在Vivo脑内立体注射中，用于小鼠脑切片中远距离输入的光遗传学刺激

定义大脑区域之间的连接是了解神经回路所必需的。经典的解剖追踪方法允许建立区域间连接，病变研究有助于理解信息流的分层组织。例如，空间方向和头部方向信号的大脑电路涉及信息从丘脑到前子的定向流动。这已经通过病变研究证明，在下游背水前，以及副海马网格细胞^信号1，2降低头部方向信号。

大脑区域之间的功能连接在细胞和亚细胞水平上更难建立。在海马区，高度有组织的解剖允许使用切片制备中的电模拟来研究路径特定的突触连接。放置在CA1地层辐射层的刺激电极可用于专门刺激CA3³的舍弗附带输入。置于CA1层乳糖分子的刺激电极将激活对CA1^4，5的穿孔路径输入。电刺激激活来自斧子端子的神经递质释放;然而，它激活神经元与索马塔附近的刺激位点以及通过的斧子。因此，当不同原产区的纤维在目标结构中混合时，研究来自定义大脑区域的亲子关系是有限用途的，就像新皮质中的典型情况一样。

神经元也可能受到光的刺激。光学方法包括笼中谷氨酸的光活化，可与单光或双光子激光扫描相结合。多个紧密间隔的位点可以按顺序刺激，对组织没有机械^损伤6。这已经成功地用于映射突触受体以及激活单个^{神经元7。}虽然谷氨酸未凝固可用于局部电路分析，但它不允许特定激活远程输入。

研究神经元回路中远距离连通性的一种选择方法是使用病毒介导的通道性多普辛表达。使用体内立体注射，如这里所述，光门电通道的表达可以定向，并在空间上限制到所需的大脑区域。通过这种方式，通道性多普辛能够有效地映射从一个区域到其目标的兴奋性或抑制性连接。转染的斧头端子可以在脑切片制备中受到光的刺激，而作为读出的贴片夹记录可以检查大脑中特定电路组件的功能和^强度8。光遗传学方法结合病毒的立体注射提供了前所未有的特异性和基因^控制9。用光刺激另外允许高时空^{精度10，11。}

前体是海马和准海马^{形成12、13}过渡的六层皮质结构。它接收来自ADN¹¹的重要突触输入，但也从其他几个皮质和皮下^区域14接收。因此，在目前切片内选择性刺激的血性偶联体电心端子，在电刺激和谷氨酸未凝固时是不可能的。该协议中所述的方法，使用表达光门通道的病毒载体的精确立体注射来确定大脑区域（ADN 和前子体）之间的功能连接。还描述了在目标区域中投射神经元的斧头终端的光刺激，以及脑切片制备中突触后神经元的全细胞贴片-夹子记录。

所有程序均按照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）执行，并经巴黎笛卡尔大学道德委员会批准。实验者必须获得程序授权，才能遵守当地法规。

1. 实验规划

1. 定义要瞄准的大脑区域。在小鼠大脑图^集15的帮助下，确定注射部位的立体坐标。对于右背状的鼻腔核（ADN），坐标为:-0.82后，0.75横向，-3.2深度（毫米）相对于胸膜。坐标可能需要根据不同年龄、性别或应变的动物进行调整。
2. 在试验实验中用荧光显微镜注射荧光示踪剂（150至300 nL）以确认并记录坐标的精确性（图1A，B）。
3. 定义要注射的病毒类型。根据生产商的建议，将病毒储存在6μL等分在-80°C。将1个放在冰上的等分带到手术室，在一天注射1至6只动物。使用 AAV 的生物安全法规可能取决于国家/地区或机构，并且可能需要使用 PSM 2 发动机罩。
   注:在这里，我们使用AAV2/5血清型表达Chronos，一种快速通道多司平-2变种，在Synapsin促进剂（AAV5）的控制下与绿色荧光蛋白融合。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. 立体手术

1. 在稳定的标准实验室工作台上安装配备泵支架的立体式机架。调整立体镜，以便清楚地看到动物的头部放置区域。使用 LED 光源进行照明。将立体镜旋转开走以进入泵架，这是手术的第一步不需要的。
2. 在泵架上安装一个装有 33 G 下釉金属针的 10 μL 汉密尔顿注射器。用水测试喷射系统。
3. 麻醉4至5周的旧C57BL6小鼠，注射盐酸氯胺酮和木兰辛（分别为100毫克/千克和10毫克/千克）的腹内注射。在8.5 mL的0.9%NaCl中制备1mL的氯胺酮和0.5 mL的木兰素。这将导致10毫克/mL氯胺酮和1毫克/mL木氨酸在混合物中。其中，每克动物体重注入10μL。麻醉的持续时间约为1小时。
4. 验证动物是否用脚趾捏麻醉。然后，拔出舌头，以方便呼吸。去皮毛。
5. 在头部皮肤下注射20 μL的盐酸利多卡因（4毫克/升;2毫克/千克），进行局部麻醉，等待5分钟，以开始效果。为了避免因干燥而造成眼睛损伤，请用局部眼膏覆盖眼睛。
6. 要暴露头骨，用小手术剪刀在头皮上创建一个直切。将动物置于立体框架中，将耳杆稍微插入实际耳朵，以在骨骼上休息，然后拉下皮肤，从而可以很好地进入头骨。拧紧到位。安装鼻件。
7. 使用高度调整的支撑将动物的身体水平保持在头部的水平。在鼠标下方放置加热垫，使其保持在生理温度。
8. 用棉签涂抹0.9%NaCl，从骨骼中取出软组织，清洁头骨。在手术的其余时间使用立体镜。
9. 调整头骨，使胸膜轴水平，向上或向下移动的鼻子和牙齿片。这需要反复测量布雷格玛和兰巴，因为两者都将在鼻子水平调整后发生变化。
10. 找到颅骨上注射部位的位置。根据后和中坐标调整注射部位上方的注射针，用一次性针头标记头骨。将注射针向上移动 4 厘米。
11. 使用带钻头的 0.5 mm 毛刺，以最大速度的一半在标记上实现 1 mm 直径的颅骨切除术。斯瓦布最终出血与纸巾。
12. 将汉密尔顿注射器中所含的水与泵完全喷射，以将其倒入以进行储存。只有针头仍然充满水。每次使用时，用纯去离子水清洗针头。不需要消毒。
13. 以这一天使用的病毒的等分。确保病毒溶液不再冻结，但保持冷却（接近0°C，在冰上）。只需从冰中短暂去除，才能获得 700 nL，并带有小体积的微管。将滴沉积在 5 厘米 x 5 厘米的石蜡薄膜上。避免产生气泡。把剩余的病毒溶液放回冰上。
    注: 滴注量应大于所需的喷射体积（200 nL 喷射的 700 nL）。如果某些液体在转移过程中丢失，这将提供安全裕度，并允许在继续操作之前执行小测试喷射（步骤 2.16）。
14. 将石蜡薄膜放在颅骨切除术的顶部。在不改变前背和横向位置的情况下，将针头滴在病毒溶液的滴中。
15. 使用泵的"撤回"功能，在石蜡薄膜上填充约500 nL的病毒溶液。 在视觉控制（立体镜）下执行此操作，观察下降消失，并确保不吸气。
16. 确保注射器已正确填充。通过向下推下柱塞来测试在目视控制下喷射一小滴 50 nL 的液体，从而验证喷射系统的功能。擦拭掉落。
17. 将针头插入大脑到所选深度，通过转动控制立体设备的旋转轴的旋钮顺时针。按下"运行"按钮（每卷 150 nL 注入的速度为 15 nL/min）。使用自动泵，小体积（50-300 nL，取决于所使用的病毒）在 10 分钟内缓慢弹出。
18. 注射后等待 10 分钟，以避免从注射部位泄漏。然后，逆时针转动控制旋钮，在 3-5 分钟内缓慢取出针头。
19. 用注射器从动物身边旋转立体框架的垂直部分。立即将针头用干净的蒸馏水清洗，多次填空，以避免堵塞。存放装满水的注射器。
20. 从立体帧中取出鼠标。用4-0聚酰胺缝合丝缝合皮肤。制作三或四个刺痛，绑2-1-1标准手术结。
21. 将鼠标放在加热的笼子里，直到它完全从麻醉中醒来，并在放在地面的培养皿中提供水和浸泡的食物。如果热源位于保持架下方，请使用隔栅以避免过热。
    注:根据当地指南，可采用单剂量酮罗芬（2-5毫克/千克，皮下）或丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/千克，皮下）预防疼痛。
22. 当动物完全清醒时，将其送回其家笼并监测其状态，尤其是在注射后的第二天。检查是否有疼痛迹象。如果观察到任何行为改变，动物被称重以监测其体重。
23. 根据所使用的病毒，完整表达的时间可能会有所不同。在这里，我们允许3周的AAV5表达。Syn.Chronos-GFP.

