幼虫活动的测量果蝇活动监视器

Summary

本报告描述了一种使用 TriKinetics 果蝇活动监视器测量果蝇幼虫活动的方法。该设备采用红外光束来检测多达 16 只动物的运动。可以分析数据以表示运动参数，包括速率和动物在分析室内的位置。

Abstract

果蝇幼虫被用于许多行为研究，但还没有一种简单的设备来测量幼虫活动的基本参数。该协议重新利用了通常用于测量成虫活动的仪器 TriKinetics 果蝇活动监测器（MB5 Multi-Beam Activity Monitor）来研究幼虫活动。该仪器可以监测 16 个单独的 8 cm 玻璃检测管中动物的运动，每管使用 17 个红外检测光束。记录软件会自动将数据保存到计算机，记录移动次数、传感器触发时间以及动物在管内的位置等参数。然后可以分析数据以表示整体运动和/或位置偏好以及其他测量值。所有数据都易于访问并与基本的绘图和数据作软件兼容。该协议将讨论如何使用该设备、如何作软件以及如何从头到尾运行幼虫活性测定。

Introduction

果蝇作为遗传工具的使用改变了生物系统的科学知识。果蝇幼虫已被用于各种研究，包括伤害感受¹、发育² 和作为人类疾病基因研究的模型³。果蝇的活动包括一系列在不同条件下变化的行为，包括温度²、暴露于药物⁴ 和不同的基因型。然而，尽管幼虫作为模式生物被广泛使用，但还没有一种简单、标准化的方法来分析幼虫活动。目前，许多幼虫运动研究使用复杂的视频分析软件⁵。虽然功能强大，但此类自动化工具的复杂性可能会阻止尚未具备研究运动能力的实验室在他们的研究中包括信息活动参数的分析。在当前其他非自动化方法中，例如网格爬行分析，运动由人类观察者评分，这引入了主观性的可能性，并将吞吐量限制为一次^6-7 只动物。一项类似的研究使用了 5 通道爬行测定法，该测定法测量了幼虫行进一定线性距离所需的时间⁸。在这种非自动分析中，测量位移，但这不考虑起点和终点之间的非线性行程。如下所述，此处描述的方法更多地考虑了实际幼虫的运动，客观、易于作并提供强大的吞吐量。

为了在不影响准确性、效率或成本的情况下轻松研究幼虫活动行为，该方法采用了 TriKinetics 果蝇活动监测器 （DAM），这是一种通常用于研究成虫活动的设备。使用一种设备同时研究成虫和幼虫活动具有成本效益，并且可以直接比较动物在这两个生命阶段的运动。该系统具有制造商的最高分辨率，每个检测管使用 17 个红外检测光束，当传感器光束在 16 个单独的试管内破裂时，这些光束会记录幼虫活动。然后，系统会自动将记录的信息保存到计算机中，使其可用于使用基本绘图软件进行作。获得的数据表示被单个幼虫打破的光束（可以转换为速率）、幼虫停留在检测器光束内的移动以及记录期间动物在检测室内的位置（允许计算位置偏好）。该系统高效且作相对简单，并为任何研究果蝇幼虫的实验室带来了高度可重复的基本活性分析。

为了证明该测定的强大功能，提供了数据，表明其用于验证由环境温度变化引起的活性差异，以及通过将先前描述为低活性 （IAV¹）⁹ 的突变体与广泛分析的对照 （W¹¹¹⁸） 进行比较。

Protocol

1.准备幼虫

1. 为了分析运动或立场偏好所需的幼虫，在标准条件下生长的幼虫到所需的年龄标准使用飞食品¹¹至¹⁰测定。
2. 请通过拉伸丝印级尼龙网在漏斗网状过滤器。固定网在漏斗颈部橡皮筋。放置在一个烧杯中的漏斗。
3. 为了收集幼虫进行分析，舀一铲满包含从培养瓶觅食幼虫的食物，并用RT自来水冲洗过的筛网过滤，收集直接个人幼虫网用画笔^10。

2.准备测定管

1. 要准备堵塞试管，精心熬了4％琼脂凝胶倒入培养皿中，以1.5厘米的深度。这将提供一个插头用于管的任一侧时动物被封闭。在4％的溶液是足够致密以防止由对幼虫enetrating插头。
2. 确保管是干净，清晰之前，插入幼虫。如果不是，这可能会阻止从被记录的动作。
3. 以保证幼虫有足够的水分运动，制备含有少量的热水挤压瓶。倒置的酒瓶，仔细定位走向水槽出口和压榨轻轻地从摄像管排出的水。
4. 将瓶子口进入测试管。挤压瓶子提供水汽进入测试管，直到薄层冷凝出现在管的壁。视频1示出了幼虫移动在管与水分的适当的量。
5. 以密封幼虫在管，取出从培养皿1.5厘米厚的琼脂凝胶，并放置在一网状表面，以允许气流琼脂下方以使得琼脂塞可插入到管。按该测定管的一端插入的凝胶两次，以插入两个插头凝胶成一端。
6. 随着paintb匆忙，将一个幼虫进入管约1.5英寸深，按最近的幼虫年底到琼脂凝胶密封管。所产生的压力将迫使出琼脂凝胶的第二插头从相对端和在管内密封该动物。
7. 地方管在MB5多波束果蝇活动监视器（DAM）装置，并调整管'的位置，以使动物不能超越传感器的范围内。
8. 为了确保测定管在运输过程中不滑出设备的红外线读取帧时，通过紧固油灰的环每个管在此其接触记录装置周围将灯管保持到位。

3.测量活动

1. 在培养箱中记录活动，以防止可能由于阴影，荧光灯或温度变化在实验室发生的不准确的读数。参见图5为系统的一个建议的布置。
2. 设置一个孵化至20℃（ 见图1）。为了避免虚假记载，由于从白炽灯光源的干扰录制过程中，关掉日光灯灯光孵化器，并使用单独的LED光源，同时记录在孵化器。没有任何动物进行试验，以确保光线条件并不异常触发的传感器。应该有这个测试后无记录的移动数据。
3. 让幼虫以适应到20℃培养箱设置开始试验前5分钟。
4. 要设置DAM系统以所需记录间隔（ 如 1分钟），确保大坝系统录音软件下载到电脑主机¹²和前打开连接到录音室到PSIU接口DAM系统文件。
5. 设置所需的记录频率数据将被保存，选择首选项，然后单击上方或读取间隔选项下方，选择不同的时间框架中的数据将被存储。例如，选择阅读的间隔时间从1秒到1小时。
6. 要选择不同的参数记录数据，选择首选项，然后选择相应的框中下输出数据类型（计数，移动，位置和纠缠，见表1）。每个参数提供在管内的幼虫活性的独特的分析。
7. 要开始录制，六硼化钙用电话线将显示器连接到电源接口单元（PSIU）。该PSIU连接到电源插座。绿灯会显示相应的连接。
8. 通过通用串行总线（USB）电缆到Macintosh或Windows PC进行数据记录连接PSIU。在电脑上打开DAM SystemMB1v6x程序自动开始记录数据。
9. 后所需采集时间完成后，选择退出，那么现在退出DAM活动屏幕上;数据将在DAM系统数据自动保存。借此数据文件（ 例如 ，监控1）并拖动到一个单独的文件夹。这将从坝软件存储原始数据，使他们可以在以后进行处理。

4.准备用于数据处理（DAM FileScan）

1. 为了处理原始数据转换成可以理解的格式打开DAM FileScan应用程序并选择选择输入数据的文件夹。然后选择数据文件夹和所需文件，并选择扫描选项。最后选择的bin长到所需的读取周期。这将原始数据组织成由操作者设定的参数，程序将报告收集在该特定范围内的数据。
2. 选择输出的数据类型来分析所需要的运动设定（监控计数，移动，住）。下的额外读数菜单选择总和成箱（这是如果仓长度大于所选择的系统的读取间隔）。
3. 适当命名的文件并保存。该文件将被存储在相同的位置，从步骤3.9的文件夹。

_title"> 5。访问数据的分析

1. 为了收集平均移动，过程从第4步生成为了生成一个电子表格程序表中的原始数据，打开以前保存的文件（步骤4.3），并显示文本导入向导窗口时，选择完成打开在电子表格格式的数据文件。
   注:根据分析的数据类型，电子表格将被读取不同。通常情况下测量，研究的时间段将数字记录监视器移动或计数，而每一个人的阅读管会收到一个指定的字母。当在电子表格中查看数据，列KZ表示用于分别测定管1-16的槽。该行表示所收集的数据点。
2. 例如，如果收集在1分钟的间隔20分钟的移动，平均的20行来计算移动/分钟等测量的平均数目。

