寄生性锥虫锥虫锥虫的 f1-atpase 的分离

f 型 atp 合成物是膜结合旋转多蛋白复合物, 它将质子在细菌、线粒体和叶绿体的能量传递膜上的移位与 atp 的形成结合在一起。atp 合成旋转机理的分子细节之所以知道, 主要是因为对纯化的细菌和线粒体 atp 合成酶及其亚配合^物进行了结构研究1。f 型 atp 合酶被组织成膜固有的和膜外的摩尔。膜外源部分, 称为 f1-atpase,包含三个催化位点, 其中磷酸化的二磷酸腺苷 (adp) atp 或反向反应发生。f1-atpase 可以从膜固有的因子中实验释放, 同时保持其水解但不合成 atp 的能力.膜结合区, 称为 f_o,介导蛋白质易位, 这驱动了酶的中心部分的旋转。f₁和 f o扇区由中心和外围秸秆连接。

第一次尝试净化 f1-atpase从发芽的酵母和牛心脏线粒体可以追溯到20世纪60年代。这些协议使用提取的线粒体, 通过超声分解, 由铵或硫酸丙胺沉淀分解, 然后进行可选的色谱步骤和热处理^2,3^{,4 ,5,6}。氯仿的使用大大改善和简化了纯化, 很容易从线粒体膜碎片7中释放出 f1-atpase.然后用氯仿提取, 从各种动物、植物和细菌来源 (如大鼠肝脏⁸、玉米 9、金银花10和^{大肠杆菌)}中提取 f1-atpase ¹¹)。通过亲和或大小排除色谱法(sec) 进一步纯化氯仿释放的 f1-atpase, 产生了一种高度纯的蛋白质复合物, 适用于 x 射线晶体学的高分辨率结构测定。记录了牛^{心脏 12、13 和}酿酒酵母14 的 f1-atpase 的结构.f-1-atpase 结构也是由难以培养的生物_确定的, 因此, 最初的生物材料的数量有限。在这种情况下, f1-atpase 亚基被人工表达并组装成大肠杆菌复合物, 整个异源酶通过带标记的亚基通过亲和层析纯化. 这种方法导致测定了两种嗜热细菌的 f1-atpase 结构, 即 15 型硬毛虫和热性钙弧菌^{16 . 17}. 然而, 这种方法相当不适合真核细胞 f-1-atpases, 因为它依赖于原核合成装置、翻译后处理和复杂的组装。

以氯仿为基础的提取剂以前被用来从单细胞二基因寄生虫trypanosoma cruzi 18和t. brucei¹⁹中分离出 f-1-atpase, 这是引起美国和美国的重要哺乳动物病原体.非洲锥虫酶, 分别来自单源昆虫寄生虫刺五加 20。这些净化只导致对 f1-atpase 的简单描述, 因为没有使用下游应用来充分描述该综合体的组成、结构和酶特性。本文介绍了一种从t.brucei 的培养昆虫生命周期阶段进行 f1-atpase 纯化的优化方法.该方法是在建立了牛和酵母 f1-atpase^21、22分离方案的基础上发展起来的。该程序产生了高度纯、均匀的酶, 适用于体外酶和抑制检测、质谱^仪23 的详细蛋白质组学表征和结构^{测定 24}。纯化协议和原子级 f1-atpase 结构的知识为设计屏幕以识别小分子抑制剂提供了可能性, 并有助于开发抗非洲锥虫酶的新药.此外, 该协议还可用于从其他生物中净化 f 1-atpase。

1. 缓冲器和解决方案

1. 准备下面列出的解决方案。德加所有缓冲液的液相色谱。在使用前添加 adp、苯胺和蛋白酶抑制剂。
   1. 准备缓冲液 a:50 mm tris 缓冲液与盐酸 (tris-h科尔) ph 值 8.0, 0.25 m 蔗糖、5 mm 苯胺酸、5 mm 氨基己酸 (aca) 和蛋白酶抑制剂 (10μm 阿玛司他汀、50μm 酯蛋白、50μm 肽、50μm leupeptin 和50μm 二丙酸 a)。
   2. 准备缓冲液 b:50 mm Tris-HCl ph 值 8.0, 0.25 m 蔗糖, 4 mm 乙二胺四乙酸 (edta), 5 mm 苯胺酸、5 mm aca、1 mm adp 和蛋白酶抑制剂 (10μm 阿沙汀、50μm 最佳碱、50μm 肽、50μm leupeptin 和50μm 二丙酸 a)。
   3. 制备 q 柱缓冲液:20 mm tris-hcl ph 值8.0、4 mm edta_、10 mmmso 4、5 mm 苯并胺、5 mm aca 和 1 mm adp。
   4. 准备 q 柱洗脱缓冲液: 具有 1 m ncl 的 q 柱缓冲液。
   5. 准备 sec 缓冲区:20 mm tris-hcl ph 值 8.0, 10 mm mgso₄, 100 mm nacl, 1 mm adp。
   6. 制备饱和 2 m 弗里斯-h科尔 ph 值8.5 的氯仿。将氯仿与 2 m tris-hcl ph 值8.5 混合在一个螺帽瓶中, 约为1:1 的比例, 摇一摇, 让有机和水相分离, 并用一条 ph 指示器纸测量上水层中的 ph 值。在室温下存放。就在使用前, 再次摇晃, 让阶段分开。使用较低的氯仿层。
      注意: 氯仿是挥发性的, 对眼睛和皮肤有刺激性。在通风柜里工作。晃动时使用安全眼镜。

2. 线粒体粒子的制备

1. 在5毫升冰凉缓冲液中, 通过低渗裂解25从 1 x^{10 11}到 2 x 10 11 细胞分离^线粒体囊泡 (线粒体囊泡) a. 将样品冷却至步骤3.2。
2. 根据制造商的说明, 用双氯酸 (bca) 蛋白测定26测定悬浮液中的蛋白质浓度。
   1. 采用牛血清白蛋白 (bsa) 稀释系列在超纯水中构建标准曲线。用超纯水稀释少量样品 20-100次, 以适应 bsa 标准的范围。
   2. 计算样品中的总蛋白质量, 并通过用额外的缓冲液 a 稀释将蛋白质浓度提高到 16 mgml。
3. 通过对悬浮液7x 的超声作用, 使其转化为倒置的囊泡和膜块, 每个脉冲的总能量为70至 100 j, 其直径为 3.9 mm。如果超声波均质机不显示能量输出, 请以最大功率的50% 开始优化。在两次脉冲之间将样品在冰上培养30秒。超声之后, 悬浮液变得稍微暗。
4. 将膜碎片沉积在 54, 000 x 克的16小时或 98, 000 x 克的温度下, 在4°c 下, 以5小时的速度沉积。对上清液进行分解, 进行氯仿提取, 或将沉积物在液氮中冻结, 并将其储存在-80°c。

3. 氯仿从膜中释放 f1-atpase

1. 利用小的弹跳均质机, 将线粒体膜颗粒在缓冲 b 中重新弹。使用以下公式根据步骤2.1 和2.2 中使用的缓冲区 a 的总量计算缓冲区 b 的体积: 卷 (缓冲区 b) = 卷 (缓冲区 a) x 12*。将悬架转移到15或50毫升锥形管。
2. 从冰中取出样品, 从现在开始, 保留样品和所有溶液在室温下使用。
3. 添加饱和 2 m 弗里斯-h科尔 ph 值8.5 的氯仿;要增加的氯仿体积等于悬浮液体积的一半。把帽子合紧。用力摇晃 20分钟, 在室温下立即以 8, 400 x 克离心5分钟。
4. 将上多云的水相转移到 1.6 ml 微管。加入蛋白酶抑制剂 (10μm 阿广播司他汀、50μm 最上面酯、50μm 肽、50μm 利肽和50μm 二丙酮 a), 以取代氯仿处理去除的抑制剂。在室温下, 以 13, 000 x g离心样品30分钟。将上清液转移到新鲜的微管中, 并重复离心以去除任何不溶性物质。

4. 阴离子交换色谱分析

1. 平衡连接到快速蛋白液相色谱系统的5毫升阴离子交换 (q) 柱, q 柱缓冲液以 5 mlmin 的流速, 直到吸收率达到280纳米, 电导率稳定 (缓冲液约50毫升)。
2. 将步骤3.3 中的上清液以 1 mlmin 的流速加载, 直到在280纳米的吸收率稳定在背景上。在 0.5-ml 25-mL 的流速下, 应用 q 柱洗脱缓冲液的25-ml 线性梯度, 从0% 到 100%. 收集1-ml 分数。
3. 用 pullman atpase 法²测定 ph 值8.0 时 atp 水解活性的主要洗脱峰对应的单个分数。每1毫升反应混合物使用每一个分数的10μl。集合显示 atpase 活性的分数。(可选) 将每一组分的10μl 分在十二烷基磷酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 上, 用 Coomassie 染色凝胶, 以可视化单个f 1-atpase 亚基并污染蛋白质。
4. 使用具有 100, 000 mwco pes 过滤器的自旋柱将样品通过膜超滤浓缩到 200-500μl. 在室温下前往 sec 或隔夜储存样品。

5. 防尺寸色谱

1. 平衡连接到液相色谱系统的 sec 柱, 以 0.5 mlmmin 的流速至少 48ml (两列体积) 的 sec 缓冲液。
2. 将样品涂在色谱柱上, 以 0.25 mL/min 的流速运行色谱法, 收集0.25 毫升的分数。
3. 运行10μl 的分数对应于 sds-page 上的 uv_280nm吸收痕迹的峰值, 并用 Coomassie 对其进行染色。第一个主要峰包含 f1-atpase.通过铂尔曼 atpase 法测定与该峰相对应的 atp 水解活性和氮化物敏感性的分数。用 bca 法测定蛋白质浓度。
4. 将纯化后的f1-atpase 保持在室温下, 并在净化后的3天内使用, 用于下游应用。或者, 使用带有 100, 000 mwco pes 过滤器的自旋柱将样品浓缩到 > 1.5 mg/ml, 将其与调整为 ph 值 8.0 (体积的 1.2倍) 的饱和硫酸铵混合, 沉淀, 并将其储存在4°c。

典型的纯化 (图 1) 从线粒体囊泡 (线粒体子体) 开始, 从低裂解的 1 x 1011到 2 x 10 11 顺环 t. 布鲁西细胞 25在标准培养中分离富葡萄糖 sdm-79 培养基 27.有丝体通过超声分裂, 旋转, 含有基质的上清液被丢弃。线粒体膜用氯仿处理, 释放 f1-atpase.离心后, 有机相和沉淀的中间相被丢弃。在强阴离子交换器季铵上, 用离子交换色谱法对水相进行了分离 (图 2a)。与主要洗脱峰相对应并包含 f1-atpase 的分数进行汇集和浓缩。这种材料可作为 sec 的输入, 从而消除残留的杂质。主要污染物是二氢脂质脱氢酶, 它从 sec 柱中剥离为一个离散峰, 以图2b中的深绿色条为标志。f1-atpase 在第一主要的、主要是对称的峰值中的静音 (图 2b).

纯化的进展之后是 bca 蛋白检测 (或另一种常见的蛋白质检测)、sds-page 和 atpase 活性的监测。根据 nadh 在偶联反应中的吸收率降低, 采用普尔曼 atp 再生法2测定了 atp 水解速率。氮化钠是 f1-atpase 的既定抑制剂, 在2-mm 浓度下使用, 以确定 f1-atpase 特异性 atp水解的比例。通常情况下, 输入材料包含大约150-300 毫克的线粒体蛋白, 这取决于作为线粒体囊泡来源的细胞数量。在这一阶段, 氮素对 atpase 总活性的比例在30% 至40% 左右。氯仿提取后, 样品中90% 以上的 atpase 活性与f-1atpase 有关。纯化后的 f1-atpase 对氮化物的处理几乎完全敏感 (最小残留 atpase 活性可归因于背景 atp 自溶), 约占输入蛋白质量的 1%, 产率约为 1-每 1 x 10 11 个细胞1.5毫克的 f 1- atpase (表 1)。图2图图2显示了在 sds-page凝胶上分离纯化的 f 1-atpase 后, 随后是 coomassie蓝染色后的典型带状。通过多肽质谱鉴定了蛋白质, 并采用了各种质谱方法23 对其进行了详细的表征。在β亚基带上方可见的零星弱带代表α3β3头套的亚复合体 (α-和β亚基的二聚体和低聚物), 不存在敏感质谱技术检测到的任何污染物。纯化后的f-1atpase 可在室温下在 sec 缓冲液中存储长达数天。或者, f1-atpase 浓度为≥2mg\ ml 可以通过在 sec 缓冲液中的饱和硫酸铵的等量沉淀, ph 值调整为 8.0, 并存储在4°c。在沉淀后至少6个月内, 通过在 sec 缓冲液或类似溶液中溶解沉淀材料, 可以获得没有明显降解任何亚基的活性酶。然而, 超过一个月的储存不适合结晶, 这是经验所确定的。

图 1: 净化程序方案.请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 采用液相色谱法对氯仿释放的f1-atpase 进行两步纯化.(a) 阴离子交换色谱 (上板) 的洗脱剖面和在用库马西蓝色染料 (下板) 染色的 10%-20% 的三甘氨酸 sds-page 凝胶上分离的选定分数。蓝色痕迹: 紫外线吸收率在280纳米;红色痕量: 洗脱缓冲液中的氯化钠浓度;输入: 氯仿释放的 f1-atpase;ft: 流经。(b) 用 coomassie 蓝色染料染色的 sds-page 凝胶上分离的 sec (上板) 和选定的分数 (下板)。输入: 含有 f 1-atpase 的阴离子交换色谱中的集合分数。面板 a和b中的颜色编码条标记由 sds-page 分析的洗脱配置文件中的分数以及相应凝胶中的相应通道。(c) 质谱联用鉴定的分离的 f1-atpase 的单个蛋白质的鉴定.请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 从 1 x10 11 环环 t. brucei 细胞分离的线粒体的 f1-atpase纯化的典型进展和产量的一个例子。

作者没有什么可透露的。