多孔硅薄膜作为神经生长因子载体的设计

ngf 是外周神经系统 (pns)¹中神经元发育和维持的关键, 对中枢神经系统 (cns) 2 基底前脑胆碱能神经元的存活和功能起着至关重要的作用.它治疗阿尔茨海默氏症和帕金森症等中枢性神经退行性疾病的高药理潜力已得到广泛证实, 临床试验目前正在进行^{3,4,5, 6}。向中枢神经系统输送 ngf 的最大挑战在于它无法跨越血脑屏障 (bbb), 而系统地给^药7。此外, ngf 对快速酶降解的敏感性使其半衰期较短, 并显著限制其治疗用途^8,9。因此, 在设计能够以安全的方式长期和可控地释放 ngf 的交付系统方面存在着未得到满足的挑战。研究了各种 ngf 输送系统, 包括基于聚合物的系统,^{10、11、12、13、14、15} 、^16,17. 这些系统的释放概况的特点往往是明显的初始爆裂, 然后是缓慢的连续释放, 在后一阶段, 释放率与最初的爆裂相比明显较低^{11 ,18,19}。此外, 在封装过程^中, 观察到聚合物的酸性降解产物 (如聚 (乳酸-乙二酸) 对蛋白质的失活或在封装过程中 ngf 生物活性的丧失。

纳米结构 psi 具有多种吸引人的特性, 包括其高表面积、大孔体积、生物相容性和体液中可调谐的降解性, 注定了它是一个有前途的药物输送平台^{21, 22、23、24、25、26、27、28}。通过正确选择阳极氧化条件, 可以轻松调整 psi 结构特性 (例如孔隙率和孔径), 以进行药物加载, 并释放动力学²¹、²⁷。此外, 各种方便的化学路线允许改变 psi 的表面, 并通过进一步调整 si 支架在生理条件下的溶解率和药物 22,²⁴的释放率^{, 29,30}。

本工作的重点是设计一个基于 psis 的交付系统, 用于 ngf 的长控制释放。利用 pc12 细胞和离解 drg 神经元研究了 ngf-psi 载体对神经元分化和生长的影响。我们证明, 加载的 ngf 通过诱导神经元在一个单一的给药1个月的释放期内的生长和深刻分化来保持其生物活性。

所有方法都已得到巴尔伊兰大学道德委员会的批准。

1. 氧化 psi (psio2) 载体的制备

1. 使用钻石尖笔将硅晶片 (在 & lt;100> 面抛光的单面抛光, 在掺杂硼的 p 型、0.95 mω· cm 中, 0.95 mω· cm) 切割成1.5 厘米 x1.5 cm 的样品。
2. 在400°c 的管式炉中, 在环境空气中将 si 样品氧化 2小时 (加热速率: 25°c/min, 自然冷却)。
3. 将硅样品浸入含水氢氟酸 (hf) (48%)、ddh2o_和乙醇 (99.9%) 溶液中(1: 3 v\ v) 5分钟;然后用乙醇冲洗样品三次, 然后在氮气流下干燥。
   注: 只需在塑料制品中准备和储存高频溶液, 因为 hf 溶解玻璃。
   小心: hf 是一种高腐蚀性液体, 应极其小心地处理。在接触的情况下, 用清水彻底冲洗, 并用 hf 解毒剂凝胶治疗受影响的部位;立即就医。
4. 将硅样品安装在聚四氟乙烯蚀刻电池中, 使用铝箔带作为后接触, 铂线圈作为反电极。
5. 在 hf 和乙醇水 (99.9%) 的 3:1 (v/v) 溶液中, 以 250 ma/cm 2 的恒流密度为 30秒, 蚀刻牺牲层; 然后用乙醇冲洗生成的 psi 膜表面三次, 在氮气流下干燥。
6. 将新鲜蚀刻的多孔层溶解在水 naoh 溶液 (0.1 m) 中, 时间为2分钟。然后用乙醇冲洗三次, 在氮气流下干燥。
7. 将样品浸入 hf 水溶液 (48%)、ddh2o_和乙醇溶液中 (99.9%)(1:3 vv) 2分钟然后用乙醇冲洗三次, 在氮气流下干燥。
8. 用化学方法将 si 样品在 hf 和乙醇水 (99.9%) 的 3:1 (v/v) 溶液中蚀刻 20秒, 电流密度为 250 ma/cm 2; 然后用乙醇冲洗生成的 psi 膜表面三次, 在氮气流下干燥。
9. 在环境空气中, 在800°c 的管式炉中对新鲜蚀刻的 psi 样品进行热氧化 1小时 (加热速率: 25°c/min_,自然冷却), 形成多孔 sio2 (psio2) 支架。
10. 在 4, 000 转/分的时间内, 用正厚光刻胶对 psio2 样品进行旋转涂层, 时间为 1分钟;然后在90°c 下烘烤涂层样品 2分钟 (加热速率: 5°cmmin, 自然冷却)。
11. 使用切屑锯将 psio2 样品分解成8毫米 x8 毫米样品.
12. 要取出光刻胶, 将切碎的样品浸泡在丙酮中 3小时;然后用乙醇彻底冲洗, 然后在氮气流下干燥。

2. 使用 ngf 加载 psio₂

1. 制备 ngf 负载溶液时, 将20μg 的小鼠β-ngf 溶解在 100-1 (v/v) 溶液的400μl 中, 该溶液为 0.01 m 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和 ddh2o_.
2. 在 psio2 样品的顶部加入52μl 的加载溶液, 并在带盖的盘子中孵育2小时。
   注: 在盘中保持较高的湿度, 以防止在孵育过程中溶液干燥。
3. 收集样品顶部的解决方案, 以便随后对 psio2 载体中的 ngf 含量进行量化。
   注: ngf 加载到 psio₂应在预定使用之前立即执行, 由于蛋白质的干燥和变性的风险, 该协议不能在此处暂停。

3. 采用 ngf elisa 对 ngf 装载量进行定量

1. 要制备 elisa 板, 请在每口井中加入 100μl 0.5μgl 捕获抗体 (兔抗 hβ-ngf), 然后密封板并在 rt 孵育一夜。
2. 用300μl 的洗涤缓冲液 (pbs 中的 0.05% tween-20) 对井进行液的去除, 并清洗板四次 (pbs 中的0.05%最后清洗后倒置板, 去除纸布上的残留缓冲液和斑点。
3. 在每口井中加入300μl 块缓冲液 (pbs 中的1% 牛血清白蛋白 (bsa)), 并在 rt 孵育至少1小时。然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 所述。
4. 为了准备校准曲线, 将 ngf 加载溶液 (见步骤 2.1) 稀释剂 (pbs 中0.05% 的 tween-20千克, 0.1% bsa) 稀释为 1 ng/ml。然后进行2倍串行稀释从 1 ngml 到零, 以获得校准曲线样本。
5. 要准备样品, 分别在稀释剂1:100000 和1:10000 中稀释 ngf 加载液 (从步骤 2.1) 和收集到的后加载溶液 (从步骤 2.3), 以达到使用中的 elisa 试剂盒的浓度范围 (16-1000 pg/ml)。
6. 将稀释后的样品和校准曲线样品添加 100μl, 每口井一式三份, 在 rt 孵育 2小时;然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 中所述。
7. 在每口井中加入100μl 的1μgml 检测抗体 (生物酰化家兔抗 hβ-ngf), 并在 rt 孵育2小时。然后吸气和清洗板四次, 如步骤3.2 所述。
8. 稀释阿维丁-辣根过氧化物酶 (hrp) 1:2000 在稀释剂中, 每口添加 100μl, 在 rt 孵育30分钟。现在吸气和清洗盘子四次, 如步骤3.2 所述。
9. 在每口井中加入100μl 的基板溶液, 并在 rt 孵育25分钟以进行颜色开发。使用微板读取器测量 405 nm 的吸收率, 波长校正设置为 650 nm。
10. 根据校准曲线确定加载溶液和收集的后加载溶液中的 ngf 浓度。
11. 为了计算 psio2 载体内加载的 ngf 质量, 从加载溶液中的 ngf 质量中减去收集到的后加载溶液中的 ngf 质量。ngf 加载效能由以下公式计算:
    

