建立了以光谱51介导的 dna 链交换反应为基础的荧光共振能量转移实时观测系统。利用这里提出的协议, 我们能够检测反应中间体的形成及其转化为产物, 同时也分析了反应的酶动力学。
由 rad51 介导的 dna 链交换反应是同源重组的关键步骤。在这一反应中, rad51 在单链 dna (ssdna) 上形成核蛋白长丝, 并捕获非专门用于询问其同源序列的双链 dna (dsdna)。在遇到同源性后, rad51 催化 dna 链交换, 介导 ssdna 与 dsdna 互补链的配对。这种反应在体内受到许多辅助蛋白的高度调节。尽管传统的生化检测已被成功地用于研究这种辅助蛋白在体外的作用, 但对中间形成及其进展到最终产品的动力学分析已被证明具有挑战性, 因为反应中间体的不稳定和瞬态性质。为了直接观察溶液中的这些反应步骤, 建立了基于荧光共振能量转移 (fret) 的该反应实时观测系统。实时观测的动力学分析表明, 由 rad51 介导的 dna 链交换反应遵循三步反应模型, 包括形成三链 dna 中间体、成熟该中间体和 dna 释放。成熟的中间体。spy5-sfr1 复合物是一种保存在真核生物中的辅助蛋白, 它强烈地增强了这种反应的第二和第三步。这里介绍的基于 fret 的检测使我们能够揭示重组辅助蛋白刺激 rad51 dna 链交换活动的分子机制。该协议的主要目标是加强同源重组领域的研究人员可利用的技术, 特别是那些使用来自血吸虫以外物种的蛋白质的研究人员, 以便本文所提出的结果的进化守恒是可以确定的。
同源重组 (hr) 促进了两个不同 dna 分子之间遗传信息的洗牌。hr 对于两种基本的生物现象至关重要: 在配子生成过程中产生遗传多样性1和在有丝分裂过程中修复 dna 双链断裂 (dsb)2 。dsb 是 dna 损伤最严重的形式, 构成染色体的断裂。dsb 的不正确修复会导致广泛的染色体重排和基因组不稳定, 这两者都是癌症的特征3。
dna 链交换反应是 hr 的核心阶段。rad51 蛋白是高度保守的 reca 型重组酶家族的成员, 是在真核生物4,5中催化这种反应的关键蛋白。在这一反应中, rad51 与 dsb 末端的核溶解处理所产生的单链 dna (ssdna) 结合在一起, 形成一个螺旋核蛋白复合体, 称为突触前长丝。这种长丝获取完整的双链 dna (dsdna) 不是专门的, 以寻找一个同源序列。当灯丝发现同源序列时, 形成含有三链 dna 的反应中间体, 而 rad51 丝在该结构中介导链交换 6、7、8。为了有效地完成这种反应, rad51 需要几种辅助蛋白, 如 brca1 和 brca2, 乳腺癌易感基因的产物 9,10.
了解辅助因子如何调节 rad51 是揭示肿瘤发生过程中基因组不稳定原因的一个组成部分。尽管许多研究涉及这些因素对突触前长丝形成和稳定性的影响11、12、13、14、15、16、这些因素对三股中间体的形成及其加工到最终产品中的贡献仍不清楚。通过常规生化实验观察这些反应步骤是非常困难的, 因为三股中间体不稳定, 容易通过常见的实验操作, 如样品的脱蛋白化或电泳。
为了克服这个问题, 我们利用荧光共振能量转移 (fret) 改编了两个先前开发的 dna 链交换反应实时观测系统: dna 链配对和 dna 链位移检测 17, 18 (图 1)。在 dna 链配对试验中, rad51 与荧光素胺类 (fam) 标记的 dna 形成突触前丝, 然后加入同源羧基-x-罗丹明 (rox) 标记 dsdna, 以启动链交换反应。当灯丝捕获 rox 标记的 dsdna 并形成三股中间体时, 两个荧光体接近, 并通过 rox (图 1a) 淬火 fam 的荧光发射。在 dna 链位移分析中, 用 fam 和 rox 双标记 dsdna 培养在未标记的 ssdna 上形成的突触前长丝。当链交换完成, 并且从三链中间体释放 fam 标记 ssdna 时, 由于 fam 不再靠近 rox, fam 的排放量会增加 (图 1b)。这些检测使我们能够实时观察三股中间体的形成及其加工成最终产品的情况, 而不会对反应产生任何干扰。
利用这个实时观测系统, 我们发现由 rad51 介导的 dna 链交换反应分三个步骤进行, 包括第一反应中间体 (c1) 的形成, 将第一中间体转化为第二中间体(c2), 并从 c219 中释放 ssdna。我们还发现, 裂变酵母 (s. pombe) sw5-sfr1, 这是一个进化保守的 rad51 辅助蛋白复合体13, 16,20,21, 22,刺激c1-c2 从 c2 中过渡和释放 ssdna, 其方式依赖于 rad5119 的atp 水解。
这些发现在进化上是否被保存仍然是未知的。该协议希望人力资源领域的研究人员, 特别是那些研究来自s.pombe 以外的生物体的蛋白质的研究人员, 能够应用这些技术来确定 rad51 驱动的分子机制在多大程度上钢绞线交换是保守的。此外, 这些技术已被证明非常成功地确定了 s. pombe swipi-sfr1 的作用。因此, 这是一个合理的预测, 这些技术将是无价的, 以揭示其他 hr 辅助因素的确切作用。
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 利用 fret 测量 rad51 驱动的 dna 链的实时交换。重要的是, 这些测量允许确定反应动力学。虽然上面提供的描述足以重现我们发布的结果, 但有几个关键点将在本节中描述。此外, 还将讨论基于 fret 的 dna 链交换方法的优缺点, 以及这些技术在 dna 代谢研究中的应用。
与所有生化重组一样, 确保所有反应基板的高纯度是必不可少的。仅仅根据 coomassie 染色判断的蛋白质制剂的表观纯度来假设没有污染活动是疏忽。特别是, 微量核酸酶或螺旋酶的存在会极大地影响配对和位移检测的结果。因此, 我们强烈鼓励每次纯化新的蛋白质时都要对此类活动进行检测。此外, 采用原生聚丙烯酰胺凝胶电泳检测合成 dna 底物的纯度也是谨慎的做法。尽管许多公司保证了寡核苷酸的纯度, 但我们经常通过自己的测试发现, 合成 dna 的纯度可能因批次而异。
在使用石英试剂盒进行实验时, 必须考虑以下两点。首先, 有些蛋白质容易在非特异性上结合石英杯。为了解决这个问题, bsa 和聚氧乙烯基单环酯被纳入反应缓冲液中。其次, 温度对反应速度和荧光强度有很大影响。为了最大限度地减少这种影响, 石英立方应在使用前在37°c 预孵育。
尽管传统的生化检测在 dna 链交换的研究中非常有用, 但它们也有几个缺点。在一个典型的时间过程实验中, 反应在一定温度下孵育, 在所需的时间点提取等价物, 并通过洗涤剂和蛋白酶的处理进行脱蛋白化, 以终止反应。时间过程完成后, 对样品进行电泳, 将 dna 底物与产品分离。这里描述的方法的主要优点是, 它允许在没有任何干扰的情况下实时观测反应。反应过程中的任何时间点都可以在不干扰反应本身的情况下进行检查, 也没有必要对样品进行去蛋白质化或使其受到潜在的电泳干扰力的影响。这在监测不稳定的 dna 结构时尤其重要。
尽管与传统检测相比具有这些优势, 但这里描述的方法确实有一些缺点。虽然使用寡核苷酸 dna 基板进行链交换简化了对结果的解释, 但重要的是要记住, 这些底物并不类似于细胞中 hr 中涉及的 dna 基板。一些常规的检测利用等离子体大小的 dna 底物, 这些底物更有可能反映在体内交换的基对的数量。此外, 在常规检测的子集中使用拓扑约束的圆形 dsdna 基板至少可以部分地再现生理 dna 中的紧张关系。
本文所述方法的应用已经开始解开 rad51 驱动的 dna 链交换的分子机制。尽管如此, 仍有许多令人感兴趣的问题有待回答。有明确的证据表明, 减数分裂期间的 hr 需要 rad51 和 dmc1, 减数分裂特异性 reca 型重组酶在真核生物24。然而, 这两种重组酶之间缺乏重大的生化差异, 多年来一直困扰着这一领域的研究人员。此外, 许多不同的重组附属因素群体的作用一直是人力资源领域研究的焦点。除了阐明 rad51 和 dmc1 之间的生化差异外, 我们还打算在不久的将来研究和比较不同重组辅助因子对 dna 链交换动力学的影响。最后, 必须强调的是, 这里描述的基于 fret 的方法并不局限于 dna 链交换的研究。通过相对较小的修改, 我们设想了这一技术在研究 dna 代谢中涉及的功能多样化的蛋白质的多种应用 25,26, 27,28.我们希望这里描述的发展将为属于许多不同学科的研究人员提供进一步的选择。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由科学研究赠款办法 (a) (18H03985) 和创新领域赠款资助 (15H05974) 资助, 青年科学家 (b) (17k15061) 至 ba, 以及科学研究 (b) 至 ht, 来自日本科学促进会 (jsps)。
0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |