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非侵入性 体内生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植

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Research Article

非侵入性 体内生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植

DOI: 10.3791/56169

April 9, 2018

, ,

1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University

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In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

提出了一种利用生物发光标记细菌对肠出血性大肠杆菌 (大肠杆菌) 进行殖民化的小鼠模型的详细协议。在活体动物中, 通过非侵入性的体内成像系统来检测这些生物发光细菌, 可以提高我们目前对大肠杆菌定植的认识。

Abstract

肠出血性大肠杆菌 (肠出血性大肠杆菌) O157:H7, 是 causesdiarrhea、出血性结肠炎 (HS) 和溶血尿毒症综合征 (溶血尿毒症) 的食源病原体, 可殖民到人类肠道。为了研究肠内大肠杆菌定植的详细机制在体内,必须有动物模型来监测和量化大肠杆菌的定植。通过将生物发光表达质粒转化为肠出血性大肠杆菌来监测和定量活寄主中大肠杆菌的定植, 我们在这里展示了一种小鼠大肠杆菌的定植模型。用生物发光标记的大肠杆菌接种的动物, 通过非侵入性的体内成像系统检测, 显示了小鼠强烈的生物发光信号。感染后1和2天后, 生物发光信号仍可在受感染的动物身上检测到, 这表明在寄主中至少有2天发生了大肠杆菌的殖民。我们还表明, 这些发光的肠外大肠杆菌定位到小鼠肠道, 特别是在盲肠和结肠, 从前体图像。这种鼠肠大肠杆菌定植模型可以作为一种工具, 以提高目前的知识, 肠出血性大肠杆菌的殖民机制。

Introduction

大肠杆菌 O157:H7 是一种病原体, 引起腹泻1, HS2, 溶血症3, 甚至急性肾功能衰竭4通过污染的水或食物。肠出血性大肠杆菌是一个致病性 enterobacterium 和殖民的胃肠道的人1。当出血性大肠杆菌第一次坚持宿主肠道上皮, 他们通过 III. 型分泌系统 (T3SS) 将定植因子注入宿主细胞, 该类型作为分子注射器诱导附加和谦逊 (a/E) 病变随后执行附着力 (殖民化)5。enterocyte 避嫌 (李) 致病性岛5的轨迹编码了这些涉及 A/E 病变形成的基因。

生物发光是一种光产生化学反应, 荧光素酶催化其基底荧光素生成可见光 6.这种酶法通常要求存在氧或三磷酸腺苷 (ATP)6。生物发光成像 (BLI) 允许研究人员的可视化和量化的寄主病原体相互作用的活动物7。BLI 可以通过以下生物发光细菌来表征活体动物的细菌感染周期, 它们迁移到并侵入不同的组织7;这揭示了感染的动态发展。此外, 动物的细菌负荷与生物发光信号8有关;因此, 简单直接地估计实验动物的病理状况是一种方便的指标。

这里使用的质粒包含荧光素酶操纵, luxCDABE, 这是从细菌Photorhabdus luminescens编码其自己的荧光素酶基板7,9。通过将这种荧光素酶表达质粒转化为细菌, 可以通过观察活动物中的这些生物发光细菌来监测其定植和感染过程。总体而言, BLI 和生物发光标记的细菌允许研究人员监测细菌数量和位置, 细菌的生存能力与抗生素/治疗治疗, 和细菌基因表达感染/殖民化6,7. 报告了许多致病细菌, 表达了luxCDABE操纵检查其感染周期和/或感染中的基因表达。这些细菌, 包括致肾盂肾炎大肠杆菌 10, 出血性大肠杆菌8, 11, 12, 13,致病大肠杆菌 (EPEC)8 , 柠檬酸杆菌rodentium14,15, 沙门氏菌伤寒16, 李斯特氏李斯特氏增生17, 耶尔森氏菌小肠结肠炎 18, 19,和霍乱弧菌20已被记录在案。

已开发了几个实验模型, 以促进研究肠大肠杆菌的殖民化在体外和体内21,22,23。然而, 缺乏适当的动物模型来研究肠内大肠杆菌的定植在体内, 从而导致缺乏细节。为促进对肠内大肠杆菌定植机制的研究,在体内, 建立动物模型来观察和量化活体动物的肠外培养是一种无创的方法是很有价值的。

这篇手稿描述了一个老鼠大肠杆菌的殖民模型, 使用一个生物发光表达系统来监测大肠杆菌在活寄主时间的殖民化。小鼠灌接种生物发光标记的大肠杆菌, 并在小鼠身上检测到无侵入性的体内成像系统13中的发光信号。感染了生物发光标记的大肠杆菌病的小鼠在2天后的肠道感染后显示出明显的生物发光信号, 这表明这些细菌在感染后2天后在宿主肠道内被殖民。前体图像数据表明, 这种殖民化在小鼠的盲肠和结肠中特别存在。利用该模型, 通过体内成像系统, 在活体宿主中检测出生物发光大肠杆菌的定植, 研究肠道细菌定植的详细机制, 从而促进对大肠杆菌诱发的生理和病理改变。

Protocol

注意: 根据疾病控制和预防中心 (CDC) 生物安全指导 (https://www.cdc.gov/), 大肠杆菌 O157:H7 是生物安全等级 2 (BSL-2) 病原体。因此, 所有涉及肠出血性大肠杆菌的实验程序都必须在 BSL-2 设施中进行。在进行实验时, 要穿上实验室的大衣和手套。在认证的生物安全柜 (BSC) 工作。对实验台进行70% 乙醇消毒实验。所有接触 (或潜在接触) 肠出血性大肠杆菌的仪器或设备应使用70% 乙醇或漂白剂进行消毒。污染 (或可能污染的) 废物应小心密封和蒸压。如有必要, 戴上口罩、护眼、双手套或连身裤。6周大的 C57BL/6 雌性小鼠在国立成武大学实验动物中心 (NCKU) 购买和维护。动物实验由 NCKU 的机构动物护理和使用委员会批准 (批准号 104-039)。

1. Bioluciferase 标记的大肠杆菌生成

  1. 混合50的脱氧核糖核酸 (脱氧核糖核酸), 1 ul 每10微米向前和反向底漆, 2 ul 2.5 毫米 deoxynucleotides (dNTPs), 2 ul 10x 缓冲器, 0.2 ul DNA 聚合酶, 和无菌的双蒸馏水 (ddH2O) 到最后一卷 20 ul, 以放大抗卡那霉素卡带, nptII基因24。DNA 模板来自 pBSL18024, 它是从国家 BioResource 项目 (NBRP) 购买的。PCR 条件列在表 1中, 并且底漆序列在表 2中可用。
  2. 将 PCR 产品结扎在套件协议之后的商业克隆载体上 (请参见材料表)。
  3. 将nptII基因片段从克隆向量中的NsiI和SmaI和克隆复制到 pBBR1MCS4 中, 由NsiI和ScaI从 pAKlux29中消化, 以创建卡那霉素抗性质粒,pWF27813。
  4. 将luxCDABE操纵从表达质粒9、pAKlux2、 SpeIhf和ScaI的荧光素酶和克隆到SpeI-hf和SmaI中消化 pWF278 生成卡那霉素抗性和荧光素酶表达质粒, pWF27913。
    注: 对于质粒提取物和切除片段纯化, 分别采用商业质粒萃取和凝胶萃取试剂盒。为酵素消化, 混合 100 ng 脱氧核糖核酸, 1 ul 10x 缓冲器, 1 ul 每选择的制约酵素和无菌 ddH2O 到总容量 10 ul, 并且孵化在37°c 为 2.5-3 h。
  5. 将 pWF279 质粒转化为大肠杆菌 O157:H7 EDL933 主管细胞, 用2500伏电穿孔4毫秒。
  6. 将转化后的细菌细胞在1毫升 Luria Bertani (LB) 培养基中孵育1小时, 37 摄氏度。
  7. 板上的细菌在 LB 琼脂板块补充50µg/毫升卡那霉素在37摄氏度, 16-18 小时。
  8. 第二天, 通过体内成像机检查板的发光信号。选择一个单一的殖民地从板块和文化它在3毫升 LB 补充50µg/毫升卡那霉素在37°c 16-18 h。
  9. 在无菌 ddH2O 中稀释100% 甘油, 制备细菌培养基, 使30% 甘油溶液。
  10. 冷冻卡那霉素耐药性的大肠杆菌O157:H7 EDL933 细菌, 窝藏荧光素酶质粒作为一个细菌库存的螺帽 cryovial 作为1:1 的细菌培养率和30% 甘油溶液-80 摄氏度。甘油的最后浓度是15%。

2. 生物发光大肠杆菌制备口服疫苗

注: 在图 1中介绍了大肠杆菌制备和小鼠口服饲实验程序的时间流程图, 以帮助实验性的准备工作。

  1. 条纹大肠杆菌O157:H7 EDL933 细菌将荧光素酶质粒放到 LB 琼脂板上, 其50µg/毫升卡那霉素从-80 摄氏度的库存。在37摄氏度培养 16-18 小时的细菌。
  2. 选择一个单一的殖民地从隔夜板块和文化在3毫升 LB 培养基与50µg/毫升卡那霉素 16-18 小时在37摄氏度孵化器在 220 rpm。
  3. 亚文化细菌 (1:100 稀释) 到卡那霉素 (50 µg/毫升) 含有 LB 汤 2.5-3 小时在37摄氏度孵化器 200 rpm。(例如, 添加2毫升的夜间培养细菌到200毫升 LB 培养基与卡那霉素 (50 µg/毫升) 补充)。
  4. 孵育 2.5-3 小时的细菌, 并测量 600 nm (OD600) 的光学密度值, 直到该值介于0.9 到1之间。细菌细胞数的密度约为 108菌落形成单位 (CFU)/毫升。
  5. 离心机重新培养的细菌在 8000 x g 30 分钟, 4 摄氏度。
  6. 在不搅动细菌颗粒的情况下去除上清液, 用100毫升0.9% 无菌生理盐水用温和搅拌法清洗颗粒。
  7. 重复步骤2.5 和2.6。
  8. 清洗后, 离心机的细菌培养在 8000 x g 30 分钟, 4 摄氏度, 并轻轻地丢弃上清。
  9. 将颗粒凝结成100倍, 0.9% 无菌生理盐水。例如, 如果200毫升细菌是离心, 添加2毫升正常生理盐水悬浮颗粒。
  10. 确认细菌 CFU (它应该是大约 109 CFU/100 ul 在正常盐水冷凝后) 通过10倍的系列稀释25电镀浓缩细菌。

3. 小鼠口服饲肠出血性大肠杆菌

  1. 用链霉素水 (5 克/升) 治疗6周大的雌性 C57BL/6 小鼠24小时。
  2. 24小时后, 在饲前, 改用普通饮水24小时。用常规水治疗24小时后, 小鼠可以口服饲肠内大肠杆菌。
  3. 通过拉回柱塞, 在注射器中填充 100 ul 肠出血性大肠杆菌。确保注射器内没有气泡。用手指对着注射器取出气泡。
  4. 轻轻举起动物, 小心地放在笼子的顶端。
  5. 小心地抓住老鼠的尾巴, 动物会抓住笼子的顶部, 试图离开。
  6. 用拇指和食指抓住动物颈部和背部松弛的皮肤, 以防止老鼠头部移动, 轻轻地抑制老鼠。
  7. 按住鼠标垂直位置插入饲针, 确保鼠标头固定和垂直。
  8. 将饲针插入嘴后的小鼠嘴里, 向下移动到食道和胃部。
  9. 当插入的针是在鼠标的一半或2/3 长度, 注射 100 ul 大肠杆菌, 其中包含约 109 CFU 细胞。

4. 可视化

  1. 口服饲后, 检测1和2天的发光信号。
  2. 在研究动物的生物发光信号之前, 麻醉将它们放入2.5% 异氟醚的腔内, 1.5 升/分钟氧。
  3. 等待 2-5 分钟, 直到所有老鼠失去知觉, 停止移动。动物已经准备好体内检测生物发光。
  4. 通过体内成像系统检测和成像动物的生物发光信号。请参阅5节 "数据采集" 软件操作。在成像过程中, 所有动物都在持续供应2.5% 异氟醚, 1.5 升/分氧。
    1. 单击 "文件" > "实时", 然后手动将焦点放在鼠标上。
    2. 选择曝光时间和激光强度。
    3. 单击 "获取 > 捕获"。
  5. 对于体外成像, 弄死小鼠颈椎脱位, 并清除感染小鼠的整个肠道. 用体内成像系统将肠道置于9厘米培养皿和图像中。该设置与 "体内" 映像相同, 但视图字段设置为-b。有关详细信息, 请参阅5节 "数据获取"。
    注意: 颈椎脱位的方法: 用一只手抓住尾巴, 把笼子顶部的老鼠控制住, 这样动物就能抓住笼子。将标记笔或拇指和第一手指放在头骨底部的颈部后部。用手或物体快速向前推进, 同时抑制头部, 用手握住尾巴向后拉。
    仔细检查以确认呼吸骤停, 没有心跳。

5. 数据采集

注意: 用于数据采集的软件列在材料表中。

  1. 要获取图像, 请打开软件的购置控制面板 (图 2)。
  2. 选择 "发光"、"照片" 和 "叠加"。
  3. 将曝光时间设置为 "自动"。将 Binning 设置为 "介质"。
  4. 设置ƒ/停止为1的发光和8的照片。ƒ/停止控制 CCD 探测器接收的光量。
  5. 根据感兴趣的图像字段设置视图字段。选项 "D" 可以容纳五6周大的老鼠, 并在同一时间图像。"C" 可以在一个领域中想象三6周大的老鼠。
  6. 一旦鼠标/样品准备好成像, 点击 "获取" 图像获取。
  7. 打开已获取的图像数据。
  8. 打开 "工具面板" 面板 (图 3)。
  9. 选择 ROI 工具。我们建议圆圈 (最左边的一个) 来范围在图像上的发光区域 (图 4)。
  10. 单击 "测量 ROIs" (铅笔图标) 以测量表面发光强度 (图 3)。"ROI 度量" 面板和量化值显示 (图 5)。
  11. 使用 "ROI 度量" 面板左上角的 "配置测量" 来选择所需的值/信息 (图 6), 否则单击 "导出" 以导出此数据表并另存为. csv 文件 (图 5)。
  12. 使用列 "总通量 (p/秒)" 的值作为. csv 文件中的发光强度量化。

Representative Results

我们通过口服饲对6周大的雌性 C57BL/6 小鼠进行生物发光标记的肠内毒素 (~ 109细菌细胞) 的管理。在1小时内对小鼠进行口服大肠杆菌疫苗接种后, 通过体内成像系统检查动物的荧光信号, 如图 7所示。结果表明, 饲小鼠具有生物发光标记的大肠杆菌的强烈发光信号。我们检查了2天后感染的信号。如图 8A所示, 接种了生物发光标记的野生型大肠杆菌 EDL933 的小鼠在感染后2天内显示出强烈的生物发光信号, 这表明在寄主中的大肠杆菌在2天内被殖民。我们还灌感染的生物发光标记 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD)到鼠标 (图 8A)。这个突变体在脂多糖 (LPS) 中叛逃, 已被证明可以减少在我们以前的研究中宿主的殖民化。如图 8A所示, 在ΔrfaD感染的小鼠中没有检测到发光信号, 这表明在小鼠体内没有或更少的细菌细胞被殖民。荧光信号的量化显示在图 8B中。接下来, 确定了这些生物发光标记细菌的位置。被感染的老鼠被人道地牺牲, 整个肠道都被除去。小鼠肠道2天后感染被放置在9厘米培养皿和映像前体 (图 9A)。荧光标记的 EDL933 感染小鼠的肠道组织显示, 盲肠和结肠的生物发光信号显著增加, 这表明这些荧光性大肠杆菌在感染小鼠的盲肠和结肠中被殖民2天, 在最小。相比之下, 感染了生物发光标记的ΔrfaD (图 9A),发现其肠道组织中的发光信号减少, 这与体内图像一致 (图8A).荧光信号的量化显示在图 9B中。

Figure 1
图 1: 时间轴实验准备流程图的.
概述了制备荧光大肠杆菌和预处理小鼠链霉素所需的时间。(A) 出血性大肠杆菌的准备工作。(B) 小鼠制剂。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:体内成像系统采集控制面板.
在成像样品之前, 打开 IVIS 采集控制面板。选择 "发光"、"照片" 和 "叠加"。将曝光时间设置为 "自动"。将 Binning 设置为 "介质"。设置ƒ/停止为1的发光和8的照片。ƒ/停止控制 CCD 探测器接收的光量。一旦样品准备好进行成像, 点击 "获取" 获取图像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:工具面板面板.
在图像获取后, 使用 "工具面板" 面板来量化发光强度。打开 "工具面板" 面板并图像数据。选择一个 ROI 工具来范围的图像上的发光信号。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 用于量化的样本的发光信号.
在 ROI 工具包围的图像上的发光信号区域。这里显示的所有发光信号都在红色圆圈中。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: ROI 度量.
在环绕发光信号并单击 "工具面板" 面板上的 "测量 ROIs" 后, 将显示值。柱总通量值 (p/秒) 用于生物发光强度量化。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 添加不同的量化信息.
通过单击 "ROI 度量" 面板左上角的 "配置测量", 可以选择其他所需的量化值/信息。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 在接种荧光性肠出血后小鼠的代表性图像.
口服饲在1小时内接种荧光性大肠杆菌的小鼠的代表性图像。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 2 天后用生物发光标记的小鼠的图像.
(A) 表示在感染后2天后口服饲的小鼠接种的荧光野型肠内 EDL933 和 EDL933 的图像:ΔrfaD 。(B) 对感染肠出血性大肠杆菌的小鼠的生物发光强度进行量化。误差线指示标准偏差。显示有代表性的图像。所有实验都独立进行了三次, 每次有 2-3 只动物, 误差条表示标准偏差。P 值表示通过 t 检验进行统计分析的结果。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 具有生物发光标记的大肠杆菌的感染小鼠肠道组织的图像.
(A) 接种后2天, 用生物发光标记的大肠杆菌, 小鼠被安乐死, 整个肠道组织被切除并成像前体。显示有代表性的图像。(B) 定量测定感染肠出血性大肠杆菌的小鼠肠道组织的生物发光强度。所有实验都独立进行了三次, 每次有 2-3 只动物, 误差条表示标准偏差。P 值表示通过 t 检验进行统计分析的结果。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。缩放条代表1厘米.请单击此处查看此图的较大版本.

步骤 温度 时间 周期数
初始变性 95°c 10分钟 1
变性 95°c 30秒 35
退火 58.4 °c 30秒
扩展 72°c 1.5 分钟
最终扩展名 72°c 10分钟 1
举行 4°c ∞ 1

表 1: 聚合酶链反应 (PCR) 条件

底漆名称 序列
nptII F 5 ' CCTATGCATAATAATTCCGCTAGCTTCACG3 '
nptII 河 5 ' GCTCCACCGATAATATTCCTGAGTCATACT3 '

表 2: 用于放大的底漆序列 nptII

Discussion

作者没有什么可透露的。

Disclosures

提出了一种利用生物发光标记细菌对肠出血性大肠杆菌 (大肠杆菌) 进行殖民化的小鼠模型的详细协议。在活体动物中, 通过非侵入性的体内成像系统来检测这些生物发光细菌, 可以提高我们目前对大肠杆菌定植的认识。

Acknowledgements

我们从医学研究部、美梅医疗中心 (台湾台南) 等地认识到, 帮助小鼠感染, 以及国立诚武大学实验动物中心的支持。这项工作得到了科技部长 (多数) 赠款 (多数 104-2321-006-019、105-2321-b-006-011、and106-2321-B-006-005) 的支持。

Materials

TA 克隆的克隆试剂盒 皿 用于测量细菌 C57BL/6 小鼠实验动物中心手套法
摇床培养箱YIH DERLM-570R细菌培养 
轨道摇动培养箱FIRSTEKS300细菌培养 
pBSL180nptII 基因来源
pAKlux2luxCDABE纵子来源
T&用于Yeastern BiotechFYC001-20P 
Nsi INEBR0127S用于质粒克隆 
Sca INEBR0122S用于质粒克隆 
Spe I-HFNEBR0133S用于质粒克隆 
Sma I NEBR0141S用于质粒克隆 
T4 连接酶NEBM0202S用于质粒克隆 
ExTaq TaKaRaRR001A用于 PCR 扩增
10X Ex Taq 缓冲液TaKaRaRR001A用于 PCR 扩增
dNTP 混合物 TaKaRaRR001A用于 PCR 扩增
PCR 机器应用 Biosystem 2720 热循环仪  用于 PCR 扩增
甘油SIGMAG5516-1L用于细菌储存溶液
NaClSigma31434-5KG-R用于制备 LB 培养基的化学品，10 g/L
胰蛋白胨CONDA pronadisaCat 1612.00用于制备 LB 培养基的化学品，10 g/L
酵母提取物粉末Affymetrix23547-1 KG用于制备 LB 培养基的化学品，5 g/L
琼脂CONDA pronadisaCat 1802.00化学品，用于制造 LB 琼脂
卡那霉素 SigmaK4000-5G抗生素，用于 seleciton
链霉素 SigmaS6501-100G抗生素，消除小鼠体内微生物群
EDL933 感受态细胞自制方法在补充文件中 
电穿孔仪MicroPulser用于电穿孔
电穿孔比色Gene Pulser/MicroPulser1652086用于电穿孔
高速离心机Beckman CoulterAvanti， J-26S XP用于离心细菌 
固定角转子Beckman CoulterJA25.5用于离心细菌 
固定角转子Beckman CoulterJLA10.5用于离心细菌 
离心瓶Beckman CoulterREF357003用于离心细菌 
ThermoFisher Scientific3141-0500离心瓶用于离心细菌 
Eppendorf 生物分光光度计 Plus eppendorfAG 22331 Hamburg的 OD600 值
 NCKU
实验服、人员防护
异氟醚 Panion 和BF Biotech Inc. 公司G-8669小鼠麻醉用
医药级 1ml 注射器 用于小鼠口服强饲
可重复使用的 22 G 球形尖饲针φ0.9 mm X L 50 mm用于小鼠口腔灌胃
手术  剪刀 用于小鼠实验
Xenogen IVIS 200 成像系统Perkin ElmerIVIS 光谱用于生物发光图像捕获 
Living Image SoftwarePerkin Elmer4.1 版用于量化图像数据

References

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