4. psio2 体外ngf释放

1. 在37°c 和100转/时在轨道搅拌下, 将含有 1% (w/v) bsa 和 0.02% (w/v) 氮化钠的 2 ml ml 中培养 ngf 负载 psio₂载体。
2. 每2天收集解决方案, 并将其替换为2毫升的新鲜 pbs。将采集到的释放样品冷冻在液氮中, 并储存在-20°c, 以便进一步分析。
3. 如步骤 3.1-3.9 所述, 使用市售的 ngf elisa 分析来量化释放样品中的 ngf 含量。
   注: 在准备用于 elisa 定量的释放样品时, 应在释放周期的不同时间点进行不同的稀释 (即,较早的时间点应比以后的时间点稀释得多)。此外, 对于每个释放样本, 至少应进行两种不同的稀释并进行量化, 以确保达到 elisa 试剂盒的浓度范围。
4. 根据标定曲线确定释放样品中的 ngf 浓度, 并绘制一段时间内累积 ngf 释放的图。

5. 电感耦合等离子体原子发射光谱 (icp-aes) 对体外硅腐蚀的量化

1. 在释放缓冲液中稀释1毫升释放样品1毫升 1:10 (0.01 m pbs, 含 1% (w/v) bsa 和 0.02% (w/v) 氮化钠), 总体积为 10 ml。
2. 监测稀释样品的 si 原子排放峰值为212.4、251.6 和288.2 纳米。
3. 根据校准曲线确定样品中的硅浓度。
4. 为了建立硅降解剖面, 在每个时间点表示 si 含量占载体总硅含量的百分比 (即释放期间的累积硅含量)。
   注: 为确保准确定量载体的总硅含量, 在释放研究终点后1个月对释放样品进行采样, 并使用 icp-aes 对硅浓度进行分析。总结释放期的累积硅含量和释放后样品中的硅含量, 提供了100% 的硅含量。

6. ngf 负载 psio₂载体存在下的细胞活力和生长

1. 大鼠嗜铬细胞瘤 (pc12) 细胞培养
   1. 在罗塞尔公园医学院 (rpmi) 中加入10% 的马血清 (hs)、5% 的胎牛血清 (fbs)、1% 的 l-谷氨酰胺、1% 的青霉素链霉素和0.2% 的两性霉素, 制备基本生长培养基。
   2. 在 rpmi 培养基中加入 1% hs、1% l-谷氨酰胺、1% 青霉素链霉素和0.2% 两性霉素制备分化培养基。
   3. 在75厘米2培养瓶中生长细胞悬浮液 (10^{6 细胞}), 基部培养基为10毫升^,为期 8天;每2天在烧瓶中添加10毫升的基本生长介质。
   4. 为了产生分化的 pc12 细胞培养, 将细胞悬浮液转移到离心管;离心机细胞在 200 x g 和rt. 丢弃上清液8分钟。
   5. 将细胞悬浮在5毫升的新鲜基本生长介质中, 并在 200 x g 和 rt处重新离心细胞 5分钟;在基本生长培养基的3毫升中丢弃上清液, 重新悬浮细胞颗粒。
   6. 要分离细胞簇, 使用 23 g 注射器抽吸细胞十次。
   7. 在分化培养基的存在下, 使用血细胞细胞计数器和种子 10 4 cellssexcm 2 在胶原蛋白类型 l 型涂层板上计数细胞.
   8. 24小时后, 在每个板上加入新鲜的小鼠β-ngf (50 ng/ml) 或装有 ngf 的 psio2 载体。
      注: 较高的 ngf 浓度 (& gt;50 ng/ml) 具有与规定浓度相同的确切效果。
   9. 每2天更新一次分化培养基。
   10. 为了评估细胞的活力, 在有代表性的时间点添加 10% (v/v) 的活力指标溶液 (基于雷沙嗪), 并在37°c 下孵育 5小时;用分光光度计测量490纳米的吸收率。
2. 小鼠背根神经节 (drg) 细胞培养
   1. 为了从两只7周大的 c57bl 小鼠身上分离 drg, 首先用70% 的乙醇浇灌小鼠, 并做一个切口切除皮肤。
   2. 切割颅底和腹壁肌肉, 直到脊髓暴露。
   3. 通过在股骨水平上进行切割并清洁周围组织来切除脊柱。
   4. 把柱子切成三块; 把柱子切成三块。然后在中线切割每一块, 生成两个一半, 并剥离出脊髓。
   5. 在双目下, 提取所有 drg 神经节, 并将其浸入冷汉克的平衡盐溶液 (hbss) 中。
   6. 清洁周围的结缔组织, 将 drg 位于培养皿上, 轻轻取出双目下残留的脑膜。
   7. 将 drg 细胞分离, 在 1, 000 u 木瓜蛋白酶中孵育20分钟。
   8. 在 400 x g处离心细胞4分钟。丢弃上清液并保留细胞颗粒。
   9. 将颗粒在 10 mgml 胶原酶和 12mgml dispase-ii 溶液中再移植, 并在37°c 孵育20分钟。
   10. 在 400 x g处离心细胞 2分钟;丢弃上清液并保留细胞颗粒。
   11. 通过收缩的巴斯德移液器反复通过 hbss 1 毫升、10mm 葡萄糖和 5 mm hepes (ph 7.35) 中的细胞颗粒进行示踪。
   12. 在含20% 硅基胶体介质的 l-15 培养基中, 轻轻加入离解细胞, 用密度梯度离心分离细胞;离心机 8分钟, 1, 000 x克。吸收上清液并保留细胞颗粒。
       注: 这一步的目的是分离和纯化神经元细胞从轴突碎片, 雪旺细胞和成纤维细胞。
   13. 在 f-12 培养基2毫升中重新弹性细胞颗粒;离心机 2分钟, 1, 000 x 克;丢弃上清液, 在 f-12 培养基1毫升中重新悬浮颗粒。
   14. 计数细胞和种子 2x10^{4 细胞}在多 l-赖氨酸和层压蛋白涂层玻璃底部35毫米培养, 在 f-12 抗生素耐药介质补充 10% fbs。
       注: 最初, 将细胞播种在少量介质 (150-200μl) 中;在37°c 孵育2小时后, 加入培养基, 最终体积为2毫升。
   15. 每片轻轻加入装有 ngf_的psio2 载体或新鲜小鼠β-ngf (50 ng/ml)。
   16. 2天后, 用4% 的甲醛 (pfa) 溶液孵育细胞培养 15分钟;免疫染色细胞培养使用一个共同的免疫荧光染色程序³¹。
   17. 用共聚焦显微镜成像神经元细胞培养。

7. 细胞分化分析

1. pc12 细胞分化百分比在 ngf_负载psio2 载体的存在
   1. 在培养基2毫升的培养基中, 在含有 5% co2 的37°c 加湿孵化器中培养装有 ngf 的 psio2 载体.
   2. 每隔 2天, 收集溶液, 并更换2毫升新鲜介质。将采集到的释放样品冷冻在液氮中, 并储存在-20°c, 以便进一步分析。
   3. 根据第4.1 节 (4.1.3-4.1.6) 的说明, 12 井胶原蛋白涂层板中的种子 pc12 细胞。
   4. 24小时后, 向不同井段介绍具有代表性的时间点 (从5.1.2 节) 的释放样本;对于控制井, 加入新鲜的小鼠β-ngf (50 ng/ml)。
   5. 24小时后, 用光学显微镜对细胞进行成像。
   6. 为了确定神经细胞的百分比, 手动从图像中的细胞总数中计算出超过神经元的细胞 (n = 每口5帧);绘制了 pc12 细胞与神经元生长的百分比图。
      注: 未分化的 pc12 细胞似乎具有无神经元的圆形结构, 而分化细胞则可以通过神经元的生长 (至少有一个最小长度等于细胞 soma 直径) 或形态变化来识别。
2. 分化 pc12 细胞的形态分析
   1. 对于图像处理分析, 在使用 ngf (作为游离试剂或作为装有 ngf 负载的 psio2 载体的释放产物) 处理后3天内获得培养细胞的相像。
      注: 在以后的时间点 (超过第5天), 细胞发展高度复杂的网络, 防止在单个细胞分辨率的形态测量。
   2. 下载图像处理程序 nuronj, imagej 插件, 它可以实现半自动神经元跟踪和长度测量。
   3. 将图像文件转换为8位格式, 并使用图像刻度条测量像素到微米的比率。
   4. 使用"分析"设置比例设置 "缩放"命令并测量每个神经元的长度。
   5. 手动计算分支点的数量和来自每个细胞 soma 的神经数。
      注: ngf 治疗后的平均神经元长度约为30μm。测量到的神经元长度可以广泛分布。

如协议所述, 制备了氧化 psi 薄膜。硅晶片在 250 ma-cm 2 (图 1ai) 下进行了20秒的电化学蚀刻 , 然后在 800°c (图 1aii) 下进行热氧化, 以产生 psio2 支架.所产生的 psio2 薄膜的高分辨率扫描电子显微镜 (hr-sem) 图像如图 1b, c 所示. 薄膜的顶部显微图 (图 1b) 描述了其高度多孔性, 毛孔直径约为40纳米。裂解膜的横截面微图 (图 1c) 显示多孔层厚度为2.9 微米, 其特征是相互连接的圆柱形孔隙。

psio2薄膜加载 ngf 加载解决方案, 如图 1ii 所示。利用 ngf elisa, 通过测量 psio2 薄膜培养前后加载溶液中的 ngf 浓度, 对 ngf 负载进行量化。每片 psio2 膜加载的 ngf的平均质量被确定为2.8±0.2 微克, 这相当于 90% (w w) 的高加载效率 (数据未显示31)。为了建立 psio2载体的 ngf 释放剖面, 在37°c 的 pbs 中对加载的薄膜进行孵育, 每2天对 aliquots 进行采样, 以便使用 ngf elisa 对释放的蛋白质浓度进行定量。此外, 利用 icp-aes 对释放样品中的硅含量进行了定量, 建立了 psio2载体的硅侵蚀动力学。图 2描述了多孔载体的 ngf 释放和相应的 si 降解剖面。持续释放 ngf, 无爆裂效应, 达到1个月。与释放周期后期的缓慢释放相比, 第一周的 ngf 释放速度更快 (坡度 = 0.442)。需要注意的是, 在整个1个月的释放过程中, 释放的 ngf 量足以诱导 pc12 细胞的深度分化, 稍后将对此进行讨论。累积的 ngf 释放发现与剩余的硅含量有很好的相关性 (r2 = 0.971), 如图 2的内集所示。

其次, 对具有 ngf 负载的 psio2载体的生物活性进行了体外表征, pc12 细胞和 drg 神经元被用作神经元分化和生长的模型。pc12 细胞和离解的 drg 神经元是按照协议中的描述播种的。首先, 在 psio2载体存在的情况下, 通过用整齐 (未加载) 或 ngf 负载的 psio2 培养细胞来检查细胞的活力;用整齐的 psio2处理的控制板和细胞每2天补充一次免费的 ngf。当细胞暴露在整洁或装有 ngf 的 psio2载体上时, 没有观察到细胞毒性 (图 3a), 这表明 psio2与该细胞系具有生物相容性。图 3b显示了用 ngf 负载 psio2载体处理的 pc12 细胞的代表性 hr-sem 显微图像。观察到的细胞提取神经元并形成特征分枝神经元网络。当在 ngf 负载的 psio2 载体的存在下播种离解 drg 神经元细胞时, 也得到了类似的结果。用 ngf 负载的 psio2载体培养的免疫染色 drg 细胞的共聚焦图像 (图 3e) 显示出广泛的神经体启动和伸长, 类似于阳性对照 (即, 神经元补充自由ngf, 见图 3d), 而负控制 (即未经处理的神经元, 见图 3d), 表现出神经元的生长程度很低。

为了评估 pc12 细胞在 psio2载体释放的 ngf 存在下的分化百分比, 通过从整个细胞群中计算神经元外生长的细胞来量化分化。图 4总结了在26天期间不同时间点的分化细胞百分比的结果。在整个研究期间, 显著的微分百分比值是可以达到的。值得注意的是, 26天后, 释放的 ngf 诱导分化超过 50%, 与以前使用聚合物基载体 16的研究相比, 这一分化率显著高于。这些结果表明, ngf 包裹在多孔宿主内保存了蛋白质的生物活性, 诱导深度分化约1个月。

为了进一步研究 ngf-psio2 载体对神经元分化的影响, 在单个细胞水平上测量了分化的 pc12 细胞的三个特征形态参数: (i) 从 soma 中提取的神经石数量 ((ii) 神经元的总长度和 (iii) 分枝点的数量。细胞用装有 ngf 的 psio2载体或重复的免费 ngf (每 2天) 进行处理 (每 2天) 作为对照。图 5a-c给出第1天和第3天细胞群的形态分析。用 ngf 加载的 psio2 处理的 pc12 细胞显示的形态值与所有三个测试参数的控制处理相似.3天后, 所有形态参数的值观察到, 在相同的速度增加, 无论是 ngf 负载 psio2载体和对照处理重复给药的免费 ngf。

图 1: psio2薄膜的制备。(a) psio2载体的制造方案: (一) 硅晶圆在 250 ma/cm2 处进行了20秒的电化学蚀刻, 然后是 (ii) 在800°c 时进行热氧化以产生 psio2支架, 以及 (iii) ngf 加载物理吸附 (原理图不按比例绘制)。(b-c)特征 psio2 薄膜的顶视图和横截面电子显微镜 。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 装有 ngf 的 psio2 载体的 ngf释放和硅侵蚀剖面.将 psio2 载体的降解程度作为多孔膜总硅含量在每个时间点剩余硅含量的分数。该插页显示了累积 ngf 释放量与剩余硅含量之间的相关性。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 在含有 ngf 负载的 psio2载体的情况下, 细胞活力和生长。(a) 体外细胞毒性特征。pc12 细胞的活力是在暴露于整齐 (未加载) psio2载体、ngf加载的psio 2 载体或游离 ngf (每 2天 50 ng/ml, 控制板) 后的1天、3天和7天内测量的。(b)用装有 ngf 的 psio2载体培养的 pc12 细胞的电子显微镜, 为期9天。左面板: 放大, 描绘神经元从细胞 soma 的生长;右面板: 一个缩小, 表示高度复杂的神经元网络形成。(c-e)免疫抑制 drg 神经元细胞培养 (播种后 2天) 的共聚焦显微镜图像: (c) 未经处理的细胞;(d) 补充游离 ngf 的细胞 (50 ng/ml);(e) ngf-psio2型载波。免疫荧光染色的神经纤维 h 可以成像细胞 soma 和生长外长的神经元。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

图4:pc12 细胞在具有代表性的时间点接触 ngf释放的 ngf 时的分化百分比值.分化率表示为神经细胞在整个细胞群中的生长外细胞数量。控制治疗是指补充游离 ngf (50 ng/ml) 的细胞。沿 x 轴描绘不同时间点的细胞的代表性光显微镜图像;刻度条 = 25μm, 用于第2天、第8天、第14天、26天和50μm 的显微图, 用于控制显微图。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 分化的 pc12 细胞的形态分析.在每两天接触 ngf 负载的 psio 2 载体或重复给药免费 ngf后, 在单个细胞水平上测量分化的 pc12 细胞的三个形态参数 (对照);(a) 神经元的总长度 (b) 从细胞 soma 中提取的神经元的数量和 (c) 分枝点的数量。错误条表示 sd, n=3。请点击这里查看此图的较大版本.

提交人声明没有相互竞争的经济利益。