在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

摘要

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。

摘要

了解特定细胞类型的突触连接性是理解全脑神经元回路的关键前提。要对长距离连接进行功能研究，需要对单个神经元进行靶向记录，同时特异性地刺激已知的远端输入。使用传统的化学或电刺激技术通常难以实现这一目标，因为来自上游多个脑区的轴突可能在目标区域相互混杂。通过立体定位技术靶向特定脑区，利用病毒介导的方式在该区域表达光敏感离子通道，即可通过光照选择性地激活起源于该区域的轴突。脑内立体定位注射不仅可用于结构界限清晰的脑区（如丘脑前核），也可应用于全脑其他皮层下或皮层区域。

本文介绍了一套在小鼠脑内精确进行立体定位注射表达光敏通道蛋白的病毒载体的技术，随后在脑片标本中对轴突末梢进行光刺激。这些实验方案简单且具有广泛适用性。结合对突触后连接神经元的全细胞膜片钳记录，光刺激轴突可实现对功能性突触连接的检测、药理学表征及其连接强度的评估。此外，还可利用生物胞素对记录的神经元进行填充，以在事后对突触后神经元进行形态学鉴定。

引言

确定脑区之间的连接性对于理解神经回路至关重要。经典的解剖示踪方法可用于建立脑区间连接，而损毁研究有助于理解信息传递的层级结构。例如，空间定向和头方向信号的脑回路涉及信息从丘脑向压后皮层的定向传递。这一结论已通过前背侧丘脑核团（ADN）的损毁研究得到证实：损毁ADN会导致下游的背侧压后皮层中的头方向信号以及旁海马区网格细胞信号减弱^1,2。

在细胞和亚细胞水平上确定脑区之间的功能连接更为困难。在海马中，由于其高度有序的解剖结构，可通过脑片制备中的电刺激来研究特定通路的突触连接。将刺激电极放置在CA1区的辐射层（stratum radiatum）可特异性地刺激来自CA3的Schaffer侧支输入³。将刺激电极放置在CA1区的 lacunosum moleculare 层则可激活投射至CA1的穿通通路输入^4,5。电刺激可引发轴突末梢的神经递质释放；然而，它同时也会激活刺激位点附近的胞体以及途经的轴突。因此，当不同起源脑区的纤维在靶区结构中相互混杂时（如新皮层中通常所见），电刺激在研究特定脑区传入纤维方面具有局限性。

神经元也可以通过光进行刺激。光学方....

方案

所有操作均按照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）进行，并已获得巴黎笛卡尔大学伦理委员会的批准。实验人员必须获得相应许可，以符合当地法规要求。

1. 实验设计

1. 确定需要靶向的脑区。借助小鼠脑图谱¹⁵确定注射位点的立体定位坐标。对于右侧前背侧丘脑核（ADN），其坐标为：相对于前囟，后向 -0.82 mm，外侧 0.75 mm，深度 -3.2 mm。对于不同年龄、性别或品系的动物，坐标可能需要相应调整。
2. 通过在预实验中注射荧光示踪剂（150 至 300 nL），并在落射荧光显微镜下观察，验证并记录坐标准确性（图1A,B）。
3. 确定拟注射的病毒类型。按照生产商建议，将病毒以每份 6 µL 分装后保存于 -80 °C。在当天手术时，取一份置于冰上带入手术室，用于一只至六只动物的注射。腺相关病毒（AAV）的生物安全使用规范可能因国家或机构而异，可能需要在 PSM 2 级生物安全柜中操作。
   注：本实验中使用的是 AAV2/5 血清型病毒，其在突触素（Synapsin）启动子控制下表达 Chronos——一种快速通道视紫红质-2 变体，并与绿色荧光蛋白融合：AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH。

结果

本实验采用顺行性腺相关病毒，通过立体定位注射在丘脑前背核（ADN）中表达一种对蓝光敏感的通道视紫红质（Chronos）与GFP的融合蛋白。立体定位坐标根据小鼠脑图谱确定，并通过注射200 nL荧光示踪剂Fluoro-Ruby进行验证。注射后10分钟处死动物，取出脑组织并固定过夜。制备冠状脑切片以检查注射位点，结果显示注射位置准确且局限于ADN内（图1A,B）。

为了在ADN神经元中表达Chronos-GFP，我们注射了300 nL的AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH。注射后三周，制备急性水平脑切片。图1C显示了包含右侧半球丘脑注射位点的脑切片，其中GFP表达呈绿色。使用配备4倍物镜的落射荧光显微镜观察时，在前下托区域可见GFP标记的丘脑轴突（图1C,D）。值得注意的是，丘脑轴突密集.......

讨论

在活体动物中通过病毒注射在特定脑区表达光敏感视蛋白，是研究长距离功能连接性的常用光遗传学方法^10,11,17,18。立体定位注射可实现对脑内特定区域的精确定位。将视蛋白与荧光报告基因共表达，可方便地评估表达是否成功，并确认注射位点的准确性。使用AAV血清型2/5通常可将表达限制在目标脑区内。通过该方法，可使特定神经元群体被转染，使其胞体和轴突末梢表达光敏感离子通道。在后续的离体脑片实验中，可在其投射靶区直接用光脉冲刺激这些轴突末梢，同时通过膜片钳记录突触后连接神经元的电活动，以检测突触传递是否成功。上述方案稳定且便捷，以下补充说明有助于实验的顺利实施。

可使用不同类型的麻醉方法。本文描述的是腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物，这是一种易于使用、持续时间较短且具有便捷镇痛效果的麻醉方式¹⁹.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 钻头	Harvard Apparatus	724962
10 µL Hamilton 注射器	Hamilton	1701 RN - 7653-01
10X PBS 溶液	Thermofisher Scientific	AM9624	文本
36% PFA	Sigma-Aldrich	F8775
470 nm LED	Cairn Research	P1105/470/LED  DC/59022m	需配合匹配的激发滤光片 470/40x  和 GFP 发射滤光片  使用
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Penn Vector Core	AV-5-PV3446	批次 V6026R，qTiter GC/ml 4.912e12，ddTiter GC/ml 2.456e13
所有化学品	Sigma
浴槽温度控制器	Luigs & Neumann	SM7	设定为 34°C
斜面金属针头	Hamilton	7803-05	33 号规格，13 mm，尖端类型 4-20°
大剪刀	Dahle Allround	50038
生物素	Sigma	B4261	终浓度 1–3 mg/ml
硼硅酸盐毛细管	Harvard Apparatus	GC150-10	外径 1.5 mm，内径 0.86 mm
Brown-Flaming 电极拉制仪	Sutter Instruments	P-87
BupH 磷酸盐缓冲液粉剂	Thermofisher Scientific	28372
灌注用蝶形针	Braun	Venofix A	24G
CCD 相机	Andor	DL-604M
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM710	20X
弯镊	FST	11011-17
CY5 配置（共聚焦）			氦氖 633 nm（5.0 mW）激光器；镜片：MBS 488/561/633
CY5 配置（落射荧光）	Nikon/Chroma		荧光光源（Intensilight）；激发滤光片：BP645/30；二向色镜：89100 BS；发射滤光片：BP705/72
DAPI	Sigma	D9542
DAPI 配置（落射荧光）	Nikon/Chroma		荧光光源（Intensilight）；滤光立方体：Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO（激发：BP 377/50；镜片：BS 409；发射：BP 447/60）
Digidata 1440A	Axon Instruments
数字手持式光度计	ThorLabs	PM100D	设定于 475 nm
双刃不锈钢剃刀刀片	Electron Microscopy Sciences	72000	在切片机中使用刀片的一半
双荧光蛋白手电筒	Nightsea	DFP-1	激发波长 440–460 nm；眼镜上的发射滤光片为 500 nm 长通滤光片
EGTA	Sigma	E4368	终浓度 0.2 mM
落射荧光显微镜	Nikon	Eclipse TE-2000E	10 或 20X
滤纸	Whatman
Fluoro-Ruby 10%	Millipore	AG335	将 10 mg 溶于 100 µL 蒸馏水中；注射 150 至 300 nl
GFP 配置（落射荧光）	Nikon/Chroma		荧光光源（Intensilight）；滤光立方体：Nikon B-2E/C FITC 滤光片组（激发：BP 465–495；镜片：BS 505；发射：BP 515–555）
加热板	Physitemp	HP4M
肝素 Choay 5000 U.I./ml	Sanofi		5 ml 小瓶
HEPES	Sigma	H3375	终浓度 10 mM
高速旋转微型电机套件	Foredom	K.1070	最大钻速 38,000 rpm
细胞内液成分：
隔离式脉冲刺激器	A-M Systems	2100
KCl	Sigma	P4504	终浓度 1.2 mM
氯胺酮 1000	Virbac
凯托芬 10%	Merial		100 mg/ml：将 1 µL 稀释至总体积 1 ml（0.1%）
利多卡因（Lidocaine）	MSD		16.22 mg/ml：将 1 ml 稀释至总体积 4 ml（约 4%）
手术用高功率 LED 聚光灯	Photonic（通过 Phymep）	10044
LED 电源	Cairn Research	OptoLED Light Source
显微操作器	Luigs & Neumann	SM-7
Mg-ATP 2H2O	Sigma	A9187	终浓度 4 mM
MgCl2	Sigma	63069	终浓度 2 mM
微型温度控制器	Physitemp	MTC-1
奶粉	Carnation
MultiClamp 700B	Axon Instruments
磷酸肌酸钠	Sigma	P7936	终浓度 10 mM
Na3-GTP 2H2O	Sigma	G9002	终浓度 0.4 mM
持针器/止血钳	FST	13005-14
pClamp 数据采集软件	Axon Instruments
蠕动泵	Gilson	Minipuls 3	显示屏设置为 14–16，对应流速 2–3 ml/min
葡萄糖酸钾（K-葡萄糖酸盐）	Sigma	G4500	终浓度 135 mM
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermofisher Scientific	P36390
隆朋 2%（赛拉嗪）	Bayer
小剪刀	FST	14060-09
0.9% 氯化钠溶液	Virbac		将 8.5 mL 稀释至总体积 10 ml
VISISCOPE SZT 体视显微镜	VWR	630-1584
带数字显示的立体定位仪	Kopf	Model 940	小型动物立体定位装置
链霉亲和素-Cy3 偶联物	Life technologies	434315
链霉亲和素-Cy5 偶联物	Thermofisher Scientific	S32357
Loctite 超级胶水3	Dutscher	999227	1 g 管装
缝合线 Ethilon II 4-0 聚酰胺	Ethicon	F3210
注射泵	kdScientific	Legato 130 - 788130	使用“推注”和“回吸”模式
组织切片机	Leica	VT1200S	速度 0.07，振幅 1。
管路	Gilson	F117942, F117946	黄/黑，紫/黑
直立显微镜	Olympus	BX51W1
Versi-dry 实验台吸水纸	Nalgene