Results

图1示出了从控制第三龄幼虫的温度下反应的研究中，瓦特¹¹¹⁸的结果，使用的监控装置，以检测在七个不同的温度下在幼虫运动的差异。幼虫洗涤并如上所述放入DAM活动装置，并放置在培养箱设置为所需的温度。该装置然后使其适应环境5分钟记录开始之前。每个幼虫单独为运动在20分钟内和每分钟移动平均数分析，计算为每一个动物，平均为每组32只动物。数据进行分析，并使用电子表格程序作图。幼虫表现出显著增加活性温度从5-35℃，相应增加在5度增量，除了在这一趋势中断在20℃和25℃。

为了验证差异腠LD被控制并检测先前描述的机能减退， 不活动的幼虫（IAV ^1）突变体之间检测。数据进行了分析作为运动/分钟对每个32动物，然后计算平均值。 如图2所示 ，分析表明， 不活动的幼虫比的控制移动显著以下。而它们比第三龄幼虫小得多，第一和第二龄幼虫的活性也可测量， 如图3活性在20分钟测定每分钟三龄幼虫被证明保持整个期间相对一致（ ...

Discussion

果蝇幼虫的活性是由多种因素，包括基因型^8,13年龄和环境温度²的影响。虽然能够非常详细的分析，强大的录像制品的方法已经开发了那些谁学习运动^5，这种详细程度可能是多余的为那些谁希望确定活动的基本参数。这里介绍的方法采用的设备是许多实验室使用，操作方便，产生高重现性的结果，即使是对于那些主要的研究重点是不运动管理。的例子的结果表明，该法可用于检测幼虫经受不同的温度（ 图1）和不同基因型（ 图2）运动性显著变化。

当幼虫，测定在温度范围从5℃ - 35℃，其活性随温度的，除了在20℃至25℃（ 图1）的趋势休息。已经表明通过艾因斯利及其同事认为觅食早期第三龄幼虫喜欢在+/- 2℃的典型25℃的培养温度下。然而，当幼虫进入徘徊中旬第三龄阶段，他们更喜欢有点稍凉^2。这一发现是与观察，对于第三龄幼虫活动能力大于在20℃比25℃的一致，这表明动物测定的某些部分是中徘徊的阶段，更积极的更低...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
果蝇活动监测仪，多光束，16 管，包括电线	TriKinetics Inc.	MB5
电源接口	TriKinetics 公司	PSIU24
玻璃 80 x 5 mm 试管 （100）	TriKinetics Inc.	PGT 5x80
DAMsystemMB1v6x 数据采集软件 Macintonsh OSX （Intel）	www.trikinetics.com< / a>		免费下载
DAMFileScan 108x Macintosh 软件	www.trikinetics.com< / a>		免费下载
USB软件（PSIUdrivers.zip）。	www.trikinetics.com		免费下载
DAMSystem Notes 308	www.trikinetics.com		免费下载
蔡司 Stemi 2000C- 立体显微镜	光谱服务	SP-STEMI2000C-BS
二氧化碳	缅因州氧		麻醉
Fly Pad	Genesee	59-114	用于分拣麻醉苍蝇的表面
小油漆刷	温莎 &Newton	#2 ROUND	或类似产品，用于分选麻醉苍蝇
丝网印刷网 （160）	msj-gallery.com	SM160W63-3YD	方案中使用的孔径为 ~ 0.1 毫米
Tegosept	Genesee	20-258	防腐剂
乙醇（190 proof）	Pharmco	111000190	用于溶解 Tegosept
6 盎司方底瓶 （PP）	Genesee	32-130
"Flugs"用于塑料苍蝇瓶	Genesee	49-100
果蝇小瓶，宽 （PS）	Genesee	32-117
用于宽塑料小瓶的 Flugs	Genesee	49-101
黄色脱发玉米粉	金牌
蝇琼脂	LabScientific	FLY 8020
面包酵母 - 红星	亚瑟王面粉	1270
粒糖 - 超细	多米诺