骨骼肌微血管内皮细胞（MMEC）构成肌毛细血管的内壁，调控肌肉组织与血液之间液体/分子的交换以及（免疫）细胞的迁移。本文所述原代小鼠MMEC的分离方法，可实现对"肌血管单元"的全面体外研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
骨骼肌毛细血管的内皮细胞（骨骼肌微血管内皮细胞，MMEC）构成血液与骨骼肌之间的屏障，调控液体和营养物质的交换，并通过控制免疫细胞迁移来调节针对病原体的免疫反应。为了实现这些功能，MMEC 与其他多种细胞类型（如成纤维细胞、周细胞和骨骼肌细胞）共同形成一个功能性的"肌血管单元"（MVU）。因此，MMEC 及其构成的 MVU 功能障碍可导致多种肌病的发生。然而，MMEC 在生理和病理状态下的调控机制仍未能被充分阐明，而对其机制的解析是开发更特异性肌病治疗策略的前提。对原代 MMEC 在 MVU 背景下的功能进行分离和深入研究，可能有助于更好地理解这些过程。
本文提供了一种通过机械和酶解离方法分离骨骼肌原代小鼠微血管内皮细胞（MMEC）的实验方案，包括纯化及培养维持步骤。
引言
通过 血液、细胞和器官通过毛细血管获得氧气、底物及其他必需分子的供应。这种物质交换发生在最小的血管——毛细血管中。毛细血管由内皮细胞（EC）单层构成，其完整性是维持血管内空间与间质空间之间肌肉稳态有效调节的前提。为了确保可溶性因子和细胞的选择性转运，内皮细胞通过紧密连接和黏附连接相互连接，形成连续的单层结构。 1除了作为营养物质或代谢产物的屏障外，内皮细胞（EC）还调控炎症过程中白细胞的募集。炎症或组织损伤可导致内皮细胞表面黏附分子上调，并促进趋化因子的产生，从而介导白细胞的黏附及其向靶组织的跨内皮迁移。 2因此，内皮细胞在调控炎症过程（如抵御病原体或组织修复）中发挥关键作用。
内皮细胞（EC）功能障碍与血管疾病、慢性肾衰竭、静脉血栓以及严重病原体感染直接相关。此外，内皮细胞几乎始终参与器官特异性自身免疫性疾病，如糖尿病或多发性硬化症3。因此，血液与器官之间的屏障功能由多种细胞类型的协同相互作用所调控。在骨骼肌微血管中，内皮细胞（MMEC）与肌细胞、成纤维细胞和周细胞共同构成一个功能单位，即"肌血管单位"（MVU）。因此，MVU的功能障碍可能在肌病的病理生理过程中发挥关键作用。然而，目前对这些调控机制的深入理解仍然缺乏，从而阻碍了在肌病中发现新的、迫切需要的治疗靶点。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经当地主管部门批准，并依照德国动物福利法（84-02.05.20.13.097）进行。
1. 动物实验的一般说明
- 所有小鼠实验均须依照各机构动物护理与使用委员会的指南进行。
- 将小鼠饲养在标准化条件下，并遵循国际指南，例如实验动物科学协会联合会（FELASA）的规定。
注意：通常，该分离技术可用于不同年龄、性别或遗传背景的小鼠。为获得足够的细胞数量，优先选用 4–10 周龄的雄性小鼠，因为生物学特性可能随年龄和性别而变化。
2. 溶液、培养基和包被的制备
- 通过将 2.2 mL 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）与 200 μL 胶原酶-分散酶（Collagenase-Dispase）和 45 μL 脱氧核糖核酸酶（DNase）混合，制备消化液（DS）。
- 通过将 450 mL DMEM 与 50 mL 胎牛血清（FCS，约 10%）、0.25 mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 μg/mL，约 0.05%）以及 5 mL 青霉素-链霉素（约 1%）混合，制备 500 mL 内皮细胞培养基（ECM）。在玻璃容器中进行无菌过滤（滤膜孔径：0.2 μm），随后将溶液保存于 4 °C。
- 按以下方法包被细胞培养板。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
分离后一天，原代小鼠MMEC和残留的其他细胞形成团块并贴附于培养皿底部（图1A 第1天）。从第7天开始，可观察到扁平且伸长的细胞。然而，仍可见其他细胞（ mostly 为球形细胞）的污染（图1A 第7天）。因此，需进行另一轮CD31阳性筛选 通过 需要MCS。此后，原代小鼠MMEC增殖至约80–90%的密度。达到汇合时，它们通常形成一层不重叠、细胞呈纵向排列的单层细胞图1A 第14天）。由于接触抑制，细胞在汇合后停止增殖。14天后，细胞数量约为5–10 × 105 细胞可用于进一步的研究。
质量控制 通过 使用可固定活力染料 FVD780（用于标记死细胞）、PECAM1（CD31）和 PTPRC（CD45，作为造血来源.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
微血管内皮细胞在所有组织中均发挥屏障功能，其功能障碍会导致相关器官的疾病3。此外，对微血管内皮细胞的器官特异性研究可能为开发新的治疗策略铺平道路。因此，深入理解微血管内皮细胞在生理和病理生理条件下的功能具有重要的科学意义。通过调节白细胞与内皮的相互作用，已成功利用那他珠单抗（natalizumab）治疗多发性硬化症患者，该抗体可阻止淋巴细胞黏附，从而抑制其跨内皮迁移6。然而，包括炎症亚型在内的多种肌病至今仍难以有效治疗。因此，阐明骨骼肌内皮细胞中内皮细胞的特异性特性，可能有助于拓展现有肌病治疗方法或催生新的治疗策略。
永生化内皮细胞系（IECL）已建立并用于多种体外模型。由于具有永生化特性和快速增殖能力，这些细胞系相较于原代微血管内皮细胞具有一定优势。此外，原代培养细胞经过一定时间或传代后可能发生衰老，并丧失或改变其形态及生理功能。然而，IECL仅能保留部分内皮细胞特性，无法完全模拟来源于不同器官的原代微血管内皮细胞的多样性。值得注意的是，目前极少有IECL来源于骨骼肌。迄今为止，仅有一.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由 "Else Kröner-Fresenius-Stiftung"（项目编号 2018_A03，授予 TR）、"Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster"（项目编号 I-RU211811，授予 TR）以及德国研究基金会（DFG，项目编号 INST 2105/27-1、ME 3283/5-1 和 ME 3283/6-1，授予 SGM）资助。插图由 Heike Blum 提供。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | 即用型 |
| ACK 缓冲液 | 150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA 溶于水，pH 7.3 | ||
| 抗小鼠 CD31-FITC（克隆 MEC13.3） | Biolegend | 102506 | 同型对照：FITC 大鼠 IgG2a，κ 同型对照 |
| 抗小鼠 CD45-PE（克隆 30-F11） | Biolegend | 103106 | 同型对照：PE 大鼠 IgG2b，κ 同型对照 |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 碱性成纤维细胞生长因子 |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| 小鼠 CD31 微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| 小鼠 CD45 微珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| 胶原酶-分散酶 | Roche | 10269638001 | 来自V. alginolyticus的胶原酶，来自B. polymyxa的分散酶 |
| Corning Costar 细胞培养处理多孔 6 孔板 | Corning | 3516 | |
| Cy3 标记的抗大鼠 IgG 抗体 | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI（含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂） | Thermo Fisher | P36935 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma Aldrich | D4513 | 牛胰腺来源的脱氧核糖核酸酶 I |
| 焦碳酸二乙酯处理水 | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM，含谷氨酰胺补充剂和丙酮酸 | Thermo Fisher | 31966-021 | 使用前预热至 37 °C |
| dNTP 混合液（10 mM） | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS 管 | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm 细胞筛 | Corning | 352350 | |
| FC 缓冲液 | 0.1% BSA，0.2% NaN3，2 mM EDTA | ||
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | F6178 | 胎牛血清 |
| 可固定活力染料 eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| 镊子（带齿，直头，12 cm） | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| 镊子（带齿，直头，12 cm） | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| 胰岛素注射器 100 Solo 1 mL（Omnifix） | Braun | 9161708V | |
| 大型磁性分离柱（LS 柱） | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 用于 CD45-MACS 步骤 |
| MCS 缓冲液 | 0.5% BSA，2 mM EDTA 溶于 PBS，pH 7.2 | ||
| 中型磁性分离柱（MS 柱） | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | 用于 CD31-MACS 步骤 |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | 磷酸盐缓冲液，即用型 | |
| PCR 缓冲液（5x） | Thermo Fisher | EP0742 | 与逆转录酶配套试剂盒提供 |
| Pecam1 大鼠 α-小鼠 | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P4333 | |
| 原代小鼠肌细胞 | celprogen | 66066-01 | |
| Cdh15（M-钙黏蛋白）引物 | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM 标记 |
| Cldn5（claudin-5）引物 | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM 标记 |
| Ocln（occludin）引物 | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM 标记 |
| Pax-7 引物 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM 标记 |
| Tjp-1（Zonula occludens 1）引物 | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM 标记 |
| 18s rRNA 引物（真核内源性对照） | Thermo Fisher | 4310893E | VIC 标记 |
| qPCR 缓冲液（Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)） | Thermo Fisher | K0231 | 2 × 1.25 mL；每份可进行 200 次反应 |
| 单链随机引物混合物 | Thermo Fisher | SO142 | 随机六聚体引物 |
| 逆转录酶（200 U/μL）+ PCR 缓冲液（5x） | Thermo Fisher | EP0742 | |
| RNase 抑制剂（40 U/μL） | Thermo Fisher | EO0381 | |
| 剪刀（刃长 23 mm，尖/尖） | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| 剪刀（刃长 42 mm，尖/钝） | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating 溶液 | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
参考文献
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
