果蝇幼虫和成年脑的代谢分析

代谢重新编程已经确定在许多神经系统疾病, 包括胶质瘤多形性 (肾小球), 亨廷顿的疾病, 和主要的抑郁症 (MDD)^1,2,3。随着新陈代谢成为治疗策略的焦点, 基本代谢研究的工具也在不断进步。然而, 这些方法大多是为了研究细胞系和主细胞, 或分析后固定或冷冻的较大组织。一些方法依赖于简单测量特定代谢物的试剂盒, 而另一些则使用了更昂贵和复杂的分析, 利用色谱与质谱⁴相结合的目标。为了了解更大的新陈代谢环境, 代谢分析^5,6和代谢通量分析 (MFA)⁷出现补充了大规模蛋白质组学和遗传学研究。分析提供了在一个时间点的细胞或组织中的代谢物的定量表示, 而 MFA 扩大后, 允许跟踪标记代谢物随着时间的推移。后者有助于揭示当疾病状态⁸时, 细胞或组织中的能量源是如何被不同地利用的。然而, 这些方法并不包括对整体新陈代谢率的测量。

为了询问小模型系统的整体新陈代谢状况, 传统的方法, 如克拉克电极⁹和间接量热法¹⁰, 可用于测量耗氧量或配置为停止流 respirometry, 以分别测量氧和二氧化碳浓度。这些技术, 虽然准确地提供洞察到新陈代谢重新编程在有机体水平上, 有限制。克拉克电极的使用在技术上是有挑战性的, 不是为高通量研究而设计的。停止流呼吸不能与检测细胞或组织所需的灵敏度作用。几年前, 新的技术是专门为这些较小的应用开发的¹¹。这些仪器最初设计用于测量24或96井格式的细胞系和主细胞的耗氧量和胞外酸化。设置和数据输出的简单性建立了这种方法作为传统方法的替代。这种方法是细胞的有力工具, 最近的进展已经允许测量组织拳^12,13,14。然而, 这些化验所使用的方法不允许从小模型系统中测量整个器官。

疾病模型的代谢分析往往涉及在同一组织内的专门功能细胞之间的相互作用。例如, 胶质细胞产生神经元所使用的代谢产物。这些代谢相互作用是需要的神经元生存¹⁵。小型模型系统有利于调查这些问题。研究测量整个器官的新陈代谢, 包含各种细胞类型, 将增加对体内能量利用的理解。最近, 贝克等人报告了一种测量全飞头¹⁶的耗氧量的方法。通过将多个头聚集在一个24井细胞板的一个井中, 使用代谢分析仪获得氧消耗读数。虽然这是很好的头部, 这是很容易与身体分离, 它是更难以使用的器官, 如幼虫大脑, 因为需要解剖大量的这种方法。因此, 利用96井细胞板的方法, 提高了氧耗量和胞外酸化读数的灵敏度, 研制出一种单一的全幼虫脑。

本研究中使用的代谢分析仪要求测量的样品保持在96井细胞板井的底部。对于细胞和相对扁平的组织来说, 这不是一个挑战;然而, 对于果蝇幼虫和成年脑, 这是不可能使用传统的板涂层协议。球形的三维形状的大脑将不可靠地坚持板表面, 和那些做的往往是破坏, 而试图把他们正确地在井中。这一新的协议的一个关键部分是设计和发展的微组织限制¹⁷ , 提供一个小室的大脑驻留在不干扰代谢测量。所产生的室在高度约 0.016, 并提供足够的空间, 轻松地容纳许多D.黑腹脑。这些限制包括尼龙网附着在一个惰性聚合物环, 并将进一步讨论的代表性结果。使用这些限制可以减少为新陈代谢测量准备解剖大脑所需的时间。在六测量周期 (25 分钟) 后, 优化测量过程产生稳定、可再生的耗氧量和胞外酸化率。大脑保持新陈代谢活跃在这些条件下至少2小时, 这使得注射治疗, 抑制剂, 或其他治疗通过代谢分析仪墨盒药物传递端口。该协议也可以很容易地适应其他组织和小模型系统¹⁸。

下面详细说明了如何在对线粒体应激的挑战下, 测定整个果蝇幼虫脑中的氧耗量。为了强调大脑, 寡霉素增加了抑制 ATP 合成酶¹⁹。从基底读数中摄取的氧量的减少, 显示了在大脑中 ATP 依赖的呼吸量的测量。在治疗后的耗氧量进一步下降, 鱼藤酮²⁰和 antimycin²¹, 电子转运链复合物 I 和 III 抑制剂, 分别表明, 非线粒体氧消耗量在大脑。这是一个例子, 说明如何比较的大脑线粒体呼吸, 以及如何使用这个协议来比较不同基因型的新陈代谢。然而, 这个协议可以适应简单地测量基本的氧气消耗量和细胞外酸化率, 并且设计更加详细的研究调查具体能量利用或基体利用假说。

1. 化验准备 (1 天)

1. 将新陈代谢分析仪 (材料表) 放在孵化器或温度控制的房间设置为11摄氏度。
   注: 此温度是25摄氏度的测量的理想选择, 因为它允许在运行检测时发生的 ~ 14 °c 温度波动。这是由仪器在运行过程中产生的热量引起的。
2. 在附加到代谢分析仪的计算机上打开相应的软件。点击屏幕左下角的数值温度。在打开的新窗口中, 单击 "加热器 on" 命令旁边的框, 并确保出现复选标记。调整温度为25°c, 并调整公差范围, 以0.2 °c 使用箭头。
   注: 要达到稳定的温度需要几个小时。
3. 打开墨盒容器 (材料表), 并从实用程序板上取出墨盒, 而不接触探头。
   注: 本实用新型在墨盒的校准过程中使用, 在代谢检测运行时不使用。
4. 将 calibrant 溶液 (材料表) 的 200 ul 添加到实用程序板上, 然后将墨盒放回实用程序板的顶部, 以水化墨盒上的传感器探头。请勿触摸探头并保护它们不受光线的侵害。
5. 用石蜡膜封住墨盒。
6. 在25摄氏度的夜间孵化墨盒。

2. 化验介质准备 (2 天)

1. 将10毫米葡萄糖和10毫米丙酮酸钠添加到化验培养基中。
2. 在25摄氏度的培养基上孵化, 直到液体平衡到这个温度。
3. 使用 ph 值计将 ph 值调整为7.4。

3.果蝇脑代谢分析软件的建立 (2 天)

1. 在步骤1.2 中使用的代谢分析仪上设置代谢软件。
2. 在软件主屏幕上选择 "模板"。
3. 双击 "空白" 开始新的检测设计。
4. 单击顶部工具栏上的 "板块图" 按钮, 查看单元格检测板的设计。
   注: 细胞化验板将包含大脑样本, 并将与墨盒配对, 然后开始新陈代谢化验运行。
5. 单击 "添加组" 按钮3x。
   1. 双击 "组 1" 标签并将其重命名为 "实验"。
      注意: 这个小组将包含一只苍蝇大脑和药物治疗的微组织克制。
   2. 双击 "组 2" 标签并将其重命名为 "控制"。
      注意: 这个组将包含一个苍蝇大脑和微组织克制, 没有药物治疗。
   3. 双击 "组 3"标签并将其重命名为 "仅限约束"。
      注意: 这个组将包含一个微组织克制, 没有任何大脑或药物治疗。
6. 根据单元格中的样品拟放置的位置, 将井分配给每个组。
   1. 点击 "实验" 标签, 然后突出 B2 B8 在板块地图上。
   2. 点击 "控制" 标签, 然后突出 C2-C8 在板块地图上的水井。
   3. 点击 "仅限限制"标签, 然后突出 D2-D8 在板块地图上的水井。
   4. 检查所有四个角 (A1、A12、H1 和 H12) 是否被指定为背景。
      注: 沿板块周长的井不用于减少任何边缘效应。这是软件中的默认设置。
7. 单击顶部工具栏中的 "协议" 按钮以设置协议。
   1. 单击 "基线测量" 框中的 "编辑测量详细信息"。
   2. 通过单击向上和向下箭头, 调整新陈代谢分析仪测量大脑的时间, 方法是将基础测量周期时间改为 "3:00"。
   3. 通过单击向上和向下箭头, 调整新陈代谢分析仪在脑测量之间等待的时间, 将基本等待周期时间改为 "0:00"。
   4. 调整代谢分析仪在测量大脑之前, 通过点击向上和向下箭头将基底混合周期时间改为 "1:00" 来混合介质的时间。
   5. 通过单击向上和向下箭头, 调整基本循环的总数 (包括度量值、等待时间和混合周期) 到 "7" 。
      注: 从试验开始25分钟后获得稳定的耗氧率测量。
   6. 单击位于左上角工具栏中的 "添加注入" 按钮。
   7. 点击 "注塑标签", 并将其改为 "寡霉素"。
   8. 调整注射措施, 等待和混合时间, 以匹配的基础。
   9. 通过单击向上和向下箭头, 将注入周期的总数量调整为 "6"。
   10. 重复步骤 3.7.6 3.7.8, 但将标签更改为 "腐烂/AA", 并通过单击向上和向下箭头将注入周期的总数调整为7。
   11. 单击顶部工具栏中的 "运行检测" 按钮。
   12. "保存" 化验并开始设置化验盒 (材料表)。

4. 准备用于校准的墨盒 (2 天)

1. 从25°c 孵化器取出墨盒, 取下盖子。
   1. 添加 20 ul 100 微米寡霉素到小左上圆形注射口, A 港, 在墨盒中的所有相应的实验井在细胞板上, 并添加 20 ul 的化验介质到港口 A 在所有其他水井, 包括控制和背景井。
      注: 该墨盒包含4个端口 (A D), 每个96个井对应的单元格板将包含样品。此步骤在添加示例之前完成。添加 20 ul 100 微米寡霉素结果在细胞板的最终寡霉素浓度10微米, 一旦药物注射的代谢分析仪。寡霉素是 ATP 合成酶的抑制剂。由此产生的耗氧量将反映大脑中 ATP 连接呼吸的数量。为了正确地将药物注入到指定的井中, 同一封信的所有端口都必须用相同数量的液体填充, 即使不使用。
   2. 添加 22 ul 50 微米的鱼藤酮/antimycin A 到小右上圆形港口, B 港, 在墨盒中的所有相应的实验井的细胞板, 并添加 22 ul 的化验介质到 B 港所有其他水井, 包括控制和背景井。
      注意: 这导致最后的鱼藤酮/Antimycin 浓度5微米的细胞板, 一旦药物注射的代谢分析仪。鱼藤酮和 antimycin A 是电子运输链复合体 I 和 III 的抑制剂。由此产生的氧消耗值将反映大脑中的非线粒体呼吸。
   3. 单击 "开始运行", 将加载的墨盒与实用程序板放入代谢分析仪中, 当面对仪器时, A1 定位在左上角, 并从机器的右侧延伸到平板装载机。
2. 选择 "我准备好" 在软件开始的平衡和校准的墨盒之前开始的新陈代谢化验与细胞板块包含样品。
   注意: 程序将要求保存文件, 然后开始平衡和校准。这些步骤最多可达1小时, 在平衡和校准时间内进行5–8步骤。

5. 微组织限制剂的制备 (2 天)

1. 选择1的微组织限制, 每个大脑的测量, 再加上至少3作为克制的控制, 从存储容器 (含70% 乙醇)。
2. 用新鲜的70% 乙醇冲洗束缚, 用去离子水 3x 2 分钟清洗它们, 使用网状篮子和6井板 (材料表)。添加额外的水洗, 如果限制仍然发出酒精气味。
3. 在化验介质中清洗微组织的限制, 将它们留在溶液中, 直到它们准备好使用。

6.果蝇 幼虫脑的解剖 (2 天)

1. 选择晚 (徘徊) 第三龄幼虫从一小瓶养殖的俄勒冈州 R蝇使用高精度, 花柱 5 (0.10 x 0.06 毫米²) 镊子。
2. 将幼虫放在一个干净的解剖点板 (材料表) 的井中, 其中包含 500 ul 1x PBS。
   注意: 一个斑板是一个有凹陷的玻璃板, 用来解剖小组织和有机体。
3. 用镊子轻轻摇动它, 将幼虫洗净。
4. 将幼虫移动到含有 500 ul 1x PBS 的现货板块的清洁井中。
5. 将光斑板置于解剖显微镜下。
6. 用一双镊子抓住它的中段的幼虫, 同时用第二对镊子抓住眼睛钩。
7. 用两套镊子轻轻平滑地将幼虫拉向相反的方向。
8. 想象大脑, 它通常会附着在眼钩上, 通常会有触角的圆盘附着在它上面。
9. 小心地从大脑中取出额外的组织, 用眼钩把大脑保持到位。最后, 将眼钩与大脑分开。
10. 用镊子把解剖过的大脑移到一个装有 1x PBS 的平板上的新井上。
11. 重复步骤6.1–6.10 直到14脑被解剖。
    注: 从解剖开始到化验运行的总时间不应超过30分钟。

7. 将解剖过的大脑添加到96井代谢检测细胞板 (2 天)

1. 在实验中使用的96井代谢试验板 (材料表) 中加入 50 ul 的化验介质, 包括实验、控制、只约束和背景井。
2. 用镊子、刮刀或吸管小心地将一个大脑从细胞板的 A2-A8 和 B2-B8 中放在每个井中。
   注意: 这可能是从解剖显微镜做出来的。
3. 在解剖显微镜下, 用弯曲的针微探针将大脑沉入井底。
4. 用探针轻轻地将大脑放置在三凸起球体的中间。

8. 将微组织限制添加到96井代谢检测细胞板 (2 天)

1. 使用镊子, 将微组织约束放在检测板的边缘, 并利用显微镜检查它是否面向下的塑料环和顶部的网格。
2. 从显微镜下取下盘子, 用镊子抓住两边的约束, 轻轻地把它放进井里。
3. 用一根弯曲的针微探针将克制力推入井中。
4. 在显微镜下, 验证大脑是否可以通过组织克制来观察, 并将其集中在井中。
5. 重复步骤8.1–8.4 所有的水井, 将在化验-A2-A8, B2-B8 和 C2-C8。
6. 仔细添加 130 ul 的化验介质, 每一个实验, 控制, 和克制只有水井。
7. 验证大脑和微组织的限制没有移动, 而添加媒体通过可视化他们在显微镜下。
8. 添加 180 ul 的化验介质到四角井用作背景控制。

9. 增加细胞板对新陈代谢分析仪和开始化验 (2 天)

1. 通过等待软件提示包含样本的单元格, 验证平衡和校准是否完成。
2. 选择 "打开托盘", 等待仪器弹出实用程序板。
3. 卸下实用板, 并添加电池板, 没有盖子, 在同一方向。
4. 选择 "负载细胞板", 将仪器带入细胞板并关闭托盘, 然后开始化验。
5. 使用运行该软件的计算机屏幕上的错误条实时查看测量结果。
6. 完成检测后, 取出弹出的电池板和墨盒。
   注: 配对墨盒和电池板可重新使用5x。

10. 测量后分析 (2 天)

1. 使用解剖显微镜, 以验证在化验完成后, 大脑和微组织的限制仍然在井中正确定位。排除任何与分析异常的油井。
2. 导出氧气消耗率 (OCR) 和胞外酸化率 (ECAR) 数据进行进一步分析。

这里提出的协议要求使用微组织限制, 以满足下面描述的规格。用其他方法把大脑放在96井的电池板的底部是不成功的 (图 2A和2B)。首先, 各种制剂增加了组织附着板的测试。推荐一种商业上可用的组织胶粘剂 (材料表), 分别用于细胞和 organoids 的细胞板和球形板。最初, 大脑似乎坚持井表面;然而, 氧气消耗 (OCR) 读数低, 并观察水井后的化验显示, 大脑已不再连接到井表面 (图 2A)。与超级胶水相同的结果 (图 2A)。接下来, 在油井底部的一个小房间里制造小屏幕来控制大脑 (图 2B)。

金属屏幕仅产生高 OCR 读数, 金属屏幕上的聚合物环保持屏幕到位 (图 2B)。塑料网格网用于同一个聚合物环。这个装置导致了一个负面的 OCR 读数得到。最后, 用惰性聚合物设计了微组织约束, 用于测量外径为0.146 的环, 内径0.1335 英寸, 厚度0.0125 英寸, 高度为0.016 英寸 (材料表)。超级胶水 (材料表) 被用来连接环的尼龙网, 其直径为0.0039 英寸 (材料表) 的特定孔径。孔隙大小是至关重要的, 因为它允许媒体和代谢物交换, 而不形成气泡, 但仍然作为一个障碍的大脑。这些限制单独导致没有 OCR 阅读, 当使用与大脑, 允许可重复读数 (图 2A和2B)。经化验证实, 脑部仍能正确定位在井中。这些组织限制目前没有商业上可用, 但可以按照上述规范制造。虽然这需要精确的制造, 但大多数机器商店都可以使用上面提到的材料重现这种限制。

该协议进一步优化, 以说明化验介质, 在化验运行之前允许的时间和温度 (图 3)。最初, 在施耐德培养基上建立了测定幼虫体内环境的方法。但是, 使用的媒体不能包含缓冲代理, 因为 pH 值用于测量 ECAR。因此, 这种媒体必须是定制的, 这是昂贵的。为了优化这一点, 一个商业上可用的化验媒体设计的新陈代谢分析 (材料表) 被用来代替施耐德媒体。OCR 水平是不变的, 即使在增加葡萄糖水平轻微的模型化验介质条件 (图 3A)。从这一点上的所有化验都是在化验培养基中进行的。通过观察氧耗量和胞外酸化率是否在已知线粒体抑制剂的治疗中表现出反应, 对培养基的补充进行了优化。其次, 分析了解剖与检测之间的等待时间。3小时的孵化显著降低了 OCR 级别 (图 3B)。图 3D显示了第六时间点的差异, 这是当 OCR 和 ECAR 水平稳定的成年和幼虫的大脑。因此, 该协议表明, 在解剖后立即开始化验, 除非实验需要一个温度平衡, 在这种情况下, 一个孵化少于30分钟建议。代谢分析仪存储在一个孵化器设置为11°c, 以允许25摄氏度的温度在整个化验。如果温度因环境温度和仪器操作而升高, 则观察到 OCR 级别的降低 (图 3C)。这是假设是由于组织死亡。

当遵循优化条件时, 与幼虫和成人大脑的化验结果在稳定的第六时间点的 OCR 读数略超过 150 pmol/分钟, 25 分钟到化验 (图 4B)。此速率保持至少30分钟 (图 4A), 最多2小时 (未显示数据)。ECAR 在成年脑中比在第六时间点 (图 4D) 的幼虫大脑稍低, 并且保持至少30分钟 (图 4C)。这一发现对应于幼虫阶段糖酵解的增加, 以支持生长。注射与线粒体抑制剂, 如寡霉素, 降低 ocr 读数显示 ATP 依赖呼吸, 并进一步治疗与鱼藤酮和 antimycin 降低 OCR 显示非线粒体氧消耗 (图5A).这些数据表明, 这些抑制剂能够穿透大脑组织, 并可用于比较不同基因型的大脑线粒体呼吸。对于这种检测, 混合, 等待和测量时间是通过观察氧气水平, 而不是消耗率, 并确保混合后, 氧气水平返回到水平之前的测量。

图 1: 代谢分析仪中的幼虫脑 OCR 和 ECAR 测量示意图.墨盒是在运行化验前一天准备的。第二天, 药物被添加到注射端口的墨盒。解剖了黑腹幼虫的大脑, 并添加了微组织限制, 以确保大脑在井底。在代谢分析仪中测定脑细胞板, 分析数据。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 微组织限制不是新陈代谢活动的, 并且把大脑放在盘子底部的一个腔室里.(A)俄勒冈州 R 型黑腹幼虫脑的 OCR 是用组织粘合剂 (材料表) 涂敷的水井测量的, 或者当大脑超粘于井底时。这些结果与在井下使用微组织约束的大脑的位置进行了比较。(B) OCR 测量的是含有检测介质和金属的油井、带有聚合物环的金属、塑料网格网和聚合物环, 或微组织约束。* p值 < 0.05, ** p值 < 0.01, *** p值 < 0.001, *** p值 < 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 优化介质、孵化时间和温度.(A) 使用施耐德媒体 (S2) 与丙酮酸钠补充, S2 葡萄糖和丙酮酸钠, 并添加葡萄糖和丙酮酸钠, 测量了 OCR 的幼虫大脑.(B) 在化验前3小时孵化之前, 或在化验前30分钟孵化后, 在幼虫大脑中测量 OCR。(C) OCR 是在检测运行温度为33摄氏度和25摄氏度的幼虫大脑中测量的。第六时间点是图表。(D) 在化验前3小时孵化后, 或在化验前30分钟孵化后, 在幼虫大脑中测量 OCR。报告第六时间点的数据。* p值 < 0.05, ** p值 < 0.01, *** p值 < 0.001, *** p值 < 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: OCR 和 ECAR 是重现性在成年和幼虫的大脑中测量的.(A) ocr 是用30分钟的时间测量的. (B) 从A组的第六次点的 ocr 数据为图表。这是 OCR 读数稳定的时间点。(C) ECAR 的测量值为 30 分钟. (d) A组第六时间点的 ECAR 数据为图表。这是 ECAR 读数稳定的时间点。* p值 < 0.05, ** p值 < 0.01, *** p值 < 0.001, *** p值 < 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 寡霉素降低了腹腹幼虫脑 OCR 水平, 揭示 ATP 依赖性呼吸, 鱼藤酮/antimycin 进一步降低 OCR 显示非线粒体氧消耗.(a) 在20µM 寡霉素和5µM 鱼藤酮/antimycin 混合物治疗后, 在俄勒冈-RD幼虫脑中测量 OCR。采用检测介质对控制和约束型井进行了注射。请单击此处查看此图的较大版本.

小费为本议定书¹⁷所述的微组织限制持有临时专利。