Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Abstract

De T-cel receptor (TCR) signalering traject bestaat uit een veelheid van bemiddelaars die zenden signalen op de activering van de TCR. Verschillende strategieën zijn voorgesteld en geïmplementeerd voor de identificatie van nieuwe bemiddelaars van TCR signalering, die het begrip van T-cel-processen, met inbegrip van activering en serie selectie zou verbeteren. We beschrijven een screening test waarmee de identificatie van moleculen die van invloed zijn TCR signalering op basis van de activering van de ontwikkeling van thymocytes. Sterke TCR signalen veroorzaken ontwikkelen thymocytes te activeren van apoptotic machines in een proces dat bekend staat als negatieve selectie. Door de toepassing van kinase-remmers kunnen die met doelen die invloed hebben op de TCR signalering overschrijven van het proces van negatieve selectie. De methode beschreven in dit document kan worden gebruikt om remmers van canonieke kinases met gevestigde rollen in de TCR signaalroutes en ook remmers van nieuwe kinases nog op te richten in de TCR signaalroutes te identificeren. De screening strategie hier kan worden toegepast op schermen van hogere doorvoer voor de identificatie van roman druggable doelen in TCR signalering.

Introduction

T-cellen zijn een geslacht van lymfocyten die een centrale rol in het behoud van adaptieve immuniteit spelen. Ze uiten de TCR, die hen in staat stelt om te herkennen hun liganden, bestaande uit een grote histocompatibility complex molecuul (MHC) complexen met een afhankelijke peptide, die zijn te vinden op de oppervlakken van het antigeen-presenteren cellen (APCs). Het genereren van de TCR traject door de interactie van de TCR/MHC signalering is van cruciaal belang voor T-cel activatie en ontwikkeling1.

In T-cel ontwikkeling migreren bot-merg-afgeleide hematopoietische stamcellen (HSCs) naar de thymus, waar ze een differentiatie ondergaan en doorlopen de stadia van T-cel lineage progressie2. Dubbel-positieve (DP) thymocytes, uiting geven aan zowel de CD4 en CD8 coreceptors, zich bezighouden met zelf-peptide/MHC op de APCs. Thymocytes met een matige affiniteit voor hun zelf-peptide/MHC liganden volwassen te worden honkslag-positieve (SP) CD4 of CD8 thymocytes, een proces genoemd als positieve selectie. Thymocytes die buitensporig TCR stimulatie door de zelf-peptide/MHCs ontvangen ondergaan omgekeerd, apoptosis via negatieve selectie3,4. Dit proces van stimulatie-geïnduceerde, caspase-afhankelijke apoptosis kan worden bootste in vitro door het stimuleren van de thymocytes, bijvoorbeeld met anti-CD3/28 antilichaam beklede kralen5. Volwassen T-cellen die overgaan van het selectieproces worden geactiveerd door niet-zelf-peptide/MHC liganden van APCs in de periferie. Zelf-peptide/MHCs nog steeds relevant zijn voor perifere T-cellen, in de context van tonic signalering voor overleving en homeostatische proliferatie, de differentiatie van helper T-cellen en de verhoging van de T-cel reacties op niet-zelf-peptide/MHCs via coagonism6,7,8,9. Hoge-affiniteit TCR binding aan de peptide/MHC-ligand activeert verschillende downstream signaalroutes, waarbij veel signalering moleculen vormen een complex TCR signalering netwerk10. De TCR signaalroutes decennialang zijn bestudeerd, en nog de ontdekking van nieuwe bemiddelaars van het leertraject vertoont geen11,12te verminderen. De modulering van de TCR signaalroutes heeft klinische relevantie en versterkend T-cel Responsie voor immunotherapeutische toepassingen of de remming van T-cel voor de controle van autoimmuniteit13reacties kunt betrekken. Strategieën voor de modulatie van T-cel reacties is voornamelijk afhankelijk van de verstoring van kinase of fosfatase activiteit14,15,16.

We beschrijven een toepassing van een stroom cytometry-gebaseerde assay voor de screening van kleine chemische verbindingen om hun vermogen om het moduleren van de TCR signalering en T-cel activatie17. De bepaling staat of valt met het fenomeen van de thymocytes activeren de apoptosis pathway wanneer blootgesteld aan sterke TCR signalen. De bepaling is voldoende gevoelig voor veranderingen in de sterkte van de stimulatie; thymocytes transgene TCR met peptide/MHC tetramers met toenemende affiniteit uitdrukken aan het broeden resulteerde in een overeenkomstige toename caspase activering-gebruikt als een maatregel van de apoptotic antwoord5. Voor het scherm, wij een bibliotheek van kinase-remmers gebruikt en beoordeeld op hun vermogen om het moduleren van het thymocyte antwoord op sterke TCR signalen.

Verschillende stroom cytometry-gebaseerde of fluorescentie-verslaggever gebaseerde strategieën zijn beschreven voor de high-throughput screening van een assortiment van perifere activering fenotypen in verschillende T-cel subsets. Dergelijke strategieën omvatten het gebruik van genetische fluorescerende verslaggevers om de timing en de omvang van T-cel activatie18te beoordelen, het gebruik van degranulatie als een uitlezing van cytotoxische T-cel-activiteit-19,20, en de analyse van de fosforylering van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij mobiele21signalering.

De screening test hier gepresenteerd is kundig voor met succes het identificeren van stoffen die een remmende werking van canonieke moleculen van de TCR signalering traject, alsook de potentiële, nieuwe verbindingen met remmende effecten op de TCR signalering. Bijvoorbeeld, wij aangewezen remmers van GSK3β en Hsp90 als nieuwe verbindingen op het gebied van T-cel reacties17. De bepaling is in staat om te onderscheiden van de remmers die met de signaaltransductie, te wijten aan een vermindering van de apoptotic reactie, van de effecten van de TCR-onafhankelijk van de remmers op cellulaire toxiciteit interfereren. Naast de inductie van apoptosis meten we ook CD69 opregulatie en TCR Downregulatie als markers van activering. Als TCR signalering netwerken zijn complex, kan het gebruik van meerdere uitlezingen verhogen de kansen moleculen met specifieke effecten op een enkele weg om te ontdekken. Hier introduceren we ook het gebruik van een centrifugeren-onafhankelijke-protocol als een high-throughput alternatief voor de originele protocol tijdens de kleuring van de cellen in voorbereiding voor de stroom cytometrische analyse. De bepaling in dit artikel wordt beschreven gebruikt een kleine samengestelde bibliotheek van kinase-remmers, maar, in principe, kan het worden gebruikt voor hogere doorvoer screening. De bibliotheek van keuze kunt ook allerlei remmers of andere moleculen opnemen.

Protocol

In deze studie werden de 6 - tot 8-week-oude mannelijke en vrouwelijke C57Bl/6 muizen gebruikt. De muizen werden gefokt in de dier faciliteit aan de nationale universiteit van Singapore (Singapore). De nationale universiteit van Singapore institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (IACUC) goedgekeurd alle dierproeven.

1. bereiding van Thymocyte schorsing

  1. De muizen in een CO2 kamer euthanaseren.
  2. Verdere stappen in de kap van een weefselkweek om te voorkomen dat besmetting van de celculturen. Beveilig het karkas van de muis aan de dissectie van bestuur, met behulp van pennen, en spray de muis met 70% ethanol.
  3. Met behulp van een paar van schaar, maken een verticale insnijding aan de ventrale zijde vanaf de buik naar de kaak. Maak verder insnijdingen langs elk van de achterpoten. Rekken van de huid om te bloot van de ribbenkast en het pin omlaag.
  4. Het middenrif en de beide zijden van de ribbenkast vanaf het achterste einde knippen met een schaar. Til de ribbenkast en pin het neer aan bloot de thymus. Aparte de bindweefsels gekoppeld aan de zwezerik en uitpakken van de zwezerik met behulp van een paar gebogen pincet.
  5. Plaats de zwezerik in een putje van de plaat van een 6-well met 5 mL van volledige RPMI media.
    Opmerking: Overweeg 10% houtskool-ontdaan foetale runderserum (FBS) aan de media ter verbetering van de levensvatbaarheid van de thymocyte als een lange wachttijd tussen de dissectie en de stimulatie test wordt verwacht.
  6. Zachtjes Prak de thymus, met het botte uiteinde van een spuit, en de cellen passeren door een zeef van de cel 70 µM. Als alternatief voor het verzamelen van thymocytes in een gezonder voorwaarde, overwegen om twee paar pincet te knijp de zwezerik en de thymocytes verzamelen die stroom uit de serie epitheel.
  7. Ga naar cel tellen, met behulp van een hemocytometer of in een geautomatiseerde cel tellen instrument.

2. titratie van Kinase remmers op concentraties die niet giftig

Opmerking: Deze sectie richt zich op de remmers gereedmaken voor gebruik in de T-cel activeringsscherm staat vermeld. Remmers gebruikt bij hoge concentraties kunnen leiden tot de dood van de cel, die een uitlezing van de T-cel activeringsscherm staat vermeld is. De reeks verdunningen van het remmers is gericht op het bepalen van de uiteindelijke concentratie van de individuele remmers die moet niet het induceren van apoptose onafhankelijk van TCR stimulatie. De bibliotheek van kinase remmers gebruikt in deze studie werd gekocht van een externe leverancier. De lijst van remmers is opgenomen in de Tabel van materialen.

  1. Voorbereiding van platen van kinase-remmers bij lagere concentraties
    1. Ter voorbereiding van een plaat van remmers op 1 mM, voeg toe 10 µL van remmers aan 90 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) voor alle remmers.
      Opmerking: De remmers van de kleine-molecuul-bibliotheek gebruikt in deze studie komt op een voorraad concentratie van 10 mM. Als de remmers in de vorm van een pellet zijn, de stappen aanbevolen reconstitutie van de leveranciers. Indien de remmers worden niet geleverd op 10 mM, bereiden de Inhibitor van de omwenteling-platen op alternatieve juiste concentraties in plaats daarvan, en maak afzonderlijke seriële verdunningen van de remmers met een geschikt verdunningsfactor.
      Let op: In geval van toxische remmers, volg de instructies van de fabrikant betreffende de veilige hantering en verwijdering.
    2. Ter voorbereiding van een plaat van remmers op 0,1 mM, voeg toe 10 µL van remmers van de plaat van 1 mM remmers aan 90 µL van DMSO.
    3. Ter voorbereiding van een plaat van remmers op 0,01 mM, voeg toe 10 µL van remmers van de plaat van 0.1 mM remmers aan 90 µL van DMSO.
  2. Behandeling van thymocytes met kinase-remmers
    1. Maak een suspensie van de thymocyte overeenkomstig punt 1.
    2. Thymocytes in volledige RPMI te verkrijgen van een thymocyte suspensie van 5 x 106 cellen/mL verdund.
    3. Breng 200 µL van thymocyte schorsing in alle putjes van een 96-wells-plaat, met behulp van een meerkanaalspipet.
    4. Voeg aan elk putje, 2 µL van remmers van de corresponderende goed van de plaat die 1 mM inhibitors (de uiteindelijke concentratie van de remmers is 10 µM).
    5. Bereiden in de dezelfde plaat, vier putjes van onbehandelde controles, vier putjes van 5 µM dexamethason behandeld positieve controles en vier putjes van voertuig-behandelde negatieve controles, door toevoeging van 2 µL van DMSO.
    6. Incubeer de thymocytes in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 17-20 h (of 's nachts).
  3. Bepaling van de geschikte concentratie van individuele remmers
    1. Draai de plaat van thymocytes bij 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 250 µL van FACS was buffer.
    2. Voer een flow cytometrische analyse van de monsters en analyseren de resultaten met een stroom cytometry analyseprogramma.
    3. Het bepalen van het percentage van levende cellen op basis van FSC-WS gating. De gating strategie is afgebeeld in figuur 1B.
    4. Een gemiddelde berekenen van het percentage van levende cellen op basis van de DMSO-behandelde controles, die worden genormaliseerd op 100%. Stel een willekeurige venster van aanvaardbare celdood (e.g.,20%). Remmers, dat in een percentage van levende cellen onder dit venster (dwz., minder dan 80% van de DMSO-behandelde controles resulteerde) moeten opnieuw worden getest bij lagere concentraties.
    5. Voor de remmers die niet aan de criteria van de levensvatbaarheid in stap 2.3.4 voldoen deed, herhaalt u de stappen uit stappen 2.2.1 - 2.3.4, maar gebruik de plaat van remmers op 0.1 mM voor stap 2.2.4 in plaats van de plaat die de inhibitors van 1 mM. De uiteindelijke concentratie van remmers gebruikt hier is 1 µM.
    6. Voor de remmers die nog steeds produceren hoge niveaus van celdood op 1 µM, test de remmers op 0.1 µM. Herhaal stap 2.2.1 - 2.3.4, maar gebruik de plaat van remmers op 0,01 mM in stap 2.2.4. De uiteindelijke concentratie van remmers gebruikt hier is 0.1 µM.
  4. Voorbereiding van een voorraad plaat van kinase-remmers
    1. Voor remmers te worden aangewend ter 10 µM, voeg toe 10 µL van 10 mM remmers aan 10 µL van DMSO.
    2. Remmers te worden aangewend ter 1 µM, voegt toe 1 µL van 10 mM remmers aan 19 µL van DMSO.
    3. Remmers worden gebruikt op 0.1 µM, voegt toe 1 µL van 10 mM remmers aan 199 µL van DMSO (Figuur 1 c).
      Opmerking: De bereid voorraad plaat van remmers is 500 x de concentratie van de beoogde uiteindelijke concentratie wanneer toegevoegd aan de thymocyte schorsingen. De voorraad plaat van remmers kan bereid worden in PCR banden of in 96-wells-platen.
    4. De voorraad plaat van kinase-remmers kan worden toegepast op thymocytes voor screening in een conventionele centrifugeren-afhankelijk systeem (sectie 3; Zie figuur 1A, methoden 1 en 2) of in een alternatieve centrifugeren-onafhankelijke systeem (sectie 4; Zie Figuur 1A, methode 3).

3. kinase Inhibitor bibliotheek Screening (conventionele Centrifuge gebaseerde Assay)

  1. Behandeling van thymocytes met kinase-remmers
    1. Maak een suspensie van de thymocyte overeenkomstig punt 1.
    2. Thymocytes in volledige RPMI te verkrijgen van een thymocyte suspensie van 5 x 106 cellen/mL verdund.
    3. Voeg 200 µL van thymocytes aan elk putje van een 96-wells-plaat, met behulp van een meerkanaalspipet. Plaats de plaat op ijs.
    4. Voeg toe 0,5 µL van remmers aan de 96-wells-plaat van de overeenkomstige putjes van de Inhibitor van de omwenteling voorraad plaat bereid in punt 2.4.
    5. Acht putjes van onbehandelde controles voor te bereiden. Bereiden vier putjes van voertuig-behandelde controles door toevoeging van 0,5 µL van DMSO. Bereiden vier putjes van 5 µM dexamethason-behandelde controles (Figuur 2).
  2. Stimulatie van thymocytes met behulp van anti-CD3/CD28 kralen
    1. Neem 1 mL van kralen en wassen van de kralen met 2 mL PBS. Scheiden van de parels met behulp van een magnetische standaard en de oplossing gecombineerd. Resuspendeer de kralen in 5 mL van volledige RPMI.
      Opmerking: De verhouding tussen de kralen aan cellen is 1 tot en met 2.5. Pas de hoeveelheid kralen te nemen, afhankelijk van het aantal putten te stimuleren en het aantal thymocytes gebruikt.
    2. Voeg toe 50 µL van parels aan elk monster Inhibitor van de omwenteling-behandeld, de vier monsters van DMSO-behandeld, en vier van de acht onbehandelde monsters. Voeg 50 µL van volledige RPMI aan de resterende vier onbehandelde putjes. Figuur 2 toont de algemene lay-out van de plaat.
    3. Meng de inhoud van de putjes met behulp van een meerkanaalspipet.
    4. Incubeer de thymocytes in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 17-20 h (of 's nachts).
  3. Kleuring van oppervlakte antigenen
    1. Een antilichaam kleuring mengsel met anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 en anti-CD69 antilichamen voor te bereiden. Antilichamen in FACS was buffer (PBS aangevuld met 0,5% bovien serumalbumine [BSA]) verdund in een verhouding van 1:200 (v/v).
      Opmerking: Overwegen optimaliseren van antilichamen titers gebruikt voor de kleuring, in plaats van met behulp van vaste antilichaam verdunningen, tot een minimum beperken van variatie in kleuring over verschillende experimenten en ter verbetering van de signal-to-noise verhouding.
    2. Draai de plaat bij 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 min.
    3. Flick de plaat om te negeren van de oplossing.
    4. Op dit punt, het protocol het conventionele centrifuge-afhankelijke protocol kunt volgen (gaat u verder met stap 3.3.5; Zie figuur 1A, methode 1) of de alternatieve centrifugeren-onafhankelijke-protocol (gaat u verder met stap 4.4.4; Zie figuur 1A, methode 2).
    5. Resuspendeer de cellen in 75 µL van het kleuring antilichaam mengsel bereid in stap 3.3.1.
    6. Meng de monsters met behulp van een meerkanaalspipet en broeden ze op het ijs gedurende 30 minuten.
  4. Fixatie van de cellen
    1. Was de putjes met 200 µL van FACS was buffer en draaien van de plaat bij 300 x g - en 4 ° C, gedurende 5 min.
    2. Flick de plaat om te negeren van de oplossing.
    3. Toevoegen van fixatie/permeabilization buffer (komt met de actieve caspase-3 apoptosis kit; hetzelfde met de 10 x perm/afwas buffer vermeld in stap 3.5.1 en het anti-caspase-3 antilichaam in stap 3.5.2) op 200 µL per putje.
    4. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  5. Intracellulaire kleuring voor actieve caspase-3
    1. 1 x perm/afwas buffer bereid door verdunning van 5 mL 10 x perm/afwas buffer in 45 mL ultrazuiver water.
    2. Intracellulaire actieve caspase vlek voor te bereiden door toevoeging van 1.3 mL anti-caspase-3 antilichaam tot 6,5 mL 1 x perm/afwas buffer. De verhouding van antilichaam aan het perm/afwas buffer is 1:5.
    3. Draai de plaat duikt met 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 min. Flick de plaat te ontdoen van de oplossing. Wassen van de plaat met 200 µL van 1 x perm/afwas buffer.
    4. Herhaal stap 3.5.3.
    5. Draai de plaat duikt met 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 min. Flick de plaat te ontdoen van de oplossing. Voeg 75 µL van intracellulaire caspase vlek bereid in stap 3.5.2 aan alle putjes.
    6. Meng de monsters met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
    7. Wassen van de monsters met 200 µL van 1 x perm/afwas buffer en de plaat bij 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 minuten draaien.
    8. Flick de plaat om te negeren van de oplossing. Wassen van de plaat met 200 µL van 1 x perm/afwas buffer. Draai de plaat bij 300 x g en 4 ° C, gedurende 5 min.
    9. Flick de plaat om te negeren van de oplossing en resuspendeer de monsters in 200 µL van FACS was buffer.
    10. Voer een flow cytometrische analyse van de monsters en analyseren de resultaten met een FACS analyseprogramma.
    11. Met behulp van een CD4 versus CD8 plot, poort van de populatie van DP thymocytes met een positieve uiting van zowel CD4 en CD8 (Figuur 2, onderste helft). Binnen de DP thymocyte gate, bepaalt het percentage cellen met geactiveerde caspase-3, met behulp van het ongestimuleerde monster als de negatieve controle en dexamethason als positieve controle. Voor de analyse van de uitdrukking van CD69 in de DP thymocyte poort, gebruik het ongestimuleerde monster als de negatieve controle en het gestimuleerd monster als positieve controle.
      Opmerking: Wanneer gating op de DP-thymocytes, controleren of dat de bevolking van DP thymocytes correct is gated voor afzonderlijke monsters. Gestimuleerd cellen downregulate oppervlakte coreceptors en een onbedoelde uitsluiting van evenementen kan optreden als een strakke DP-poort wordt gebruikt.

4. kinase Inhibitor bibliotheek Screening (Centrifuge-onafhankelijke Assay)

  1. Behandeling van thymocytes met kinase-remmers
    1. Maak een suspensie van de thymocyte overeenkomstig punt 1.
    2. De thymocytes in volledige RPMI te verkrijgen van een thymocyte suspensie van 25 x 106 cellen/mL verdund.
    3. Voeg 40 µL van thymocytes aan elk putje van de plaat van een kleine-volume, met behulp van een meerkanaalspipet. Plaats de plaat op ijs.
    4. Verdun de remmers van de voorraad plaat, DMSO en dexamethason in volledige RPMI in een verhouding van vier delen van complete RPMI tot een deel van de Inhibitor van de omwenteling/DMSO/dexamethason (verdunningsfactor van 5).
      Opmerking: Zoals welke volumes zijn opgebruikt in deze kleine-volume plaat 5 x kleiner dan bij de conventionele methode, de-remmers en de controle reagentia worden verdund vijfvoud is voordat u deze toevoegt aan de thymocytes in de plaat.
    5. 0,5 µL van remmers aan de 96-wells-plaat uit de overeenkomstige putjes van de plaat van de Inhibitor van de omwenteling bereid in stap 4.1.4 toevoegen.
    6. Acht putjes van onbehandelde controles voor te bereiden. Bereiden vier putjes van voertuig-behandelde controles door toevoeging van 0,5 µL van het DMSO bereid in stap 4.1.4. Bereiden vier putjes van 5 µM dexamethason-behandelde controles, met behulp van de verdunde dexamethason bereid in stap 4.1.4 (Figuur 2).
  2. Stimulatie van thymocytes met behulp van anti-CD3/CD28 kralen
    1. Zorg ervoor dat de kralen zijn uniform geresuspendeerde. Neem 1 mL van kralen en was ze met 2 mL PBS. Scheiden van de parels met behulp van een magnetische standaard en de oplossing gecombineerd. Resuspendeer de kralen in 1 mL van volledige RPMI.
      Opmerking: De verhouding tussen de kralen aan cellen is 1 tot en met 2.5. Pas de hoeveelheid kralen, afhankelijk van het aantal putten te stimuleren en het aantal thymocytes gebruikt.
    2. 10 µL van schorsing van de kraal aan elk monster Inhibitor van de omwenteling-behandeld, de vier monsters van DMSO-behandeld, en vier van de acht onbehandelde monsters toevoegen. 10 µL van volledige RPMI aan de resterende vier onbehandelde putten toevoegen. Figuur 2 toont de algemene plaat lay-out.
      Opmerking: Het eindvolume van de putten is 50 µL, die binnen de maximale capaciteit van de putten. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn en te houden van de platen rechtop, om te voorkomen dat kruis-well morsen.
    3. Als u wilt mengen, doorroeren de plaat met behulp van een microplate rondschudapparaat. Als alternatief, meng de inhoud van de putjes met behulp van een meerkanaalspipet.
    4. Incubeer de thymocytes in een 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 17-20 h (of 's nachts) met een anti-verdamping deksel.
  3. Installatie van de plaat wasmachine
    Opmerking: De instructies voor het instellen van de wasmachine plaat worden geleverd door de fabrikant. De stappen hieronder worden in het kort. Ongeveer is 150 mL oplossing nodig voor elke priming stap.
    1. Prime het wassen systeem met 70% ethanol met 1% Tween-20.
    2. Prime het wassen systeem met gedeïoniseerd water met 1% Tween-20.
    3. Prime het wassen systeem met FACS was buffer.
  4. Kleuring van oppervlakte antigenen
    1. Een antilichaam kleuring mengsel met anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 en anti-CD69 antilichamen voor te bereiden. Verdun de antilichamen in FACS was buffer bij een verhouding van 1:100 (v/v).
    2. Wassen van de plaat 9 x, met behulp van 55 µL van FACS was buffer per wasbeurt, met behulp van de geautomatiseerde laminaire flow wassen systeem.
      Opmerking: Aan het einde van de wasbeurten, zal er 25 µL van restvolume in elk putje.
    3. Resuspendeer de cellen in 25 µL van het kleuring antilichaam mengsel bereid in stap 4.4.1.
    4. Als de monsters worden opgehaald uit een 96-wells-plaat (uit stap 3.3.4), resuspendeer de cellen in 50 µL van het mengsel van de antilichaam bereid in stap 3.3.1 en overbrengen van de monsters naar de kleine-volume plaat. Deze stap komt overeen met de methode nummer 2, zoals afgebeeld in figuur 1A.
    5. Als u wilt mengen, doorroeren van de plaat met een roteerschudapparaat microplate of meng de monsters met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer op ijs voor 30 min.
  5. Fixatie van de cellen
    1. Wassen van de plaat 9 x, met behulp van 55 µL van FACS was buffer per wasbeurt, met behulp van de geautomatiseerde laminaire flow wassen systeem.
    2. Toevoegen van fixatie/permeabilization buffer (komt met de actieve caspase-3 apoptosis kit; hetzelfde met de 10 x perm/afwas buffer vermeld in stap 4.6.1 en het anti-caspase-3 antilichaam in stap 4.6.2) op 50 µL per putje.
    3. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  6. Intracellulaire kleuring voor actieve caspase-3
    1. Bereiden 1 x perm/afwas buffer door 25 mL 10 x perm/afwas buffer in 225 mL ultrazuiver water verdunnen.
    2. Intracellulaire actieve caspase vlek voor te bereiden door toevoeging van 1 mL van anti-caspase-3 antilichaam aan 2 mL 1 x perm/afwas buffer. De verhouding van antilichaam aan het perm/afwas buffer is 1:2.
    3. Prime het wassen systeem met 1 x perm/afwas buffer.
    4. Wassen van de plaat 9 x met 1 x perm/was buffer, bij 55 µL voor elke wassen.
    5. Voeg 25 µL van de intracellulaire caspase-vlek bereid in stap 4.6.2 aan alle putjes.
    6. Als u wilt mengen, doorroeren van de plaat met een roteerschudapparaat microplate of meng de monsters met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
    7. Wassen van de plaat 9 x met 1 x perm/was buffer, bij 55 µL voor elke wassen.
    8. Voeg 25 µL van FACS was buffer toe aan alle putjes.
    9. De monsters naar microtiterplaat buizen na voldoende mengen via pipetteren overbrengen.
    10. Voeg een andere 50 µL van FACS was buffer toe aan het lege putjes en herhaal stap 4.6.9.
    11. Herhaal stap 4.6.9 en 4.6.10 2 x tot 200 µL van de monsters worden verzameld in de buizen van de microtiterplaat.
      Opmerking: Het doel van de procedures die zijn beschreven in stap 4.6.10 en 4.6.11 is een maximale herstel van de cellen van de kleine-volume plaat te waarborgen. Als cel niet gelijk niet een bron van zorg, na stap 4.6.10 zijn, buizen gewoon top-up de microtiterplaat tot 200 µL met FACS was buffer.
    12. Voer een flow cytometrische analyse van de monsters en analyseren de resultaten met een FACS analyseprogramma, per stap 3.5.11. Activering van caspase-3 en CD69 expressie worden geanalyseerd in de poort met CD4+CD8+DP thymocytes.

