Estimering av Nephron nummer i hele nyrene ved hjelp av acid maserasjon Method

Summary

Estimater av hele nyre nephron tall er viktige klinisk og eksperimentelt, som det er en invers assosiasjon mellom nephron tall og en økt risiko for nyre-og hjerte-og karsykdommer. Heri, bruk av syre maserasjon metoden, som gir raske og pålitelige estimater av hele nyre nephron tall, er demonstrert.

Abstract

Nephron legat refererer til det totale antall nephrons en person er født med, som nephrogenesis hos mennesker er fullført innen 36 uker av svangerskapet og ingen nye nephrons dannes etter fødselen. Nephron nummer refererer til det totale antallet nephrons målt på et hvilket som helst tidspunkt etter fødselen. Både genetiske og miljømessige faktorer påvirker både nephron begavelse og antall. Forstå hvordan spesifikke gener eller faktorer påvirker prosessen med nephrogenesis og nephron tap eller død er viktig som individer med lavere nephron legat eller antall antas å være på en høyere risiko for å utvikle nyre-eller hjerte-og karsykdommer. Forstå hvordan miljømessige eksponeringer i løpet av en persons levetid påvirker nephron tall vil også være avgjørende for å bestemme fremtidig sykdomsrisiko. Dermed er evnen til å vurdere hele nyre nephron nummer raskt og pålitelig en grunnleggende eksperimentell krav til bedre å forstå mekanismer som bidrar til eller fremme nephrogenesis eller nephron tap. Her beskriver vi syre maserasjon metode for estimering av hele nyre nephron tall basert på prosedyren beskrevet av Damadian, Shawayri, og Bricker, med små modifikasjoner. Den syre maserasjon metoden gir raske og pålitelige estimater av nephron tall (som vurdert ved å telle glomeruli) som er innenfor 5% av de som bestemmes ved hjelp av mer avanserte, om enn dyrt, metoder som magnetisk resonans imaging. Videre er syre maserasjon metoden en utmerket høy gjennomstrømming metode for å vurdere nephron tall i et stort antall prøver eller eksperimentelle forhold.

Introduction

Nephron er både grunnleggende strukturelle og funksjonell enhet av nyre¹. Strukturelt, består nephron av glomerulus (blodkar og podocytes) ligger innenfor Bowman ‘ s kapsel og renal tubule, bestående av proksimale tubule, loopen av Henles, og den fremre tubule som opphører i samlerøret. Funksjonelt, er rollen til nephron filtrering og reabsorpsjon av vann og elektrolytter og utskillelsen av avfall. Generelt, nephrogenesis er fullført på 36 uker av svangerskapet hos mennesker og kort tid etter fødselen i flere arter som musen og rotte². Nephron legat refererer til det totale antall nephrons som en person er født med, mens Nephron tall er det totale antall nephrons målt til enhver tid etter fødselen³. Termen nephron nummer og glomerulær nummer brukes ofte om hverandre. Fordi det bare er én glomerulus per nephron, er vurderingen av glomeruli nummer et viktig surrogat for estimering av nephron nummer.

Vurderingen av nephron legat og nephron tall er av klinisk interesse som studier har vist en assosiasjon mellom nephron legat og reduserte nephron tall med en økt forekomst av kardiovaskulær sykdom^{4,5 ,6,7,8,9},^10,11,12,13,^{14, 15}. basert på funn i nyrer ved obduksjon, observerte brenner at hypertensive individer presentert med et lavere antall nephrons enn normotensive individer individer¹⁶. Brenner hypotetisk gjennomsnitt derfor at det er en invers sammenheng mellom nephron tall og risikoen for å utvikle hypertensjon senere i livet. Brenner også hypotetisk gjennomsnitt at en reduksjon i nephron tall ble kompensert for av nephrons som forble. For å opprettholde den normale filtrerings hastigheten i nyrene, vil resterende nephrons kompensere ved å øke deres glomerulær overflateareal (glomerulær hypertrofi), og dermed arbeide for å dempe enhver negativ effekt av nephron tap på nyrefunksjon^{4 ,16}.

Mens beskyttende på kort sikt, glomerulær hypertrofi, på lang sikt, fører til økt natrium og væskeretensjon, økt ekstracellulære væske volum, og økninger i arteriell blodtrykk, fører til en ond sirkel av ytterligere økninger i glomerulær kapillær trykk, glomerulær hyperfiltration, og nephron arrdannelse (sklerose) og skade^4,16.

Innhenting av estimater eller tellinger av nephron tall tilbyr et par eksperimentelle fordeler: 1) det gir informasjon om prosessen med nephrogenesis, som deretter kan knyttes til spesifikke gener eller faktorer i det embryo eller mors-fosterets miljø, og 2) Det er en sammenslutning av nephron tall med kardiovaskulær sykdom, og dermed er det mulig at estimater av nephron tall kan brukes til å forutsi fremtidig kardiovaskulær risiko^{2,17,18, 19} andre priser ^{, 20} priser og ^{, 21} priser og ^{, 22}. i tillegg til mors-fosterets miljø, flere sykdommer direkte innvirkning nephron tall og nyrefunksjon, inkludert aterosklerose, diabetes, hypertensjon, og til og med normal aldring^{2,9, 10,11,12,22,23}. Dermed er vurdering av hele nyre nephron tall viktig å forstå både genetiske og miljømessige faktorer som påvirker nephrogenesis (dvs.nephron legat) og nephron nummer i løpet av en persons liv og de resulterende effektene på nyrefunksjon og kardiovaskulær helse.

For tiden er det flere metoder tilgjengelig for fastsettelse og kvantifisering av nephron nummer, hver med sine egne fordeler og begrensninger^24,25,^{26,27,28 ,29,30}. Sofistikerte metoder for å bestemme hele nyre nephron tall inkluderer stereological metoder, slik som dissector/fractionator metode, og magnetisk resonans imaging^25,26. Ofte betraktet som gull-standarden for å bestemme hele nyre nephron tall, dissector/fractionator metoden er både dyrt og tidkrevende. Nylige fremskritt og forbedring i magnetisk resonans imaging og prosessering har gitt verktøyene til å telle hver nephron individuelt. Imidlertid er magnetisk resonans imaging ikke bare tidkrevende, men også svært kostbart. I tillegg krever både dissector/fractionator metode og magnetisk resonans imaging avansert teknisk ekspertise, og dermed begrense bruken av slike metoder i de fleste forskningslaboratorier.

De fleste metoder for å bestemme nephron nummer gjør tellinger eller estimater basert på identifisering av glomeruli, som de er lett identifiserbare strukturelt. I dette papiret er syre maserasjon metode for å estimere nephron tall i hele nyrene beskrevet og demonstrert²⁷. Den syre maserasjon metoden er rask, pålitelig, og betydelig rimeligere enn andre metoder, for eksempel dissector/fractionator metode og magnetisk resonans imaging. Videre gir syre maserasjon metoden svært repeterbar estimater av nephron tall som er rapportert å være innenfor rekkevidden av de som bestemmes ved hjelp av magnetisk resonans imaging²⁶.

Protocol

Forsyninger og reagenser listet nedenfor er for fastsettelse av hele nyre nephron tall i én mus, det vil si to nyrer. Modifiseringer for bruken av syren maserasjon metoden for rotten er kjennemerke med stjernene. Alle eksperimentelle protokoller likedannet til National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee ved University of Mississippi Medical Center. 1. nyre isolasjons prosedyre Veie mus…

Representative Results

Nedenfor er representative anslag over hele nyre nephron tall fra en etablert mus modell av hypertensjon og en genetisk rotte modell av alder-relaterte kroniske nyresykdom. Nøkkel identifiserende kjennetegn ved glomeruli, slik som en sfærisk struktur med eller uten vedlagt pre-eller post-arterioler eller rørformede strukturer, er uthevet for de som er nye til syre maserasjon metode (figur 1). I d…

Discussion

Med god eksperimentell teknikk, er syre maserasjon metoden ideelt for å estimere nephron tall i hele nyrene. Selv om nyrene er oppløst i syre, glomeruli fortsatt i stor grad intakt og er lett identifiserbare, slik at telling av individuelle glomeruli relativt enkel og grei. Syren maserasjon teknikk er spesielt fordelaktig av flere grunner. For det første er syre maserasjon metoden en rask og praktisk metode som krever relativt lite i forhold til regning og fysisk anstrengelse. Alle reagenser og forbruksvarer som kreve…

Materials

Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable