔细胞培养板 | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 细胞培养级 PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.25% (v/v) 胰蛋白酶/0.2% (w/v) EDTA 的 PBS 溶液 | Gibco | 25200-056 | |
| Falcon 管 | Falcon | 352196 | |
| 24 × 24 mm 盖玻片 | Menzle | 780882 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890-100G | 配制 0.2% 明胶/细胞培养 PBS 溶液，并进行高压灭菌 |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7000 | 用 0.01 M HCl (pH 2.0) 稀释至 0.2% |
| 无水乙醇（100%） | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | 使用无水乙醇和无 RNA 酶水配制 70% 和 90% 的乙醇溶液 |
| 无 RNA 酶水 | Baxter | TKF7114 | |
| 无菌滤芯吸头 | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| 地高辛标记试剂盒（DIG-缺口平移法） | Roche | 11745816910 | |
| 生物素标记试剂盒（生物素-缺口平移法） | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml 注射器 | BD Plastipak | 300013 | |
| 灭菌棉 | |||
| Eppendorf 管 | Eppendorf | 30120086 | |
| 酵母 tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| 鲑鱼精 DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| 小鼠 cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| Eppendorf 台式微量离心机 | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf 冷冻离心机 | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2 M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ 杂交溶液 | 50% 甲酰胺、2x SSC、50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7、10% 硫酸葡聚糖 pH 7 | ||
| 甲酰胺 | Acros organics | 3272350000 | |
| 硫酸葡聚糖 | Fluka | 31403 | |
| 10 mM 磷酸盐缓冲液, pH 7 | 加入 57.7 ml 1 M Na2HPO4 和 42.3 ml 1 M NaH2PO4；使用 DEPC 处理水并进行高压灭菌 | ||
| 变性缓冲液 | 70% 甲酰胺/2x SSC/10 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2 M Tris pH 7.5 溶液 | |||
| Tris-生理盐水-Tween 洗涤液 (TST) | 100 ml 10x 生理盐水、50 ml 2 M Tris、500 μl Tween-20，加无 RNA 酶水至 1 L | ||
| 10x 生理盐水溶液 | 将 85 g NaCl 溶解于 1 L 无 RNA 酶 H2O 中，高压灭菌 | ||
| Tris-生理盐水-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x 生理盐水、250 μl 2 M Tris、1 ml 100x BSA、3.25 ml 无 RNA 酶 H2O | ||
| BSA，纯化，100x | New England Biolabs | B9001S | |
| 羊抗地高辛抗体 | Roche diagnostics | 用 TSBSA 以 1:500 稀释使用 | |
| 与 FITC 偶联的兔抗羊抗体 | Jackson labs | 用 TSBSA 以 1:250 稀释使用 | |
| 与 FITC 偶联的山羊抗兔抗体 | Jackson labs | 用 TSBSA 以 1:250 稀释使用 | |
| 鼠抗生物素抗体 | Roche diagnostics | 用 TSBSA 以 1:200 稀释使用 | |
| 与罗丹明偶联的驴抗鼠抗体 | Jackson labs | 用 TSBSA 以 1:250 稀释使用 | |
| 与罗丹明偶联的山羊抗马抗体 | Jackson labs | 用 TSBSA 以 1:250 稀释使用 | |
| Tris-生理盐水洗涤液 (TS) | 10 ml 10x 生理盐水、5 ml 2 M Tris、85 ml 无 RNA 酶 H2O | ||
| 含 DAPI 的 Vectashield 封片剂 | Vectorlabs | H-1200 | |
| 指甲油 | |||
| 荧光显微镜 |
参考文献
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62
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