Representative Results

De aanpak van de screening test is samengevat in figuur 1A. De kinase-remmers werden voor het eerst vertoond voor hun latente effecten op de levensvatbaarheid van de thymocyte. Als positieve controle voor apoptose, werd dexamethason gebruikt als een agent proapoptotic. De gating voor de levende cel bevolking werd bepaald op basis van de onbehandelde negatieve controles en de dexamethason behandeld positieve (figuur 1B). De remmers werden voor het eerst getest op 10 µM op thymocytes, en het aantal levensvatbare cellen werd gemeten na incubatie gedurende 18 uur. Een venster van 20% voor celdood werd zodanig gekozen dat de verbindingen die veroorzaakte een groter dan 20% verlies van cellen in de levende cel poort, in vergelijking met de monsters DMSO-behandeld, werden getest bij lagere concentraties (figuur 1B). Representatieve FACS percelen van de Inhibitor van de omwenteling-behandelde steekproeven worden getoond ter illustratie van de bepaling van de levensvatbaarheid. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), een PI3K remmer22, de dood van de cel op 10 µM niet sterk verhogen en de Inhibitor van de omwenteling werd gebruikt op 10 µM voor de daaropvolgende testen. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), een dubbele inhibitor van PI3Kα/mTOR23, veroorzaakte hoge niveaus van celdood op 10 µM en op 1 µM maar niet op 0.1 µM en 0.1 µM was vastgesteld dat de geschikte concentratie voor toepassing in downstream testen. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), een pan-proteïne kinase C-remmer met een vastgestelde capaciteit voor het opwekken van apoptosis24, veroorzaakte aanzienlijke celdood in alle concentraties getest, zelfs bij 0.1 µM. Het werd als een extra positieve controle gebruikt in daaropvolgende testen op 0.1 µM.

De eindconcentraties van de remmers werden geselecteerd op basis van de hoogste concentraties waarin ze niet celdood door meer dan 20% van de monsters van DMSO-behandeld versterken deed. Met de eindconcentraties van de remmers bepaald, een voorraad plaat van remmers opgesteld zodat alle de remmers 500 maal de concentratie waren wanneer toegepast op de cellen. Figuur 1 c illustreert de indeling van de plaat van de voorraad plaat, met de eindconcentraties van de remmers. In het alternatieve protocol van de cellen rechtstreeks in de platen van de kleine-volume voor de laminaire flow wassen assay het broeden, noodzakelijk het gebruik van kleine hoeveelheden een verdere verdunning van de remmers. Om ervoor te zorgen dat de inhoud van de DMSO van de culturen na toevoeging van de remmer zou niet te hoog voor de cellen, de remmers werden verder verdund in volledige RPMI, met een verdunningsfactor 5, zodanig dat ze op 100 maal de voorgenomen concentratie waren wanneer toegepast op de cellen.

De remmers, verdund tot de concentratie van het niet giftig, werden gebruikt in de bepaling voor TCR-stimulatie-veroorzaakte apoptosis in thymocytes5,17. De stimulatie werd uitgevoerd met behulp van anti-CD3/CD28 kralen voor 18u, en de cellen werden vervolgens gekleurd voor de activering van caspase-3 in de CD4+ en CD8+ DP thymocyte bevolking (Figuur 2). Een toename van de activering van caspase-3 en CD69 expressie, en ook een TCR Downregulatie, werden waargenomen in zowel de anti-CD3/CD28-gestimuleerd en de DMSO-mock-testgroep anti-CD3/28-gestimuleerd monsters, in vergelijking met de nonstimulated monsters. De monsters van dexamethason behandeld sprake van een toename in activering van caspase-3 onafhankelijk van CD69 opregulatie, die van het apoptose-inducerende-effect is onafhankelijk van TCR stimulatie wordt verwacht.

Figuur 3A geeft een overzicht van de resultaten van de screening assay voor geselecteerde remmers bibliotheek. Zowel de activering van caspase-3 en de CD69 kunnen worden gebruikt voor identificatie van potentiële remmers van belang als gevolg van de onderdrukking van de expressie. Zoals verwacht, opdagen remmers van canonieke bemiddelaars van TCR signalering als positieve hits in de schermen. Deze remmers, die tentoongesteld wisselend remmende potentie, opgenomen breedspectrum remmers die gericht zijn op meerdere kinases en ook meer specifieke remmers. Sommige remmers waren in staat om zowel activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (figuur 3B, bovenste rij, linker panelen) te onderdrukken. Één dergelijke remmer is bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), die alle proteïne kinase C isoforms, naast proteïne kinase A en PDK125,26,27remt. Een ander remmer in deze categorie is CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), een voorgestelde inhibitor van IKK228.

Er zijn verbindingen die geremd CD69 opregulatie maar deed geen afbreuk doen aan de activering van caspase-3 (figuur 3B, bovenste rij, rechts panelen). CAY10626, een inhibitor van PI3Kα en mTOR23, en U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] methyleen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), een MEK-remmer29, waren enkele van de geïdentificeerde remmers. Uit de resultaten blijkt dat verschillende remmers richten verschillende kinases van specifieke takken van de TCR signalering traject, met name die welke gericht op late-stadium kinases, leiden de selectieve schending van T-cel activatie verschijnselen tot kunnen.

Er waren ook remmers die niet CD69 opregulatie zowel activering van caspase-3 (figuur 3B, onderste rij, linker panelen onderdrukken deed). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - r - hydroxy-benzenepropanoic zuur, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), een disruptor van microtubulus dynamics30en necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), een inhibitor van de omwenteling van RIP1 kinase31, zijn twee remmers geïdentificeerd worden in deze categorie. In dergelijke gevallen waar CD69 opregulatie en activering van caspase-3 niet aangetast waren, dit kan worden als gevolg van de remmers niet gericht op een relevante kinase van de TCR signalering traject.

Zoals eerder vermeld, werd staurosporine gebruikt in de schermen, met een concentratie die nog apoptosis in de thymocytes veroorzaakte. Zoals verwacht, bleek het monster staurosporine-behandelde hoge niveaus van activering van caspase-3 (figuur 3B, onderste rij, rechterkolom). De lage niveaus van CD69 expressie kunnen worden toegeschreven aan de remming van staurosporine-gemedieerde van PKC, zoals bisindolylmaleimide II, een andere pan-PKC-remmer, ook de expressie van CD69 onderdrukt. U kunt ook veroorzaakte staurosporine apoptosis in de cellen voordat ze upregulate konden de expressie CD69.

Om te vergroten de gegevensdoorvoer en de automatisering van het protocol, werden parallelle protocollen die het gebruik van een geautomatiseerd plaat systeem via laminaire flow wassen voorbereid. Twee afzonderlijke protocollen gebruik van dit geautomatiseerde plaat wassen apparaat waren trialed en vergeleken met de conventionele methode van kweken van cellen in 96-wells-platen en vlekken van de cellen in een centrifugeren-afhankelijke protocol. Één methode betrokken kweken van de cellen in 96-wells-platen, volgens de standaardprocedure, en vervolgens de cellen overbrengen naar platen compatibel is met de geautomatiseerde plaat wasmachine voor de kleuring stappen (Figuur 4, DA-wassen monsters). De andere methode betrokken kweken de cellen rechtstreeks in de plaat-wasmachine-compatibele platen en wilt doorgaan met het kleuring protocol op de dezelfde plaat (Figuur 4, DA-cultuur monsters). De protocollen van centrifugeren-onafhankelijke geef niet veel waarneembare verschillen in actieve caspase-3, CD69, of TCRβ kleuring over de verschillende monsters getest, in vergelijking met de conventionele centrifugeren-afhankelijke protocol (Figuur 4). Verschillen in de intensiteit van kleuring kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van antilichamen bij lichtjes verschillende concentraties tijdens de kleuring stappen.

Figure 1
Figuur 1 : Thymocyte levensvatbaarheid na behandeling met inhibitoren. (A) experimentele overzicht van de belangrijkste stappen in de screening test. Er zijn drie voorgestelde methoden voor het stimuleren en kleuring van het thymocytes gebruikt in de activering assay, namelijk (1) de kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen, gevolgd door de kleuring met een conventionele centrifugeren gebaseerde protocol, (2) kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen, gevolgd door de kleuring met behulp van een protocol centrifugeren-onafhankelijke wassen, en (3) het kweken van thymocytes in kleine volumes platen, gevolgd door de vlekken in de dezelfde platen met behulp van een centrifugeren-onafhankelijke wassen protocol. (B) Gating strategieën gebruikt in het testen van de levensvatbaarheid. De levende cel poort was afgeleid van de voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) percelen, als eerder beschreven17. Remmers die werden geacht te zijn ook giftig bij de geteste concentratie waren onderworpen aan verdere levensvatbaarheid testen bij 10-fold lagere concentraties. Representatieve monsters van de Inhibitor van de omwenteling-behandeld worden weergegeven. Opmerking het gemeenschappelijk besturingselement (DMSO-behandeld [DMSO]) wordt gebruikt voor de 1 µM en 0.1 µM monsters. (C) plaat lay-out van verdunde remmers. Een schematische weergave van de platen van remmers verdund in DMSO tot een concentratie van 500 x de beoogde uiteindelijke concentratie. Elk vertegenwoordigt goed een unieke remmer; de grijze putten zijn leeg. De concentraties die weergegeven zijn de uiteindelijke concentratie wanneer toegevoegd aan de celculturen, namelijk 10 µM (donkerrood), 1 µM (fuchsia) en 0.1 µM (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Plaat lay-out van de bepaling van de activering thymocyte. (Boven) Kolommen 1 en 12 zijn gereserveerd voor besturingselementen, terwijl de kolommen 2 tot en met 11 remmer behandeld monsters (beige zijn). De negatieve controle (nonstimulated [NS]; grijs) bezet wells A1 naar D1, en de positieve controle voor de dood van de cel (dexamethason behandeld [DEX]; paars) bezet putten E1 tot en met H1. Kolommen 2 tot en met 12 bevatten thymocytes gestimuleerd met anti-CD3/CD28 kralen. De positieve controle voor thymocyte activering (gestimuleerd monsters [α-CD3/CD28]; groen) bezet wells A12 D12, en de controle van het voertuig (gestimuleerd en DMSO-behandeld [α-CD3/CD28 + DMSO]; rode) putten E12 tot H12 in beslag neemt. (Onder) Stroom cytometry percelen voor actieve caspase-3 (ActCasp3), CD69, en TCRβ vlekken van thymocytes gated binnen de dubbel-positieve (DP) poort. Representatieve percelen van de verschillende besturingselementen worden weergegeven. NS = nonstimulated; DEX = dexamethason behandeld monsters; Α-CD3/CD28 + DMSO = monsters gestimuleerd met CD3/CD28-gecoate kralen en behandeld met DMSO; Α-CD3/CD28 = monsters gestimuleerd met CD3/CD28-gecoate kralen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Screening van de Inhibitor van de omwenteling-bibliotheek op thymocyte activering. (A) samengevatte gegevens voor de bepaling van de activering. Dit zijn de resultaten van een representatieve experiment toont de genormaliseerde waarden van cellen met geactiveerde caspase-3 en CD69 uitdrukking voor geselecteerde remmers. Normalisatie werd gedaan door het vergelijken van het percentage van de cellen in de actieve caspase-3-positieve of CD69-positieve poort naar de waarde van het besturingselement DMSO-behandeld, die is ingesteld op een relatieve waarde voor 0 in de grafiek. (B) geselecteerd FACS percelen. Stroom cytometry percelen van remmers die onderdrukt zowel activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (links boven), alleen CD69 opregulatie (rechtsboven) onderdrukt, of hadden geen effect op de activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (linksonder). Percelen van het monster staurosporine-behandeld worden weergegeven om te illustreren de effecten van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling in toxische concentraties (rechtsonder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Vergelijking van de protocollen van de verschillende assay. Stroom cytometry percelen voor actieve caspase-3 (ActCasp3), CD69, en TCRβ kleuring van DP thymocytes na de drie verschillende assay protocollen. Vier verschillende voorwaarden worden getest, namelijk de negatieve controle (nonstimulated [NS]), de positieve controle voor de dood van de cel (dexamethason behandeld [DEX]), de controle van het voertuig (gestimuleerd en DMSO-behandeld [α-CD3/CD28 + DMSO]), en een inhibitor van de omwenteling-behandeld monster (gestimuleerd en PIK-75-testgroep [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Conventionele = het kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen en kleuring met een conventionele centrifugeren-gebaseerd protocol; DA-wassen = het kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen en kleuring met behulp van een laminaire flow wassen protocol; DA-cultuur = de kweken van thymocytes in kleine volumes platen en vlekken in de dezelfde platen met behulp van een laminaire flow wassen protocol.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De hier voorgestelde strategie voor de screening evalueert het vermogen van kleine-molecuul remmers te onderdrukken de apoptotic effecten in thymocytes na stimulatie, naast meer conventionele markers van T-cel activatie-CD69 opregulatie en TCR Downregulatie . Extra markeringen kunnen ook worden opgenomen om de analyse van verschillende thymocyte deelverzamelingen32. Een interessant aspect van de huidige bepaling ligt in het feit dat remmers die TCR signalering belemmeren zou ook het temperen van de inductie van apoptosis, verder benadrukt het onderscheid van TCR-onafhankelijke effecten die de remmers wellicht op inducerende celdood. Bovendien kan een stroom cytometry-gebaseerde bepaling het gebruik van meerdere uitlezingen als afzonderlijke activering markeringen, die de effecten van de remmers op aparte afzonderlijke takken van TCR signalering kunnen verslag. In het geval hier gepresenteerd, waren er remmers die een differentiële remming van activering van caspase-3 en CD69 opregulatie toonde. Omdat sommige verbindingen huishouden functies zoals eiwitsynthese of vesiculaire handel beïnvloeden kunnen, is het niet verwonderlijk te observeren van de effecten op de opregulatie van DOVO gesynthetiseerd markers (bijv CD69) maar niet op posttranslationele wijzigingen (bijvoorbeeld de Proteolytische activering van caspase-3).

Als de test aangeboden hier maatregelen apoptosis als een uitlezing, is het noodzakelijk dat de latente toxische effecten van de remmers niet van de resultaten verhullen doen. Bijvoorbeeld, in het scherm deden we niet verdunnen staurosporine dan 1 nM, ondanks dat het nog steeds giftig voor de cellen bij die concentratie. De representatieve resultaten zijn in overleg met de staurosporine wordt een promiscue kinase inhibitor en een inductor van apoptosis33. Zonder een voldoende verdunning van de stoffen niet giftig concentraties getest, is het mogelijk om te overzien van mogelijke hits.

