斑马鱼原代细胞的培养与转染

斑马鱼 (斑马斑马,斑马) 是一个流行的模型脊椎动物为许多领域的基础和生物医学研究¹。斑马鱼胚胎发育迅速,前子宫, 是透明的, 并适合显微镜下, 从而提供了良好的先决条件, 研究脊椎动物的发展, 在一个活生生的有机体。由于斑马鱼²的遗传驯良, 许多稳定的转基因报告线与细胞类型特异表达的各种荧光标记已建立允许观察特定的细胞群体。斑马鱼社区提供了各种各样的所谓的 Gal4-driver 线, 携带转基因表达合成 Kal4TA4 (或 KalTA3-equivalent GalFF) 基因与 Gal4-DNA-binding 领域的酵母融合到病毒转录激活域在细胞类型特异增强剂的控制下。这些驱动程序线被交叉到执行器线, 其中运载转基因由定义的上游激活序列 (无人驾驶) 融合到一个记者基因。Kal4TA4 蛋白结合到无人研究的元素, 从而激活细胞类型选择表达的报告基因^3,4。这种方法允许对双转基因动物中几乎所有可用增强因子和报告元素进行高度多样的组合研究。

然而, 在一个整体和不断变化的胚胎中, 聚焦于单个细胞或其亚型含量的深度实时成像是有限的。为了解决特定细胞生物学问题的最高分辨率, 使用细胞培养往往是可取的。斑马鱼的一些细胞线存在, 但它们被认为是重选择^5,6,7 , 他们的繁殖往往是耗时的。此外, 所有可用的细胞系都是成纤维细胞, 限制实验使用细胞培养到一种类型的单元。因此, 我们建立了一个有效和易于使用的协议, 直接从斑马鱼胚胎和斑马鱼的大脑中制备初级细胞, 以及提高文化的长寿和扩大栽培的多样性的方法。单元格类型。此外, 我们提出了一个程序, 染胚胎原细胞与表达结构的荧光细胞器标记。因此, 细胞形态和亚细胞结构可以用高的空间和时间分辨率来进行分析, 从而保持其关键特征。

这里描述的所有动物工作符合法律规定 (欧盟指令 2010/63)。养护和处理鱼类已得到地方当局和不伦瑞克技术大学动物福利代表和下萨克森国家消费者保护和食品安全办公室 (LAVES, 德国奥登堡) 的批准;亚利桑那州§4 (02.05) TSchB。

1. 斑马鱼胚胎主要细胞的制备

1. 2天后受精 (dpf) 斑马鱼胚胎的制备
   1. 1天: 根据您的斑马鱼设施经理⁸的规格, 设置几条斑马鱼菌株的通道。
   2. 2天: 交配鱼和收集鸡蛋⁸直接产卵后, 在10厘米培养皿 (塑料)。用巴斯德吸管 (塑料) 去除死亡或被污染的鸡蛋。用 Danieau 30% (5.8 毫米氯化钠) 洗鸡蛋 1x, 0.07 毫米氯化钾, 0.04 毫米硫酸镁, 0.06 毫米硝酸钙, 5 毫米 2-[4-(2-羟乙基) piperazin-1 基] 磺酸, pH 7.2)⁸与 0.0001% (w/v) 亚甲基蓝色。交换培养基到 Danieau 30% 没有亚甲基蓝, 因为亚甲蓝可能导致自体荧光, 并在28摄氏度的夜间孵化卵。
      注: 以每条鱼线的最低100个卵开始, 以获得足够数量的细胞。不要在一个培养皿中饲养超过150个胚胎。
   3. 3天: 去除死亡或被污染的胚胎, 并交换培养基到 Danieau 30%。通过计数确定胚胎数量。在28摄氏度的晚上孵化胚胎。
      注: 当使用转基因线表达荧光记者, 筛选 1 dpf 或 2 dpf 可能是必要的。
      注意: 对于更大数量的胚胎, 建议采取一个黑白图像的各自培养皿 (图 1A) 和量化的数量的胚胎与成像软件。
   4. 4天: 胚胎现在是 2 dpf。要去除 chorions, 添加1毫升链霉蛋白酶, 浓度为1毫克/毫升至10毫升 Danieau 30%⁸ , 并在室温下的振动筛上孵化胚胎, 直到所有 chorions 分离 (根据环境温度20–40分钟)。用 Danieau 30% 洗净, 去除链霉蛋白酶和 chorions, 在室温下保持胚胎, 直到进一步使用。
2. 可复用聚 l-赖氨酸镀膜玻璃底菜的研制
   注: 商用玻璃底菜仅供一次性使用, 价格昂贵。下面的过程描述了如何从标准实验室材料中准备可再用的自制玻璃底菜。
   1. 钻一个直径为10毫米的孔到标准细胞培养皿 (直径6厘米, 塑料) 的底部 (图 1B)。用自来水彻底冲洗盘子底, 除去钻孔粉尘。
   2. 在盘子底部的孔周围涂上硅脂, 然后用油脂作为胶水附着盖玻片。确保油脂密封的差距, 盘子底部和盖玻片。
      注意: 确保使用的盖玻片的厚度适合于以后的成像应用程序。
   3. 彻底清洗自制玻璃底菜, 但小心, 用冷水和肥皂。用去离子水冲洗玻璃底菜三次, 去除肥皂。空气干燥盘盖子和盘子底部并且存放他们在一个干净的箱子, 直到进一步用途。
   4. 在文化准备的天 (天 4, 看见 1.1.4): 用 70% (v/v) 乙醇滋润盘子盖子和盘子底部的里面。将碟子盖和盘子底部朝向内侧, 在一个无菌的工作台, 层流和紫外线光。空气干燥, 直到乙醇蒸发, 然后应用 UV 光20分钟。经过这种处理, 菜肴被组装和认为是无菌的。
   5. 对于涂层, 吸管200µL 的聚 l-赖氨酸 (0.1 毫克/毫升) 在每一个玻璃底部碟, 并通过打破表面张力与吸管尖端的盖玻片传播液体。让干燥60分钟, 然后洗1x 与无菌1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。取出液体。把盘子放在长凳下, 直到进一步使用。
      注: 其他涂层可根据实验目的进行测试。我们发现聚 l-赖氨酸足以支持神经元的生长, 而未经任何附加涂层处理的塑料似乎有利于成纤维细胞的生长 (图 1E, F)。
      注: 自制玻璃底碟可多次使用。要交换盖玻片, 用温水冲洗, 小心地分离盖玻片和去除剩余油脂与 70% (v/v) 乙醇和肥皂。
3. 原代细胞的制备与电镀
   1. 在文化准备的天 (天 4, 看见 1.1.4): 通过使用新鲜的塑料巴斯德吸管转移胚胎入无菌细胞培养盘 (直径 6 cm)。去除液体的步骤-明智的, 直到所有的胚胎聚集在一个大的下降直径约2厘米或更少。
   2. 将该菜与胚胎放在无菌工作台中, 添加 CO₂独立培养基 (辅以 10% (v/v) 过滤牛血清, 1 x 谷氨酰胺和 1.2% (v/v) 1万 U 青霉素-链霉素; 培养基与所有补充剂是在以下称为 "细胞培养培养基"), 直到盘子半填充。
      注: 可根据实验目的对 CO₂独立介质的替代品进行测试, 如 neurobasal 培养基、DMEM 培养基或莱博维茨 L-15 培养基。co₂-独立媒介和莱博维茨的 L-15 媒介有好处不需要 CO₂孵化器。
   3. 为了去除蛋黄, 用200µL 吸管尖把胚胎上下移。成功的 deyolking 可以被介质的混浊所识别。
   4. 用 70% (v/v) 乙醇和另一种细胞培养皿填充细胞培养皿, 新鲜细胞培养培养基。使用1000µL 吸管尖端将胚胎移植到无菌细胞过滤器 (40 µm;图 1C)。把过滤器放在手柄上, 用乙醇蘸到盘子里, 这样所有的胚胎都能被淹没5秒. 紧接着, 用新鲜细胞培养培养基将过滤器与胚胎浸泡在盘子里。
      注: 细胞过滤可多次重复使用。在自来水下用软刷子清洁, 将其贮存在70% 乙醇中, 干燥和 UV, 在使用前直接处理在无菌工作台上 (参见 1.2.4)。
   5. 将胚胎移植到无菌的1.5 毫升反应管中 (大约100胚胎在一管中)。添加胶原酶 (2 型) 在细胞培养基中稀释, 最终浓度为4毫克/毫升, 总体积为1毫升。在30转每分钟45分钟的室温下, 在垂直管转子上孵化出具有胚胎的试管。
   6. 分离剩余的细胞团块通过吹打胚胎胶原酶混合物上下与1000µL 吸管尖端。然后用排气槽 (40 µm) 过滤细胞悬浮液, 通过无菌细胞过滤器;图 1D)成50毫升锥形管。用大约10毫升的新鲜细胞培养基冲洗过滤器。
   7. 颗粒细胞通过离心3分钟在 180 x g。小球可能几乎看不见。小心地清除上清和并用重悬细胞在200µL 新鲜细胞培养培养基每30最初使用的胚胎。
      注: 要获得可见颗粒, 建议至少从100个胚胎开始。
   8. 在自制的聚 l-赖氨酸包覆玻璃底菜 (见 1.2) 的玻璃区域直接在步骤1.3.7 中获得的200µL 的细胞悬浮液吸管。在无菌工作台下, 室温下孵育60分钟。添加6毫升新鲜细胞培养培养基和孵化的主要细胞在28摄氏度。
   9. 使用28摄氏度的倒置显微镜执行所需的成像应用。每天交换细胞培养基。在电镀 (磷酸二铵) 后的几天内, 培养物可以用于成像。

