Summary

哺乳动物轴突再生: 成年小鼠背根神经节体内电穿孔的研究

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

电穿孔是一种有效的方法, 将兴趣基因传递给细胞。本文应用这种方法对成年小鼠背根神经节的神经元进行了研究, 并对其在体内的轴突再生模型进行了描述。

Abstract

电穿孔是一种重要的非病毒基因转染方法, 将 DNA 质粒或小 RNA 分子引入细胞。背根神经节 (DRGs) 中的感觉神经元延伸一个单轴突, 两个分支。一个分支转到外围神经 (外围分支), 另一个分支进入脊髓通过背根 (中央分支)。神经损伤后, 外围分支恢复强劲, 而中心分支不再生。随着再生能力的提高, 感觉轴突再生已被广泛应用于研究哺乳动物轴突再生在周围神经系统 (三七) 和中枢神经系统 (CNS) 中的模型系统。在这里, 我们描述了一个以前建立的方法协议来操纵成熟的感官神经元在体内通过电穿孔的基因表达。在转染质粒或小 RNA 寡核苷酸 (siRNAs 或 microRNAs) 的基础上, 该方法既允许损失和增益功能的实验, 以研究基因利益或 microRNAs 的作用, 调节轴突再生在体内。此外,体内基因表达的操纵在相对较短的时间内可以在空间上和世俗地控制。该模型系统为研究哺乳动物轴突再生在体内调节的分子机制提供了一个独特的工具。

Introduction

神经损伤或各种神经退行性疾病引起的神经系统损伤通常导致运动、感官和认知功能的缺陷。最近, 大量的努力已经致力于再生效能重建的成人神经元, 以恢复生理 functionsof 受损神经元1,2,3。神经节中的感觉神经元是一群神经细胞, 它传达不同的感官刺激, 如疼痛, 体温, 触觉, 或身体姿势, 对大脑。这些神经元都是伪单极, 包含一个单轴突, 分叉一个分支向周围延伸, 另一个分支朝向脊髓4。DRGs 中的成年感觉神经元是少数成熟的哺乳动物神经元, 在受伤后能积极地再生它们的轴突。因此, 感觉轴突损伤作为研究脑轴突再生机制的重要模型被广泛应用.

在体内基因转染技术的建立和灵活性比使用转基因动物的时间要少, 在研究神经系统的基因功能和信号通路方面起着至关重要的作用。主要技术可以分为两种方法: 基于仪器的和基于病毒的5。以病毒为基础的成体神经元体内基因传递可以提供精确的时空操纵基因表达6。然而, 劳动密集型过程涉及基于病毒的方法, 如生产和纯化含有所需基因的病毒微粒。此外, 许多病毒载体可以激活宿主的免疫系统, 这可能会干扰数据的采集、数据分析, 并可能误导实验结果的解释。电穿孔是一种典型的以仪器为基础的转染方法, 使用电子脉冲增加细胞和核膜的通透性, 这有利于基因载体或小 RNA 寡核苷酸从细胞外的空间流入7.体外电穿孔被广泛认为是一种瞬态但高效的策略, 用于操纵多种细胞类型的靶向基因表达。虽然在体内电穿孔只会导致短暂的基因表达与病毒载体相比, 转染效率低, 它具有不同的病毒方法的优势。例如, 它可以应用到几乎所有的组织和细胞7,8,9。此外, 对某些转录蛋白编码的基因或小 RNA 寡核苷酸 (例如, siRNAs, microRNAs) 的质粒可以直接注入靶组织, 然后电脉冲, 这使得程序减少了劳动, 并耗时。此外, 转染多质粒和 RNA 寡核苷酸同时进行单电穿孔是可能的。

我们建立了体内电穿孔的方法来操纵成年小鼠感觉神经元中的基因表达, 并成功地应用和验证这种方法在许多先驱研究1,2,3 ,8,10。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以促进使用这种方法, 未来的研究哺乳动物轴突再生。

Protocol

所有动物实验都是按照约翰霍普金斯机构动物保育和使用委员会批准的动物协议进行的。 1. 材料和试剂 动物 用六周大的雌性 CF1 小鼠称量 30–35 g 进行实验。注: 在单独通风灭菌笼中, 小鼠组内 (每笼5只小鼠), 1/4 “玉米芯寝具和 2” 方形 nestlets 用于筑巢。笼保持在一个控制的12小时的光暗循环和室温是介于19.4 摄氏度和25摄氏度之间。用全球啮齿动…

Representative Results

为了量化当前协议的细胞毒性, 并验证体内根节电穿孔的转染率是否足够高, 我们注射并转荧光标记的 microRNA 或 siRNA L4 和 L5 DRGs。分离 DRGs 经低温切片和免疫组化处理 (图 1A B)。在估计注射和电穿孔后的细胞存活率时, L4 和 L5 的完整 DRGs 通过冷冻切片和免疫组化进行了采集和处理。与完整 DRGs 的神经元密度相比, 神经元密度与 Tuj1 ?…

Discussion

一些手术步骤需要特别注意。L4 和 L5 DRGs (somas 的位置), 控制坐骨神经, 需要正确识别和注射的基因结构。否则, 在坐骨神经轴突中, GFP 标记将消失。髂嵴可以被视为有用的解剖标志, 以确定 L4 和 L5 DRGs。在大多数小鼠中, L5 和 L6 椎骨之间的关节与髂嵴12相近。另外, L3 根背根可以选择代替 L5, 特别是对免疫组化或西方印迹13的化验, 因为 L5 背节的手术暴露通常会遇?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究获得资助 (授予 F Q。Z.) 由 NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), 克雷格 h 尼尔森基金会和 BrightFocus 基金会。

Materials

ECM 830 Square wave electroporation system BTX Harvard Apparatus 45-0052 For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0524 For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III Parker Instrumentation 1096 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller NARISHIGE PC-10
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. 1902328
Stereo Dissection Microscope Leica M80
Microsurgery Rongeur F.S.T 16221-14
Microsurgery Forceps FST by DUMONT, Switzerland 11255-20 Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. TW100-4 10 cm, standard wall
Tape Fisherbrand 15-901-30 For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402 Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC003 Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 Dharmacon CP-004500-01-05 Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit Invitrogen Purelink K210016 GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye Millipore-Sigma F7252 For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine Putney, Inc NDC 26637-731-51 Anesthesia induction
Xylazine AnaSed NDC 59399-110-20 Anesthesia induction
Acetaminophen McNeil Consumer Healthcare NDC 50580-449-36 Post-surgical pain relief

References

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Cite This Article
Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (139), e58171, doi:10.3791/58171 (2018).

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