De strategie van de screening gedetailleerde hier zou moeilijk toe te passen op de mens als gevolg van de complicaties geassocieerd met het verkrijgen van voldoende aantal thymocytes voor high-throughput screening. Het is echter mogelijk te krijgen menselijke thymus monsters pediatrische cardiale biopsieën34,€35 of36,37€ foetussen. Echter als de TCR signalering trajecten en de aminozuur sequenties van signalering eiwitten zijn grotendeels bewaard tussen muizen en mensen, de bepaling van de thymocyte biedt een nuttig oriënterende strategie en geen resultaten verkregen met deze test met behulp van de muis thymocytes kan vervolgens worden geverifieerd bij primaire menselijke lymfocyten.

Een beperking van de conventionele centrifugeren-afhankelijke protocol heeft betrekking op het vooruitzicht van verlies van de cel, die kan worden toegeschreven aan de meerstaps aard van het proces, waarbij stappen zoals cel permeabilization en centrifugeren. Elke centrifugeren en resuspensie stap leidt onvermijdelijk tot verlies van cellen. Hoewel dergelijke verliezen niet kritiek voor studies waarbij een beperkt aantal monsters worden kunnen, kan het problemen wanneer toegepast in hogere-throughput screening, met name als de assay formaat vordert van 96 - tot 384 - tot 1536-well opleveren. Eén manier om dit probleem te omzeilen is door het gebruik van cel-permeabele fluorescerende caspase sensoren38 , waarmee de opsporing van de activering van caspase terwijl het vermijden van de complicaties van cel permeabilization en meerdere wasbeurten5. Anderzijds is het ook mogelijk voor het minimaliseren van de cel verlies een centrifugeren-onafhankelijke methode voor het wassen van cellen door laminaire flow in dienst. Met een geautomatiseerd plaat wassen station in combinatie met een muur-minder plaat, worden de cellen gewassen door laminaire flow zonder het gebruik van een centrifuge. De exponentiële verdunning van reagentia voorziet de grondige en efficiënte spoelen van cellen in minder dan 3 min, die aangeeft van een gelijkwaardige verdunningsgraad twee rondes van centrifugaal wassen. Zonder externe stress als gevolg van centrifugeren, de cellen meer levensvatbaar zijn en cel verliezen worden geminimaliseerd.

Verkenden we ook de mogelijkheid van het gebruik van de geautomatiseerde plaat station wassen na het kweken van de thymocytes in 96-Wells U-bodem platen en, ook, het kweken van cellen rechtstreeks in de muur-minder platen compatibel is met de geautomatiseerde plaat wassen station. Het kweken van cellen in de platen van de muur-minder ingeschakeld de afschaffing van alle stappen van het centrifugeren en cel verlies door het elimineren van de noodzaak van de overdracht van een steekproef over platen tot een minimum beperkt. In het algemeen, de drie verschillende protocollen zijn vergelijkbaar in zowel stimulatie efficiëntie en kleuring. De geautomatiseerde wassen station biedt het voordeel van automatisering, snelheid en efficiëntie, waardoor het makkelijker voor hogere gegevensdoorvoer analyse. Bovendien, met toegenomen automatisering, de stappen wassen kunnen sneller worden uitgevoerd, en er is een grotere samenhang tussen de experimenten of onderzoekers. Echter, het wassen-station heeft bepaalde nadelen: grote volumes van het wassen van buffers vereist zijn voor wasmachine priming (150 mL per buffer wijziging, waarvan 50 mL wordt gebruikt voor het wassen); extra zorg nodig is bij de behandeling van de plaat om te voorkomen dat een kruisbesmetting van de putten te wijten aan de beperkte partitionering tussen de putjes van de plaat van de kleine-volume; residuele buffer van 25 µL in de putten na wassen vereist het gebruik van de reagentia voorbereid op een hoger dan 1 x concentratie. Om zaken van restvolume en de beperkte capaciteit van de plaat, kan een accessoire uit te breiden van het volume van de incubatie van 70 µL tot 150 µL worden toegevoegd, vergemakkelijken van de aanneming van conventionele protocollen. Terwijl geautomatiseerde plaat handlingsystemen momenteel beschikbaar zijn, hebben zij een significante voetafdruk in vergelijking met de laminaire wash systeem, dat een kleine eenheid van ~ 1 kubieke voet (~0.028 m3 is). Bovendien, de integratie van centrifugeren in geautomatiseerde plaat handling-systemen is uitdagend, beperking van het gebruik ervan in cel wassen. Er zijn momenteel geen andere centrifuge-zelfstandige cel wassen instrumenten beschikbaar, voor zover we weten.

De strategie van de screening die hier gepresenteerd is in staat kleine moleculen en hun vermeende doel kinases, die invloed hebben op de TCR signalering en T-cel activatie wordt aangeduid. De bibliotheek gebruikt hier omvat voornamelijk kleine-molecuul remmers van kinases en was in staat om het genereren van een aantal potentieel interessante hits. Het protocol kan ook gemakkelijk worden toegepast op remmer bibliotheken van andere klassen van enzym of naar andere soorten kleine moleculen, alsmede op de bibliotheken van andere stoffen (bijvoorbeeld, verschillende macromoleculen). Het protocol kan ook worden gebruikt om het scherm van andere celtypes, zoals perifere T lymfocyten of vereeuwigd cellen, met inbegrip van die transgene TCRs uiten of het dragen van verslaggever systemen. Identificatie en karakterisering van nieuwe bemiddelaars van T-cel signalering kan verbeteren van onze kennis van de signalering pathway en ook steun bij de ontwikkeling van gerichte therapie in immuun ziekten13,14,15, 16. in alle, deze studie wordt toegevoegd aan het bereik van beschikbare opties voor de detectie van bemiddelaars/mediators van T-cel signalering via high-throughput screening tests.

Disclosures

De auteur Chyan Ying Ke is een medewerker van Curiox Biosystems, die produceert de DA-cel wasmachine en DA-cel platen gebruikt in dit artikel.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale Medical Research Council, NMRC CBRG15may017 en de Singapore ministerie van onderwijs, 2014-T2-1-136 (voor N.R.J.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Tags

Immunologie en infecties probleem 143 activering van Caspase-3 kinase-remmers bibliotheek screening TCR signalering T-cel activatie thymocyte selectie
Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering <em>via</em> de Screening van chemische remmer bibliotheken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek,… More

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter