核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

转移性疾病是导致大多数癌症相关死亡的原因¹。尽管对转移过程进行了广泛的研究, 但对动物模型系统中肿瘤转移的可靠监测很难实现。在全身成像技术和多模态成像方法方面的最新进展使非侵入性的体内细胞跟踪^2,3,4,5。后者可作为一种工具, 监测细胞的存在、分布、数量和生存能力, 非侵入性和反复在活的动物或人类。

这里描述的方法的目的是在3D 的活体啮齿动物肿瘤模型中纵向和非侵入性的跟踪癌细胞。使用这种方法, 研究人员将能够准确量化肿瘤进展, 包括转移扩散在3D。与传统的非成像技术相比, 该方法提供了大量减少动物数量的定量数据的获取。此方法的另一项功能是, 它允许通过组织学或细胞术^3、6, 将体内成像与经过简化的下游前体分析所收获组织中的跟踪细胞进行关联。

这一方法的发展的基本原理是提供一个体内工具, 以监测和量化的整个转移过程的啮齿动物肿瘤模型。重要的是, 它的目的是尽量减少动物的使用, 同时减少动物间的变异。纵向无创全身成像是非常适合告知转移性生长, 而本身很难准确预测其发生的时间和地点. 因此, 全身3D 成像一直是方法开发的中心。为了缩小全身体内成像和潜在的下游前体组织学确认之间的比例差距, 采用了基于双模式核素荧光报告器的多尺度成像方法^{3, 6}。

正电子发射层析成像 (PET) 是目前可用的最敏感的3D 全体成像技术, 提供卓越的深度穿透和绝对量化⁷ , 分辨率为 < 1 毫米^8,9。目前, 放射性核素成像对全身水平的临床前细胞追踪可以可靠地检测到每卷100万个细胞的密度为1000个细胞的细胞⁽³,⁶ ), 并在亚毫米区域有分辨率。与活体显微术不同, 它不能检测单个癌细胞的传播, 但不需要手术程序 (例如, 如窗口室), 不限于小范围的视野, 而不是通过低组织穿透和分散。生物发光成像提供了一种廉价的替代方法, 但与散射和光吸收问题以及深度渗透率差有关, 因此在量化²中受到严重限制。荧光全身成像已被用于获取3D 图像, 但它比生物发光或放射性核素技术²更敏感。尽管如此, 荧光提供了通过细胞术或显微镜进行前体下游组织分析的机会。后者关闭了宏观全身成像 (mm 分辨率) 和荧光显微组织分析 (µm 分辨率) 之间的尺度间隙³。因此, 放射性核素和荧光模式相辅相成, 从全身水平到 (分) 细胞尺度不等。

在转移研究中, 报告基因成像非常适合于延长细胞追踪的需要。在这个应用中, 它优于直接细胞标记, 因为它是 (i) 不受标签稀释的影响, 从而不限制在跟踪时间, (ii) 更好地反映活细胞数。因此, 全身细胞跟踪对于可追踪细胞增殖或扩展体内(例如癌症研究³⁶) 的应用程序特别有用, 用于检测茎部畸胎瘤的形成。细胞研究, 或免疫细胞膨胀的量化⁵。

各种放射性核素为基础的报告基因可用²。这些酶包括单纯疱疹病毒 HSV11 胸苷激酶 (HSV1-tk), 转运体, 如碘化钠转运体 (NIS) 或去甲肾上腺素转运体 (NET), 以及细胞表面受体, 如多巴胺 D2 受体 (D2R)。NIS 是一种糖化的跨膜蛋白, 主动调节碘吸收, 例如在甲状腺卵泡细胞为随后合成甲状腺激素¹⁰。此过程由 na⁺的 symport 驱动, 依赖于由 na⁺/K⁺-atp 酶¹¹维护的细胞钠梯度。因此, 由于碘/放射性摄取链接到活动 Na⁺/K⁺渐变而不是仅仅存在传输器, NIS 比其他记者更好地反映活细胞数。传统上, radioiodide 已用于 NIS 映像。对于细胞追踪, 未被报道在甲状腺内代谢的替代 NIS radiotracers 被报告为高级⁶。最近开发的 PET 放射性 [¹⁸f] 四氟硼酸 ([¹⁸f] BF₄^-)^12,13显示优于 radioiodide⁶的药代动力学, 同时被可在高特定活动¹⁴中使用, 而不需要复杂的放射化学设施。[¹⁸F]BF₄可以通过两种不同的方法进行合成.第一种方法是基于在 BF₄与放射性¹⁸F¹²的非放射性的¹⁹F 的同位素交换。第二种方法是将¹⁸F 添加到非放射性的三氟化硼¹⁴中。报告后一种方法可产生更高的特定活动¹⁴ , 是临床前成像的首选方法。

NIS 在甲状腺组织中有很高的表达。它也表达在唾液, 泪和泌乳乳腺以及胃, 但在较低的水平相比, 甲状腺¹⁰。因此, 可以使用 NIS 来实现其他体区域的优异对比度成像。它也高度同源的人, 鼠和鼠标¹⁰。此外, 在非甲状腺细胞中没有对异位 NIS 表达的毒性报告。重要的是, NIS 也没有与宿主免疫应答相关, 无论是人类还是啮齿动物。NIS 已被用作测试启动器活动的报告基因^15,16,17和基因表达式^{18,19,20,21,22 ,23}在几个不同的上下文中。它也被用于基因治疗载体的非侵入性成像^24,25, 并跟踪心脏⁴, 造血²⁶, 炎症⁵和神经研究²⁷的细胞。最近, NIS 也被用作跟踪肿瘤转移的报告基因在体内^3,6。

总之, 此方法优于以前的技术的主要优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D在体内定位和量化转移扩散, (二) 自动化生产 [¹⁸F] BF₄^- at高摩尔活动, (iii) 通过纵向成像大幅度减少所需的动物, (四) 从随后的成像会议获得配对的数据, 从而改进统计数据, 进而进一步减少动物的使用, (v)通过细胞术或荧光显微镜在组织中确认癌细胞的内在选择.

本议定书符合联合王国 (联合王国) 立法和当地道德审查小组规定的所有要求。在遵守本议定书时, 确保程序也符合国家立法和地方道德审查小组规定的所有要求。确保所有涉及放射性的实验符合立法和当地规则, 并安全执行。

1. 肿瘤细胞的工程和表征, 以表达放射性核素-荧光融合记者-FP

注意: 为了简单起见, mEGFP A206K 缩写为 "GFP", 在本协议后面的各节中 mCherry 为 "RFP"。

1. 慢病毒载体粒子的产生
   1. 用合适的转染方法生产慢病毒北疆颗粒, 用以下四质粒染293T 细胞: (i) 报告基因编码粒 (pLNT SFFV GFP 或 pLNT SFFV nis-RFP (见补充信息), (二)第三代慢病毒载体包装质粒 pRRE 和 (iii.) pRSV, 和 (iv) 含有粒的病毒包络, e. g, pMD2 g。预混合质粒, 然后再添加到转染组合。在细胞培养罩中进行转染。
      注: 补充信息提供其他转染信息。
   2. 通过标准宽场荧光显微术评估48小时后转染成功, 筛选器设置适合所选融合记者 (nis-GFP 或 nis RFP)。
      注: 荧光信号表明了报告基因转染, 因此只是一个成功的联合转染的替代品, 而不是一个成功的病毒生产的指标。
   3. 使用注射器, 通过0.45 µm 无菌聚醚砜 (PES) 过滤器过滤, 以去除漂浮细胞和细胞碎片, 以此来获取含有病毒颗粒的上清液。转移到无菌的1.5 毫升聚丙烯反应管。在细胞培养罩中执行病毒工作, 并确保没有活病毒离开所含的环境。
2. 癌细胞系表达的转导与选择
   1. 使用从步骤1.1.3 混合 1:1 (v/v) 的纯新鲜病毒与每个癌细胞线的最佳生长培养基 (DMEM 为 MDA-MB-231 细胞和 RPMI 1640 4T1 细胞; 参见材料表为媒介构成)。在细胞培养罩中进行转导。
      注: 补充资料中提及更一般的协议。
   2. 在含有 5% (v/v) CO₂在37摄氏度 (在 6-井或12井的范围内, 使用1毫升或0.4 毫升的病毒混合物从步骤 1.2.1) 中, 具有含病毒培养基的传感器癌细胞在具有湿润气氛的孵化器中。
   3. 用荧光显微镜监测目标细胞的 FP 表达。
   4. 使用标准的区域性条件将成功的转基因单元格扩展到3-10 个单元格的比例 (请参见 ATCC MDA-MB-231 和4T1 细胞线)。
   5. 使用荧光活化细胞分选 (转基因) 纯化从非细胞中表达细胞的 NIS FP。
      注: 可作为支原体感染来源;建议在病毒生产和转导之前检查支原体, 但也应在1.3 步之后再进行。
3. 表达癌细胞系的 FP 的表征
   1. 通过标准流式细胞术确认记者表达式, 如其他²⁸所述。
   2. 按标准免疫印迹法确认报告员的完整性, 如其他^地方29 所述。
   3. 用共聚焦荧光显微镜分析细胞内融合报告的定位。
      注: 染色或共同表达的等离子膜标记⁶和随后的联合本地化分析³⁰将促进这一步骤。
   4. 分析放射性在表达细胞系中的吸收。
      注: 与现有设备兼容的任何放射性 NIS 基板都是合适的,例如碘^化同位素 (¹²³I, ¹²⁴i^-, ¹²⁵i, ¹³¹i^-), ^99mTcO₄^-, ¹⁸⁸选举事务 ₄, [¹⁸F]₃F 或 [¹⁸f] BF₄。
      1. 种子 10⁶纯化细胞在6井板在他们的最佳的成长介质 (参见材料表) 在实验之前一天。准备所有样品, 并包括控制样品: (i) "特异性控制",即nis 表达细胞预先孵化与竞争性的 NIS 基板, 以测试摄取特异性;(二) "父母细胞控制",即细胞不表达 NIS, 但接受放射性来测试父母细胞的基底吸收。
      2. 第二天早上, 用无血清生长培养基冲洗细胞一次。
      3. 在 50 kBq ^99mTcO₄或 [ ¹⁸F] BF₄^-的情况下, 在30摄氏度 (37 毫升总容积) 的情况下, 在无血清生长介质中孵化细胞。对于特异性控制, 用竞争性基底次氯酸钠 4 (12.5 µM 最终浓度) 预孵化细胞30分钟.在整个实验中保持竞争的基体浓度恒定。
      4. 收集上清和转移100µL 到一个准备好的收集管标记为 "上清"。
      5. 用含有 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}的1毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞两次。收集每个洗涤液, 并将每100µL 到一个被标记为 "wash1" 或 "wash2" 的准备好的收集管中。
      6. 通过添加500µL PBS, 其中包含 0.25% (w/v) 胰蛋白酶和0.53 毫米 EDTA, 并孵化在37摄氏度, 直到细胞分离 (使用显微镜检查可视)。将悬浮液转移到已准备好的收集管上, 标记为 "细胞"。用含有 Ca^{2 +}/毫克^{2 +}的500µL 冷 PBS 冲洗水井, 并将其添加到管 "单元" 中。通过离心 (250 x g, 4 分钟, 4 °c) 来颗粒细胞。
      7. 用正确设置的伽玛计数器为选择的放射性同位素 (这里: ^99mTc 或¹⁸F), 从每个井中计数所有四个样本类型。
         注: 由于本试验中样品数量众多, 建议使用自动衰减校正的全自动γ计数器。
      8. 通过对每个井中样品的伽玛计数进行统计分析, 确定每个井的总放射性计数。
         注: 采取 aliquoting 在步骤1.3.4.4 和 1.3.4.5, 以数字乘以10的 "上清" 和 "洗" 分数。
      9. 表达细胞放射性吸收为%Uptake, 如1所示。从三项实验中计算平均值和标准偏差。
         (1)
         注: 在这里, 记者验证实验被描述, 但非与记者相关的细胞功能 (例如增殖, 癌细胞入侵, 基因表达等) 最终是特定于应用程序和每个用户的责任。

2. 建立体内肿瘤模型

1. 仅使用体内实验中的完全特征和经过验证的单元格。每一次都用任何合适的技术 (例如荧光显微镜、流式细胞术) 检查细胞在管理之前的荧光。
2. 建立5-6 周成年雌性小鼠的肿瘤模型。使用BALB/cAnNCrl或BALB/cAnN. Cg-Foxn1^女 (BALB/c 裸) 小鼠为4T1 肿瘤模型和点头。Cg-Prkdc Il2rg ^tm1WjI/SzJ (核供应核) 小鼠 MDA-MB-231-based 肿瘤模型。在当地剃须动物并使用无菌技术。直接注入50µL 的悬浮液, 其中包含 10⁶ NIS-FP, 表达癌细胞/mL 到乳房脂肪垫之间的第四和第五奶嘴³¹。
   注: 为了提高注射准确度, 建议使用可吸入麻醉剂 (如异氟醚) (O₂) 在全麻下进行注射 (1-2% (v/v)。
   注: 肿瘤细胞的外科植入是肿瘤模型建立³¹的一种替代方法。
3. 检查注射部位的细胞在用药后和早期注射后的荧光。使用荧光火炬和过滤眼镜适合 FP 的选择。
4. 监测肿瘤的生长并检查任何临床症状 (特别是在以后的时间点)。
   注: 对于浅表肿瘤,即本协议中的原位乳腺肿瘤, 使用卡尺和平均肿瘤直径 (MTD) 的公式 = ½·(升 W)³²。

3. 使用自动放射性合成 (ARS) 平台生产 [¹⁸ F] BF ₄.

注:这里介绍了基于¹⁸F 加三氟化硼的方法自动 [¹⁸F] BF₄合成。更广泛使用的 ARS 平台 (参见材料表) 的用户可以下载在这个平台上运行自动序列所需的相应的可扩展标记语言 (XML) 文件 (补充文件)。图 1中所示的卡带版式的详细说明 (表 1), 以及 XML 序列文件 (表 2) 中每个步骤的详细说明, 以支持翻译到任何其他自动化平台。

1. 按照表 1中的说明设置 ARS 平台, 并确保它使用加载到控制计算机上的正确 XML 文件进行操作。确保 GBq 的平台放置在一个适合安全工作的化学罩中, 放射性物质的含量。
2. 通过进气藏 (V6), 吸入回旋产生的 [¹⁸f] f (通常为2-7 毫升 [ ¹⁸o] H₂O) 的 1.5-2 GBq。
3. 在阴离子交换树脂上捕获放射性 (例如季铵盐阴离子交换盒;V5 到 V4), 请在单独的小瓶 (V1) 中恢复 [¹⁸o] H₂o。
4. 洗脱 [18 f] f (反向洗脱, V5 到 V4) 进入反应器 (V8), 750 µL 0.9% (w/v) 盐水溶液 (V2), 其次为1.5 毫升乙腈 (V16).
5. 在真空和氮气流动下, 通过加热在105°c 然后120°c 为5分钟, 去除水。
6. 将反应堆温度降低到摄氏80摄氏度。
7. 将800µL 15-冠-5 在无水乙腈 (46 毫克, 0.21 毫摩尔) 到干燥 [18 f] f-通过反应堆的中心端口 (V8).
8. 添加850µL 的 BF₃。氨基酸₂在无水乙腈 (0.16 毫克, 1.13 µmol) 到反应器。
9. 反应5分钟, 同时返回室温。
10. 将反应混合物通过一个氧化铝墨盒 (V17 到 V18) 来诱捕 trifluoroborate。
11. 将反应混合物返回注射器 S2, 稀释水 (约1.6 毫升)。
12. 通过第二阴离子交换墨盒 (V19 到 V20) 将反应混合物传递到陷阱 [¹⁸F] BF₄产品.
13. 用水清洗反应堆 (约5.5 毫升)。
14. 通过氧化铝和第二阴离子交换墨盒的结果解决方案。
15. 用水冲洗注射器 S2 和 S3。
16. 用水冲洗第二阴离子交换盒, 用氮气烘干。
17. 洗脱产品 (V19 到 V20) 与1毫升0.9% 氯化钠 (V14) 入注射器 S3。
18. 将产品 (400-500 µL) 通过出口线 (V21) 转移到1毫升玻璃收集瓶。
    注意: 摩尔活动是每个放射性的一个重要方面。但是, 它的常规确定不仅耗时, 而且需要大量新合成的 [¹⁸F] BF₄, 这样它就成为了可以成像的动物数量的限制因素.为了测试结果的再现性和摩尔活动 [¹⁸F] BF₄, 建议为这一目的安排几个专用的测试运行.有关摩尔活动的详细信息, 请参阅讨论部分。

4. nanoPET/CT 表达细胞的体内成像

1. 动物制剂
   1. 在 1.5-2.0% (v/v) 异氟醚在 O₂中的麻醉小鼠, 在感应腔内的流速为 1.0-1.5 升/分钟。检查是否有足够的麻醉寻找没有踏板反射。
   2. 确保在动物眼中应用兽医软膏防止麻醉时的干燥
   3. 将鼠标移动到加热垫上, 并将鼻子放在麻醉电源掩膜中, 然后将尾部加热 (例如, 将其浸入37°c 水中或使用红外线灯)。
   4. 稀释新鲜制备的无菌过滤 [¹⁸F] BF₄^-解决方案到 5 MBq 每50µL 与0.9% 无菌生理盐水。
   5. 使用与皮下注射针连接的注射器 (标尺 29-31), 绘制100µL [¹⁸F] BF₄解决方案, 测量注射器中的放射性, 并记下测量的值和时间.
   6. 静脉注射管理50µL 的 [¹⁸F] BF₄^-解决方案进入预热后的尾部静脉。
   7. 测量注射器中剩余的放射性, 并记下测量的值和时间。在步骤4.1.7 和4.1.5 测量值之间的差异是注入剂量 (ID)。
   8. 设置一个定时器从45分钟倒计时 (PET 成像的开始时间 = 0 分钟)。
   9. 将鼠标放到 nanoPET/CT 扫描仪的床上, 确保麻醉药的供应正确地重新连接。
   10. 检查麻醉仍然完整的测试没有踏板反射。
   11. 确保鼠标按所需的方式放置在床上,例如"狮身人面像" 的位置。
   12. 根据制造商的建议安装动物监测设备,例如直肠温度探头、测量动物呼吸的探针或用于记录心电图的电极。检查所有仪器的正常功能。
       注意: 在与 NIS 放射性 [¹⁸F] BF₄^-的活体特异性测试中, 动物的图像如上所述, 然后休息, 直到放射性已经腐烂足以被视为微不足道,例如。48 h 以后, 当仅 1.3·10⁻⁶ % 剩余¹⁸F 放射性将存在于动物。在随后的成像会话中, 具有竞争性的基板₄在放射性管理之前以200毫克/千克30分钟的剂量进行管理, 并按上述方式执行成像.
2. nanoPET/CT 成像
   1. 设置所需的 CT 成像参数,例如使用 nanoPET/CT 55 kVp 管电压, 将曝光时间设置为1200毫秒, 带有一度角步进和180度投影。
   2. 设置 PET 图像采集的参数。使用静态扫描 PET 参数的持续时间为30分钟, 1:5 重合模式和 400-600 keVp 能量窗口。
   3. 倒计时时间 = 15 分钟开始 CT 图像采集。
   4. 倒计时时间 = 0 分钟开始 PET 图像采集。
      1. 如果需要序列动物影像, 让动物完全从麻醉中恢复,即在监督下恢复知觉。随后, 将其转移到维修单位。
      2. 如果这是终端成像会话, 则通过麻醉过量、二氧化碳浓度升高或颈部脱位来进行动物安乐死。

5.体内数据分析

1. 用蒙特卡罗的全3D 迭代算法重建 PET/CT 数据。确保对衰减、死时和放射性同位素衰变的校正进行考虑。有关详细信息, 请参阅制造商在使用的 PET/CT 仪器的说明。
2. 检查 CT 和 PET 图像是否正确地联合注册, 并保存数据的适当的交换格式, 如 ' 数字成像和通信在医学 ' (DICOM)。
3. 分析图像
   1. 将重建的 DICOM 文件加载到合适的图像分析软件中, 以使这些 ROIs 中的感兴趣区域 (ROIs) 和随后的 PET 信号量化得到识别和划分。
   2. 使用手动或自适应阈值对 ROIs 进行分段, 以使用适当的软件包定义 ROIs^33、34 。CT 扫描的解剖图像信息有助于指导 ROI 分配,例如表面肿瘤或肺体积。
   3. 根据制造商的指示使用分析软件, 并确保数据被校准到注入的放射性剂量, 并纠正衰减和放射性衰变。
4. 绘制显示此体内量化数据的图表。表达数据为注射剂量/容积 (%ID/毫升) 或标准摄取值 (SUV), 这是考虑到整个主体的放射性的替代措施。
   1. 计算%ID/g 值, 假设组织密度像水, 即1克/升。值得注意的是, 这种假设可能是无效的器官具有明显不同的密度, 如肺或骨骼。
   2. 计算不同的 suv 估计真正的 suv (e. g。SUVmean, SUVmax);SUVmax 对小对象更可靠, 并且比 SUVmean³⁵更常用。

6.前体分析

执行所列下游分析: (一) 在动物解剖过程中含有荧光癌细胞 (原发肿瘤和转移) 的器官的荧光成像, (ii) 放射性组织分布的测量, (iii) 组织学或 (iv.)细胞癌症器官的评估。

1. 用γ计数 (体外体内) 和体外荧光成像方法测量癌组织的放射性分布.
   1. 测量整个死亡动物的放射性, 并记下其价值和时间。
   2. 解剖动物和收获以下组织: 肺, 心脏, 血液 (使用20毫米玻璃毛细血管), 肝脏, 胃, 肾脏, 脾脏, 小和大肠, 甲状腺和涎腺, 一条肌肉从腿, 和骨头的后方股骨, 和相关和 dissectible 淋巴结和癌组织。
   3. 先测量剩余胴体的放射性, 包括尾部, 并记下测量的值和时间。
      注意: 尾部的放射性可以被认为是放射性的, 因为它是错误注射的, 因此没有达到循环;因此, 这一量的放射性是没有贡献的注射剂量。尾部放射性也作为注射质量的追溯参数。
   4. 权衡所有组织 (使用预重管)。
   5. 在日光下和荧光光下拍摄癌变器官的照片。
      注: 使用相机支架保持相机镜头和器官常量之间的距离 (或为此目的使用专用的商用仪器)。
   6. 将用于下游组织学的器官/组织嵌入 OCT 或将其浸入福尔马林中以进行固定。为其他下游应用样品准备可能不同。
   7. 准备放射性校准标准的副本,例如0 到 1000 kBq [¹⁸F] BF₄^-。
      注: 校准标准要求 (i) 将测量的计数每分钟与放射性值 (kBq) 相关联, (二) 简化衰变校正;¹⁸F^-可以替换 [¹⁸F] BF₄^-。
   8. 使用γ计数器和步骤6.1.7 中的放射性校准标准来计算所有收获组织的放射性。注意测量的时间。如果计数率太高 (即在校准标准的线性度之外或由太高的探测器死时间指示), 重新计数样品二放射性半衰期以后。
   9. 目前的数据, 无论是%ID/g 或标准摄取值 (SUV) (2)。
      SUV = (2)
   10. 根据当地废物管理规则, 丢弃不需要进行进一步下游分析的所有收获组织。
2. 根据用户的喜好和标准协议 (如其他^3,6,28), 通过细胞术或组织学分析癌症组织。

第一步需要基因工程的癌细胞的兴趣。在这里, 显示了转移的小鼠炎症4T1 乳腺癌细胞和人转移 MDA-MB-231 细胞的慢病毒载体转导的慢病毒北疆粒子携带 DNA 编码的 nis-GFP 或 nis-RFP 的结果。转导效率不同于癌细胞线 (图 2A, 左列)。然而, 所有由此产生的转基因癌细胞系选择的净度为纯度 (图 2A, 右)。共焦荧光显微镜 (图 2B) 证明了正确的等离子膜定位. nis FP 函数使用 nis 提供的放射性吸收 (图 2C-2E) 进行量化, 并显示 nis 函数和特殊性.值得注意的是, 4T1 之间没有显著的差异。GFP 和4T1。找到了表示具有类似 NIS 表达式级别的单元格行的 NIS RFP (图 2C)。

在完全体外细胞系的特征下, 建立了新生成的可追踪癌细胞系的肿瘤模型。作为一个例子, 4T1。绿色荧光蛋白-GFP 肿瘤模型是一种炎症性乳腺癌模型, 这里显示 (图 3)。在含肿瘤动物的纵向全身 PET 成像, 然后告知肿瘤进展, 包括转移扩散 (图 3B)。pet 放射性 [18F] BF4-是必要的成像和新鲜生产在早上的每一个 PET 成像会话。使用描述的 ARS 方法进行了 [18F] BF4的合成.通常情况下, ~ 1.6 GBq 18F 被用作输入, 并获得了 ~ 244 MBq [ 18F] BF4- 40.5±3.9 min (N=17)。用无线电薄层色谱法或离子色谱法对该产品进行了分析, 表明放射化学纯度为 94.7±1.4%。放射化学产量为 19.4±4.0% (衰变纠正)。

在肿瘤接种后的19天, 主要肿瘤是用 PET 明确识别出来的, 但没有发现转移。十天后 (29 天), 在所有动物的不同位置 (肺转移, 转移到不同的腹股沟和/或腋窝淋巴结) 发现了相同的肿瘤小鼠, 并进行了远距离转移。图 3中的示例显示, 肺部有大量的肺转移, 其中有几个明显的可辨认的结核, 在肺脏 (图 3B-3E)。此外, 该动物还将肿瘤的区域扩散带入腹膜壁, 并转移到腹股沟和腋窝淋巴结。肺内单个转移瘤的%ID 值 (图 3E) 差异很大, 但所占的潜在转移性结核的体积也不同。相比之下, 卷规范化的%ID/mL 值 (图 3E) 的一致性更大。这是可理解的为不同的转移在相似的发展阶段 (例如在天19和29之间开发了;图 3B)。与此相反, 原发肿瘤的归一化%ID 值低于肺转移, 这与肿瘤质量有更多的时间去进步和重塑, 包括其他细胞类型 (基质细胞, 免疫细胞) 的涌入是一致的。, 特别是在这种炎症性乳腺癌模型中。

由体内图像和癌细胞荧光 (在荧光光下进行动物解剖可见) 的指导下, 可以可靠地收获诸如淋巴结等小的深部器官, 同时评估癌变的结核含量 (图 4A)。虽然动物解剖过程中的荧光信号表明肿瘤细胞存在, 但重要的是要确保这种分类是伴随着活体放射性测量的收获组织。图 4B显示了在三种动物群中为各种组织获得的标准摄取值 (SUV), 所有这些都带有转移。内在表达器官, 如甲状腺和涎腺 (收获组合) 或胃也显示预期的高放射性摄取量。此外, 这种 NIS FP 方法允许在组织学过程中直接进行癌细胞鉴定 (图 4C)。该免疫荧光组织学的例子数据显示肿瘤血管化在4T1。GFP 肿瘤模型。这些数据还表明, NIS GFP 的记者主要居住在肿瘤细胞的血浆膜也在体内(图 4C), 从而验证摄取结果。

图1。方案详细介绍了用于生产 [18F] BF4-的自动化放射性综合平台的设置, fluorine-18-to-boron 了三氟化加法.试剂名称印在方案的各自管上。QMA 是季铵盐阴离子交换的简称, 表明所用的固相色谱分离材料。表1和2中提供了其他详细信息。请单击此处查看此图的较大版本.

图2。肿瘤细胞系的典型鉴定结果, 稳定表达 nis-GFP 或 nis-RFP。(A)指定的单元格线是使用慢病毒传输 nis 或 nis。左列显示转基因人口 (绿色或红色荧光) 与各自的父母细胞 (灰色; 4T1 和 MDA-MB-231 细胞分别)。百分比显示流式细胞术所确定的转导效率。右列显示了左列中混合种群的细胞后流场分析结果。所有细胞系被发现是 > 99% 纯为指示的 NIS 表达细胞 (流式细胞术)。(B)纯化细胞系共聚焦荧光显微术显示了在各自细胞系中的 nis-GFP 或 nis RFP 的等离子膜定位。WGA-Alexa633 被用作等离子膜标记物。(C、D)在新生成的癌细胞系中表达的 NIS FP 蛋白的功能验证。NIS 函数是使用放射性99mTcO4(50 kBq 每百万单元格) 来测量的.作为控制, 使用父母细胞和融合报告, 表达细胞的治疗之前和期间, 在检测 (特异性控制)。结果清楚地显示了所有细胞系的 NIS 功能和特异性。(E)对4T1 的功能验证。nis-FP 单元格行使用 [18F] BF4作为 nis 的放射性.所有其他条件与 (C) 相同。重要的是, 对于两个 radiotracers (图 2C和 E) 的4T1 派生的单元格线, 都获得了非常相似的相对吸收结果, 从而为体外的功能表征提供了可互换使用的合理性。表达细胞系的 FP。请单击此处查看此图的较大版本.

图3。转移跟踪的代表性结果 [18F] BF4--PET/CT 成像在一个4T1 的小鼠。GFP 肿瘤.(A) 100万4T1。在5-6 周老 BALB/c CanN 的乳腺脂肪垫中注入了 NIS-GFP 细胞. Foxn1怒江/Crl 小鼠和肿瘤生长随时间推移使用卡尺。由于癌细胞的 GFP 荧光, 使用荧光炬和合适的滤光镜也可以进行粗略的视觉识别/生长评估 (见插图)。(B/左)在19天的肿瘤接种后, 原发肿瘤 (黄虚线) 被明确确定, 但没有转移。所提出的图像是 PET 图像的最大强度投影 (MIP)。还记录了内源 NIS 信号 (白色描述符),即甲状腺和唾液腺 (Th + SG), 胃 (S), 以及在非常低的水平, 乳房和泪腺体的一些部分。膀胱 (B) 信号来源于示踪剂排泄。(B/右)29天后肿瘤接种后, 明确地发现转移: 肺中的多发性转移 (黄虚线) 以及转移淋巴结 (ILN、AxLN; 黄色箭头)。所提出的图像是 PET/CT 图像的 MIP。原发肿瘤 (黄虚线) 不仅在这个时间点的球状形状中生长, 而且还侵入了腹膜壁。(C) 3D 实现了阿凡通阈值技术, 使癌细胞的3D 表面呈现;这些被叠加到宠物保险保险。肺转移表现在白色, 转移腋淋巴结红色, 转移性腹股沟淋巴结在黄色, 和原发肿瘤侵入腹腔壁的绿松石。(D)在 (B/右) 中的 PET/CT MIP 的爆炸图像, 以表明单个肺转移。(E)放射性从3D 图像 (%ID) 中对癌变组织的吸收量进行量化, 并按各自的体积 (%ID/毫升) 进行规范化。个体肺转移对应于编号 (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

图4。可从 NIS-FP 肿瘤小鼠那里获得的前体数据的典型示例。(A)在组织收割过程中进行下游分析时, 表达肿瘤细胞的 FP 的荧光特性作为指导动物解剖的指标。作为样本, 在图 3中的动物组织,即肺有几个转移性病变和两个阳性淋巴结显示。还显示了日光摄影和荧光图像。荧光图像采用与日光图像相同的相机, 但在蓝光激发 (450±10纳米带通滤波器) 与绿色发射过滤器 (530±30纳米带通滤波器) 放置在相机镜头前。(B)在4T1 动物的不同器官 ("体内") 中放射性的分布。GFP 肿瘤 (N=3; 29 天后肿瘤接种; 5 MBq [18F] BF4-)。标准摄取值 (SUV) 的计算和价值 > 1 表明放射性的具体积累在各自的器官。数据显示特定的放射性摄取在癌组织,即原发肿瘤, 转移淋巴结 (如在荧光光下的影像和解剖识别), 肺 (被解剖为一个整体, 而不分离个别转移),以及器官内在表达 NIS,即甲状腺和涎腺和胃。(C)与图 3中所示的相同鼠标的原发肿瘤的免疫荧光组织学。原发肿瘤在被切片 (10 µm) 前被采集, 嵌入 OCT 并冷冻, 并进行染色处理。不需要抗体染色就能直接识别出表达癌细胞的 GFP。血管被染色的兔抗体对小鼠 PECAM-1/CD31 (2 µg/毫升) 和 Cy5-conjugated 山羊抗兔二级抗体。细胞核染色 2 '-(4-苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-25 '-双-1 h-苯并咪唑 (1 µg/毫升) 和样品安装在聚 (乙烯基乙醇-醋酸乙烯酯), 含有 2.5% (瓦特/v) Dabco 作为 antifade。共焦图像获得使用共聚焦显微镜与设置适合 2 '-(4-苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-25 '-双 1 h 苯并咪唑, GFP 和 Cy5。这些示例数据清楚地显示了4T1。绿色荧光蛋白肿瘤是血管化的, 但也在其程度上不同 (cf左上角)。它还表明, NIS GFP 的记者主要驻留在肿瘤细胞的血浆膜体内(嵌入), 从而验证体外吸收结果。请单击此处查看此图的较大版本.

表1。自动 [18F] BF4-合成的盒式布局的描述通过 fluorine-18-to-boron 三氟化加法方法(cf. 图 1).

表2。XML 序列文件中步骤的说明。

作者声明他们没有竞争的财政利益。