体内基因转移到雪旺细胞在啮齿动物坐骨神经电穿孔

髓鞘允许感觉和运动信息在周围神经系统中快速传递，髓鞘由髓鞘雪旺细胞 （SCs） 形成¹。髓鞘对轴突的绝缘使盐化传导成为可能，从而增加神经冲动的速度。在髓鞘发育或维持受损的疾病中，神经传导速度降低。这会导致涉及运动和感觉功能障碍的神经病变。尽管有许多关于周围神经系统中髓鞘形成和脱髓鞘的分子机制的研究，但参与这些过程的众多蛋白质的作用仍不清楚。

为了研究体内 SC 髓鞘形成/脱髓鞘的分子机制，已使用遗传方法来修饰动物的基因表达。一种有效的方法是使用敲除/敲除或转基因动物。然而，这些动物的产生既昂贵又耗时。对于 SC 特异性基因作，需要将絮凝菌株与 Cre 小鼠或其他条件基因表达方法杂交。这同样是费力且耗时的。近年来，一项尖端的遗传技术 CRISPR-Cas9 系统使转基因小鼠的生成速度大大加快（约 4 周）^2,3，但这种方法受到靶序列限制的阻碍，并受到脱靶效应的影响。作为一种替代方法，病毒载体介导的基因转移是在体内实现基因转移到 SCs^4-6 的更快、更容易的方法。事实上，病毒载体的生成成本更低，时间更短（几周内），并且只需将工程化病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒 （AAV） 载体和慢病毒载体）注射到坐骨神经中即可实现 SCs 的基因作。由于这些病毒载体具有不同的特性，因此用户必须选择最适合其目的的病毒载体。腺病毒载体感染年轻和成熟坐骨神经中的轴突和 SC。特别是，腺病毒载体对非髓鞘 SC 的选择性高于髓鞘 SC。腺病毒可引起免疫反应，因此，应使用免疫缺陷菌株⁵。AAV 载体是目前使用最广泛的病毒载体，允许体内基因转移，毒性较低⁷。AAV 可以通过直接注射到神经纤维中来转导轴突和 SC^8,9。然而，AAV 介导的蛋白表达通常需要 3 周或更长时间才能达到最大水平^7,9。因此，很难分析髓鞘形成，髓鞘形成在出生后两周内积极进展。慢病毒载体对髓鞘 SC 的选择性高于非髓鞘 SC，并且对坐骨神经没有毒性作用。然而，慢病毒载体不会感染更成熟神经中的 SCs⁵，因此不适合分析脱髓鞘过程等事件。

电穿孔是另一种更快、更容易实现体内基因转移的方法。据报道，当电穿孔应用于横切的大鼠坐骨神经时，可以实现 SCs 的体内转染¹⁰。然而，由于这种方法需要神经横断进行基因递送，因此应用仅限于分析受损神经。在这里，我们描述了一种替代方法，该方法允许使用电穿孔¹¹ 将转基因递送到完整大鼠坐骨神经中的髓鞘 SC 中。这种方法需要质粒构建，通常可以在一周内完成。然后，通过简单地将电脉冲传递到坐骨神经上注射质粒 DNA 的部位，可以在新生儿和更成熟的动物中实现髓鞘 SC 的高度选择性转染。通过电穿孔多个质粒，可以轻松实现多种基因的同时表达。同时表达多个分子的能力，如信号蛋白、短发夹 RNA （shRNA） 和功能探针，对于研究髓鞘形成和脱髓鞘等复杂过程至关重要。本文中描述的新型体内电穿孔方法将是一个强大的工具，使研究人员能够分析多种分子的功能及其在髓鞘 SCs 中的相互作用。

研究利用老鼠是按照由东京大学的动物福利委员会制定的准则。

质粒DNA的1.Preparation

1. 由亚克隆的cDNA或shRNA序列插入用于哺乳动物细胞¹²的表达质粒产生用于体内电穿孔的DNA质粒。使用巨细胞病毒立即早期增强和鸡β肌动蛋白启动子融合（CAG）启动子驱动的质粒^13，因为它允许强大和稳定的表现。要CAG启动子的控制下的shRNA的表达，使用基于mir30-shRNA的盒系统，用于亚克隆shRNA的^14。
2. 纯化的质粒DNA使用根据制造商的说明加厚-prep试剂盒，和重悬带的HEPES缓冲盐水（140mM的氯化钠，0.75毫_的 Na ₂ HPO _4，25mM的HEPES; pH值7.40）的DNA。调节DNA的浓度为≥4微克/微升。
注意:质粒DNA的最佳组合物应根据各质粒的转染效率来确定。

2，手术器械和盐水消毒

1. 高压釜的手术器械和0.9％NaCl溶液。

3.玻璃微的制备

1. 拉用吸管牵拉玻璃吸管。切移液器的尖端的直径为30-50微米。使用以下参数:热火，600;速度，50;时间，75。

4.动物外科手术，DNA注射和电

注:以上鉴于这一步骤的图1中描述。虽然幼鼠的程序在这里描述的，该方法也适用于用同样的步骤比较成熟的动物。

1. 麻醉用异氟烷大鼠中诱导框直到动物变成通过调节氧气流至0.4升/分和异氟醚浓度为4％（体积/体积）不动。执行脚趾捏，确认正确的麻醉。
2. 把大鼠上的预热加热器双目显微镜下，并通过经由面罩连续施用异氟烷维持麻醉。调节氧气流至0.2升/分和异氟醚浓度为2％（体积/体积）。使用眼药水防止眼睛干涩，如果动物的眼睛是睁开的。
3. 修复手术胶带腿。
4. 清洁与碘伏后大腿的皮肤，使用手术刀切开。
   注意:如果手术区域覆盖用H刮手术领域空气。
5. 通过创建股四头肌之间的开口了大腿肌肉和股二头肌与缝纫针暴露坐骨神经。
6. 湿用0.9％的NaCl溶液中的神经。吸收多余的水用不起毛的纸。
7. 插入玻璃微量的基部到柔性管，并且通过轻轻吸填充的DNA溶液（至少一个微升）到微量的足够量。
8. 通过轻轻拉动使用针神经的前端侧抬起的露出神经。
   注意:不要施加张力的神经，以尽量减少机械应力。
9. 将玻璃微插入神经 ​​的末端位置，并注入通过施加压力将DNA溶液（由吹入软管的开口端即 ）。直到神经显示为绿色（1微升最大）注射DNA溶液。因为微量的频繁插入可能损伤神经，不要插入微量的两倍以上。
10. 放置TWE察型铂电极约1-2毫米除了神经。填充电极和用0.9％NaCl溶液的神经之间的差距。
    注意:不要用电极保持神经，以避免对神经的机械应力。
11. 应用电脉冲来使用与所述电极的电穿孔注射部位。第一个脉冲集后，反转电极和应用其他脉冲集。使用下面的参数:电压，50伏;脉冲持续时间，5毫秒;脉冲间隔100毫秒;脉冲数的4倍。
12. 清理电穿孔部位用0.9％NaCl溶液。
13. 重复步骤4.4-4.11对侧坐骨神经。

5.后电

1. 关闭与氰基丙烯酸酯胶的切口。
2. 干燥涂胶后，请用碘伏伤口。
3. 松开从面罩的小狗。暖小狗上至少一个小时一个温暖的，以便允许它完全从麻醉中恢复。 ðO不可离开小狗无人看管，直到它已经恢复了足够的意识。
4. 从麻醉中苏醒后，返回小狗母亲老鼠。不要返回小狗，直到完全康复。

6.后手术

1. 众议院幼鼠在笼子里，直到进行实验^11（ 见图3的例子）。辖卡布洛芬（5mg / kg的; IP），非甾体抗炎药，或叔丁啡（0.1毫克/千克，SC），阿片类镇痛剂，如果需要的话。
   注意:如果大鼠小狗不生长良好或炎症围绕手术部位观察到的，排除在实验动物。

用红色荧光蛋白（RFP）转染的坐骨神经-expressing质粒的一个例子示于图2A。细胞呈现两极形态，旺的特征，分别用稀少转RFP。在轴突中没有检测到RFP的荧光。我们通常会发现〜每一根神经100转旺。这种转染效率似乎类似于使用慢病毒载体4 的体内的SC感染效率。

免疫染色实验表明，大多数（〜96％）RFP阳性细胞在P7共标记为S100中，一个SC标记（ 图2B），和标记的共同为MBP在P14 RFP阳性细胞91％，一髓鞘形成SC标记（ 图2C），这表明通过电穿孔该基因转移为脱髓鞘旺高度选择性。

多个基因的导入旺<eM>体内会调查髓鞘形成/脱髓鞘的机制是非常有用的。这里所描述的体内电穿孔方法的主要优点是能够以简单的程序传送的多个基因的能力。图2D示出了具有使用体内电穿孔的GFP和RFP表达质粒的混合物转染的坐骨神经的代表图像。约97％的SC都是GFP和RFP双阳性，提示多基因的高效交付可以简单地通过电穿孔多质粒的混合物来实现。

在啮齿类动物中，髓鞘开始围绕生育，出生后的头两个星期期间急剧增加，然后逐渐减少。因此，通过在这些发育时间窗遗传操纵旺，髓鞘的这些不同阶段所依据的机制可以澄清。慢病毒载体是一个好工具nalyzing髓鞘化，尤其是因为他们有毒性最小，但慢病毒只感染新生儿坐骨神经5,6。相比之下，当转染在P3（ 图2E，顶部）或P14（ 图2E，底部）进行电穿孔介导的基因转移效果很好。

体内电穿孔法新颖的应用说明如下。 图3A显示绿色荧光蛋白表达在不同发育阶段（P7，P14，P21和P31）髓鞘的SC光显微图像。通过光学显微镜分析，形态参数，如长度和直径的变化，可以进行评估。注意，相比于完整的大鼠末梢神经15,16，这些参数具有相似的值，这表明电神经发展而不显著破坏作用。 图3B示出的LacZ-expre的电子显微镜图像ssing脱髓鞘旺。在这种情况下，LacZ基因被用作表达标记。 β半乳糖苷酶使用bluo加仑，不溶性乙醇基板，染色使得能够通过电子显微镜11,17的转染的SC的髓鞘结构的分析。在这些实验中，信号分子的作用，可通过沉默或增加它们的表达，由此允许失功能或获得性功能的影响的分析进行检测。除了 ​​固定的组织的分析， 在体内电介导的基因转移也可以应用于实时成像实验。例如， 图3C示出了髓鞘形成的SC共表达的G-GECO1.1 18，绿色荧光细胞内的Ca 2+指示剂，和R-GECO1mt 19，红色荧光线粒体的 Ca 2+指示剂。通过表达这些指标，我们确定，其控制在髓鞘形成雪旺细胞溶质和线粒体的 Ca 2+浓度信号通路 。因此，本方法可用于研究各种信令机制，特别是当遗传编码荧光探针可用于检测感兴趣的信号。

图 1: 在 I N体内 电穿孔法首先，将麻醉大鼠的坐骨神经示意图露出。第二，质粒DNA注射到坐骨神经。第三，电脉冲通过镊子状电极递送到注射部位。最后，将伤口闭合用胶水。这个程序可以在对侧的神经被重复。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3: 在体内 电 （A）髓鞘种姓发展的光学显微分析中的应用 。坐骨神经与P3表达GFP的质粒电穿孔，和分别固定在各个发育阶段（P7，P14，P21和P31）。 GFP阳性的SC的代表图像显示在左侧。平均长度和直径总结为平均±SEM（n = 3的0 - 47从右侧3神经）。髓鞘旺随着开发收益的长度和直径。 （B）用质粒编码的LacZ转染的坐骨神经的电子显微镜图像。转染的SC（白星号，左）微细地与β半乳糖苷酶的反应产物的沉淀物进行标记。 （C）和G-GECO1.1，绿色荧光细胞内的Ca 2+指示剂，和R-GECO1mt，红色荧光线粒体的 Ca 2+指示剂共转染的一个SC的图像。白色虚线矩形内的区域放大显示在右边的面板。比例尺= 50微米（A和C）;为1μm（B）。这个数字是从我们以前的出版物11修改。 请点击此处查看本图的放大版本。

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。