图 1: 斑马鱼胚胎的原代细胞培养.(a) 1 磷酸二铵胚胎的黑白图像, 可由软件工具处理, 以分析胚胎数量。(B) 用钻孔 (直径10毫米) 制作的细胞培养皿 (直径6厘米) 用于制备可重复使用的自制玻璃底菜。(C) 使用简单手柄的细胞过滤 (40 µm) 作为 "着陆网", 将 deyolked 胚胎浸入乙醇中, 并迅速将其转移到新鲜细胞培养基中。(D) 用排气槽的细胞过滤器 (40 µm) 用于在胶原酶介导的离解后过滤细胞。(E) 在5磷酸二铵后, 在涂有聚 l-赖氨酸的玻璃上播种的初级细胞主要形成有明显扩展的神经元。缩放条 = 100 µm. (F) 5 磷酸二铵在未涂敷的处理过的塑料后, 成纤维细胞样的 overgrow 培养。刻度条 = 100 µm (E) 和 (F) 是通过 epifluorescent 显微镜获得的。(G) 在1磷酸二铵中从野生型斑马鱼中提取的初级细胞的光图像。纹状肌细胞和神经元簇可以很容易地观察到。刻度条 = 50 µm (H) 转基因线 Tg (ptf1a: eGFP) jh1 的培养细胞, 表达 eGFP 在 GABAergic 神经细胞的神经元祖体和视网膜细胞种群的子集^29,30,31. 刻度条 = 50 µm (G) 和 (H) 是通过共聚焦激光扫描显微镜获得的, 其使用的是 (B) 所示的玻璃底碟。请单击此处查看此图的较大版本.

2. 原代细胞与质粒 DNA 的转染

1. 并用重悬过滤和颗粒细胞的步骤1.3.7 中获得的 1x PBS 而不是细胞培养培养基。用台盼蓝染色整除细胞悬浮液, 以确定计数室⁹中的细胞数。
2. 将50万个细胞与10µg 超纯质粒 DNA 混合在1.5 毫升反应管中, 并用 1x PBS 将总容积调整为100µL。
   注: 在实验中, 我们主要采用了基于质粒 pCS2+¹⁰的表达结构。pCS2+ 克隆的开放阅读框架的表达是由人巨细胞病毒 (CMV 启动子) 无处不在的启动子驱动的。其他表达式构造和启动子可以测试 (请参见代表结果和图 2 和图 3)。
3. 将细胞 DNA 组合立即转移到电穿孔试管 (0.4 厘米), 将试管放在电穿孔装置中, 并 electroporate 以下设置: 一次性脉冲、指数衰减、280伏、950µF。
4. 直接电穿孔后, 将细胞 DNA 组合转化为1.5 毫升反应管, 300 µL 新鲜细胞培养基。
5. 板200µL 的细胞悬浮, 如1.3.8 所述, 并按照1.3.9 所述进行, 根据使用的表达结构, 荧光蛋白的表达可能会在几个小时或第二天检测出来。

3. 固定原细胞的染色

注意: 亚细胞结构也可以由经典的染色, 而不是使用荧光融合蛋白记者。对于斑马鱼的主要细胞, 我们使用以下标准协议, 以示范染色核, F 肌动蛋白和乙酰蛋白荧光标记。

1. 在细胞培养皿或多井板上放置的聚 l-赖氨酸涂覆的板细胞, 如上文所述 (见 1.3.8)。
2. 为修复, 去除介质和覆盖的细胞与4% 多聚甲醛在 1x PBS。在4摄氏度的振动筛上孵化细胞10分钟。用 1x PBS 在室温下洗涤细胞 3x 5 分钟。确保 1x PBS 完全覆盖单元格, 并在振动筛上执行洗涤步骤。
3. 为了阻止和 permeabilize 固定细胞, 覆盖细胞与 1x PBS 含有5% 脱脂牛奶和0.3% 海卫 X-100。在振动筛的室温下放置单元格10分钟。洗涤细胞如3.2 所述。
4. 要标记乙酰蛋白, 一个标志为轴突¹¹, 稀释主要抗体 1:2, 000 在 1x PBS 包含1% 脱脂牛奶。用这个溶液覆盖细胞, 在晚上4摄氏度的时候将它们孵化在一个振动筛上。第二天, 洗涤细胞如3.2 所述。
5. 稀释二次抗体共轭与绿色 fluorochrom 荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 1:100 在 1x PBS 含有1% 脱脂牛奶和孵化的细胞与此解决方案1小时在室温下在黑暗中 (盖碟,如一个盒子或铝箔) 在一个振动筛。洗涤细胞如3.2 所述。
6. 为了同时染色肌动蛋白细胞骨架和细胞核, 孵化细胞在 1x PBS 补充与罗丹明¹²共轭与红 fluorochrome (1:50) 和 4 ', 6-diamidino 2 苯基吲哚 (DAPI)¹³ (100 ng/毫升) 为10分钟在房间里温度在黑暗中的振动筛。洗涤细胞如3.2 所述。
7. 要准备用于成像的单元格, 请在干净的表面放置一个玻璃物体载体 (显微镜滑动) 并放置在它的安装介质上。用镊子把一个固定的和染色的细胞从盘子里拿出来, 并把它放在与目标载体面对的细胞的下落上。请确保安装介质在盖板的整个区域上扩散。让我们在黑暗中干涸吧。
8. 将固定和装入的单元格存储在4摄氏度的黑暗中, 直到执行所需的成像应用程序。

图 2: 电穿孔表达结构的转染.(A) 假定的神经元转染 eGFP 1 磷酸二铵。(B) 表达内质网靶蛋白 KDEL 的横纹肌细胞 (2 磷酸二铵)。(C) 在2磷酸二铵 MitoTag YFP 转染的神经元簇内的两个神经元。(D) 用 DCX tdTomato、MitoTag YFP 和 pCS-H2B-mseCFP 三转染的细胞 (2 磷酸二铵)。(E) pSK-无人参与: mCherry 转进入初级细胞 (1 磷酸二铵), 由双转基因胚胎携带的转基因 tg (atoh1a: Gal4TA4) hzm2²²和 Tg (4 xuas: KGFPGI) hzm3³²导致 GFP 表达后脑的神经祖细胞。刻度条 = 10 µm (E) 是通过共聚焦激光扫描显微镜获得的, 使用玻璃底部的菜肴, 如图 1B所示。(F) 5 磷酸二铵固定斑马鱼原发神经元的荧光染色。蓝色: DAPI (核);红色: 罗丹明 (肌动蛋白);绿色: 乙酰蛋白 (神经元)。刻度条 = 10 µm (G) 用做爱狂人转染的神经元样细胞。在2磷酸二铵, 没有延伸是可见的。在5磷酸二铵, 形成了突起状结构。刻度条 = 25 µm (H) 神经元, 与 (F) 中的细胞相同, 周围有成纤维细胞样的单元格。缩放条 = 10 µm (I) 从携带转基因 Tg (XITubb:D sred) zf148²⁸转染的转基因胚胎中提取的神经元做爱狂人。在12至15磷酸二铵之间, 突起发生大规模变性。刻度条 = 100 µm (fI) 的细胞在聚 l-赖氨酸涂层玻璃 (f, H) 或塑料 (G, i) 上播种, 在 L-15 培养基中培养, 在10% 过滤牛血清和神经元补充 B-27 (稀释 1:50) 和成像 epifluorescent 显微镜。请单击此处查看此图的较大版本.

4. 成年斑马鱼脑原细胞的制备

1. 脑提取
   1. 选择至少90天龄的成年鱼。如果需要使用特定的单元格类型, 请选择一个转基因线, 在该行中, 特定于细胞的荧光报告器表达式将允许可视化所需的单元格。
   2. 将鱼放在装有200毫升麻醉剂 Tricaine⁸ (0.2%) 的烧杯中, Danieau 30%。等到鱼停止移动。将麻醉鱼浸泡在装有200毫升冰水的烧杯中, 以弄死15分钟。
   3. 用 70% (v/v) 乙醇填充培养皿 (直径6厘米)。用一把镊子把鱼放在尾巴上, 然后蘸到乙醇里。确保鱼完全浸入乙醇中5秒。
   4. 根据古普塔和马林斯¹⁴的协议提取大脑, 以下 adaptions: 只使用蒸压或无菌包装的工具, 在无菌 1x PBS 中解剖头部。
   5. 直接提取后, 将大脑放置在培养皿中 (直径3厘米), 填充无菌 1x PBS, 并将菜盘置于无菌的工作台内进行细胞培养。
2. 原代细胞的脑分离与电镀
   1. 放置两套无菌镊子 (蒸压), 一种无菌培养皿 (直径6厘米), 填充 70% (v/v) 乙醇, 一个无菌培养皿 (直径10厘米) 填充莱博维茨的 L-15 培养基补充 10% (v/v) 过滤牛血清, B-27 (1:50) 和 1.2% (v/v) 1万 U 型青霉素-链霉素和一个带手柄的无菌细胞过滤器 (40 µm;图 1C)在干净的长凳下。
   2. 将细胞过滤器放入充满乙醇的培养皿中, 确保液位至少比滤网底部高5毫米。
   3. 使用第一套镊子, 将大脑转移到已经放置在乙醇中的过滤器中, 并确保它完全被液体覆盖。1秒后, 将过滤器与大脑转移到含有莱博维茨 L-15 培养基的培养皿中, 上面描述的补充剂。
   4. 使用第二套镊子, 将大脑转移到一个无菌的1.5 毫升反应管填充500µL 莱博维茨的 L-15 培养基与上述补充。将胶原酶 (2 型) 添加到最终浓度为4毫克/毫升的总体积为1毫升。
   5. 在30转每分钟35分钟室温下, 在垂直管转子上孵化管。用1000µL 吸管尖端机械地将剩余的组织团簇吹打, 以帮助离解过程。
   6. 当没有可见粒子停留在溶液中时, 停止离解。通过带有排气槽的无菌滤池过滤细胞悬浮液 (40 µm;图 1D)成50毫升锥形管。用大约10毫升的新鲜细胞培养基冲洗过滤器。
      注: 当单细胞悬浮液达到时, 过滤步骤就不像胚胎分离那样必要了。大脑是一种软组织, 因此它更容易被均匀地分离成单细胞悬浮。
   7. 颗粒细胞通过离心5分钟在 180 x g和并用重悬细胞颗粒成1毫升新鲜莱博维茨的 L-15 培养基与上述补充。
   8. 吸管500µL 细胞悬浮 (50% 获得的细胞) 在一个自制的聚 l-赖氨酸镀膜玻璃底菜 (见 1.2) 或在一个井的24井板。缩小在较小的表面 (即, 96 井板的井的125µL 溶液) 的情况下。在无菌工作台下, 室温下孵育60分钟。然后添加必要量的新鲜培养基填充特定的容器和孵化的主要细胞在28摄氏度。
   9. 使用28摄氏度的倒置显微镜执行所需的成像应用。培养基可以在电镀后几天用于成像。每天更换50% 的培养基。

图 1G显示了一种典型的从野生型胚胎中提取的具有纹状细胞和神经元样细胞簇的透射光图像。为了更容易地识别某些细胞类型, 可以使用具有细胞类型特异表达的荧光蛋白的转基因线 (图 1H)。

转染 pCS2+-based 质粒11将增强的绿色荧光蛋白 (eGFP)15转化为野生型胚胎的初级细胞, 在1磷酸二铵中产生强烈的荧光信号 (图 2A)。通过转染 pCS2+-based 质粒编码荧光细胞器标志物, 如内膜-靶向红荧光蛋白 (ss-RFP-KDEL)16或线粒体靶向黄色荧光蛋白 (MitoTag YFP)17, 18、亚细胞结构可以很好地可视化 (图 2B, C)。共转染多达三种质粒, 允许同时分析几种荧光融合蛋白在同一细胞19 , 如 MitoTag YFP 与微管标记人类 Doublecortin (DCX) 的亚单位定位。20融合到红色荧光蛋白 tdTomato21和核标记组蛋白 H2B 融合到青色荧光蛋白 (H2B-mseCFP)22,23 (图 2D)。亚细胞结构也可以成像高时间和空间分辨率, 如囊泡阳性的运动, 膜标记囊泡相关膜蛋白 1 (VAMP1) 融合到荧光蛋白 mCitrine24,25 (图 3)。通过用明亮的荧光蛋白 (如做爱狂人26 ) 的表达来标记整个细胞, 可以很容易地观察到形态学的变化 (如图 2G, I)。然而, 成功地转染了一个基于 pBluescriptSK 主干编码的红荧光蛋白 mCherry27融合到一个无人驾驶细胞元素到一个由双转基因胚胎, 携带一个 Gal4 驱动程序的主电池构造和无人攻击效应构造表明, 电穿孔协议也适用于组合遗传学 (图 2E)。此外, 固定的主要细胞可以很容易地染色使用免疫荧光和细胞器特定的荧光染料 (图 2F, H)。

图 3: 亚细胞结构的时间推移成像.用 pCS-VAMP1-mCitrine 转染的野生型细胞 (1 磷酸二铵)。所选帧的时间推移记录 (1 帧被采取每1.68 秒) 显示。箭头头和轨道根据颜色突出的亚细胞动力学三明显的 VAMP1-positive 囊泡。刻度条 = 10 µm。使用共焦激光扫描显微镜记录时间间隔。请单击此处查看此图的较大版本.

分离技术和基本培养条件也可应用于成年斑马鱼的组织。在这里, 我们测试了野生型斑马鱼的成人脑组织。图 4AD显示了最初的碎片覆盖的文化逐渐发展到一个复杂的神经元样网络。通过利用转基因鱼携带转基因 Tg (XITubb:D sred) zf14828的成年大脑, 可以仔细地观察完全分化的 DsRed 表达神经元 (图 4E)。

图 4: 成年斑马鱼脑的原代细胞培养.在 (A) 1 磷酸二铵、(B) 3 磷酸二铵、(C) 5 磷酸二铵和 (D) 8 磷酸二铵的成年斑马鱼脑中产生的原细胞的明亮场图像。从1到3磷酸二铵, 死细胞和组织碎片消失, 而单个或聚集神经元细胞变得越来越明显。在3磷酸二铵, 神经元细胞开始形成第一个短突起。从5磷酸二铵开始, 有可能观察到一个网络的形成与数以百计的好拉长突起。鳞片棒 = 50 µm 细胞在聚 l-赖氨酸包覆的96井板中培养。(E) 培养细胞在7磷酸二铵从成年大脑的转基因鱼表达转基因 Tg (XITubb:D sred) zf148。DsRed 在分化神经元28表达。鳞片棒 = 100 µm 细胞在聚 l-赖氨酸包覆的24井板中培养。所有的图像都是通过 epifluorescent 显微镜获得的。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。