3. 急性切片记录和固定解决方案

1. 制备 10x 浓缩切削溶液（125 mM NaCl、25 mM 蔗糖、2.5 mM KCl、25 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO₄和 2.5 mM D-葡萄糖）和人工脑脊液 （ACSF） 溶液（124 mM NaCl，2.5 mM KCl，26 mM KCl）的库存溶液NaHCO₃， 1 mM NaH 2 PO_4，和 11 mM D-葡萄糖） 在纯去离子水之前进行电生理学实验.将这些溶液储存在4°C的1L瓶中，没有CaCl₂和MgCl_2。
2. 在实验当天，将切削溶液和 ACSF 10x 的库存溶液稀释到每个 0.5 L 的最终体积。用磁搅拌器搅拌，通过冒泡与95%/5%O₂/CO₂进行氧化。添加二价离子，以获得最终浓度为0.1 mM CaCl₂和7 mM MgCl₂的切割溶液，2 mM CaCl₂和 2 mM MgCl₂用于 ACSF。
3. 准备基于葡萄糖酸钾的移液器溶液，以包含:135 mM K-葡萄糖酸， 1.2 mM KCl， 10 mM HEPES， 0.2 mM EGTA， 2 mM MgCl_2，4 mM MgATP， 0.4 mM Tris-GTP， 10 mM Na₂磷酸酯， 和 2.7⁄7.1 mM 生物细胞后细胞形态学启示。将溶液的pH度调整为7.3，将渗透度调整至290 mOsm。在 -20 °C 下存储 1 mL 等分。
4. 在 500 mL 蒸馏水中稀释 BupH PBS 干混合粉袋，制备 0.1 M PBS，产生 0.1M 磷酸钠、0.15 M NaCl、pH 7.2。
5. 要制备 1 L 的 4% PFA 溶液，在蒸馏水中稀释 111 mL 的 36% 液体 PFA 和 90 mL 的 10x PBS 溶液。
6. 在 0.1 M PBS 的 500 mL 中制备含有 150 克蔗糖的 30% 蔗糖溶液。

4. 脑切片的制备

1. 灌注前，用吸水式工作台纸准备工作台空间。
2. 在工作台上方约 1 米处安装一个滴注，以便进行重力灌注。连接一个24 G蝴蝶针。
3. 用冰围住振动器的切割室，并将其存放在冰柜中。
4. 用用于手术的相同氯胺酮-木氨酸混合物注射腹内注射来麻醉小鼠。用钳子捏脚趾，评估麻醉的阶段。完全睡眠时，在腹内注射100 μL的肝素（5000 U.I./mL）。
5. 用胶带将动物固定在吸水纸上，放在动物的背上。用小剪刀从隔膜向上切割左右两侧的肋骨，打开胸腔。借助胶带保持胸腔保持打开状态。
6. 用偏心夹住下主塔，通过心脏左心室注入4°C冷却和氧化（95%/5%O₂/CO_2），通过24 G蝴蝶针切割溶液。5 s 后，用小剪刀打开右中庭。
7. 灌注5分钟后，当器官无血时，停止灌注。用大剪刀将动物斩首，并将头部浸入 4°C 冷却和含氧的切割溶液中， 放入培养皿中。
8. 要提取大脑，将皮肤从颈部切到鼻子，然后用剪刀从头骨上切除最后一根椎骨。手动收回皮肤，并使用小剪刀打开头骨，沿着中线切割，从牛头到玫瑰色，向上到眼睛之间。
9. 用弯曲或骨钳小心地去除前骨的骨骼和骨质部分。在大脑和颅底之间插入仪器，分割嗅球、视神经和其他颅神经和小脑，用小圆铲提取大脑。
10. 轻轻地将大脑浸入烧杯中的冰冷的切割溶液（4 °C）。将大脑放在滤纸上，轻轻干燥皮质表面。将大脑皮层向下粘附在振动体的标本支架上，用牛侧朝向刀片，以切割水平脑切片。
11. 用冰冷的含氧切割溶液填充切割室，使大脑完全浸入。在左半球（与喷射侧相反）上进行切口，以避免切片上出现可能的左右歧义。
    注意:始终对溶液进行氧化，并保护切片免受光照照射。
12. 使用振动器切割 300 μm 厚的切片，在 1 mm 振幅下以 0.07 mm/s 的速度切割。在此阶段，建议使用荧光手电筒（440-460 nm）和相应的滤光片（500 nm 长通）简要检查丘丘层中的Chronos-GFP表达。
13. 用手术刀分离海马区域，并将其转移到装有浴热 （34 °C） 的烧杯中，含氧 （95%/5% O₂/CO₂） ACSF） 的腔室。
14. 15分钟后，将室从加热水浴中拿出来，让切片在室温下休息，直到使用前至少含氧45分钟。

5. 全细胞贴片夹记录

1. 将含有海马复合物的大脑切片与定制的玻璃转移移液器轻轻转移到安装在直立显微镜上的记录室。转移移液器由连接到橡胶移液器灯泡的缩短的巴斯德移液器（内径 6.5 mm）制成。连续注入记录室 （3 mL） 与 34 °C （加热） ACSF 气泡与 95%/5% O₂/CO₂.将蠕动泵的速度设置为 2-3 mL/min。
2. 使用蓝色 LED 照明（470 nm）简要检查感兴趣区域的安克斯终端中的 Chronos-GFP 表达式，并观察 4 倍目标。GFP 荧光通过适当的发射滤镜进行可视化，计算机屏幕上会显示 CCD 摄像机图像。
3. 将由 U 形铂线制成的切片锚与紧密间隔的尼龙串 （"竖琴"） 放在切片上以维护。
4. 更改为 63 倍浸入目标并调整焦点。检查表达Chronos-GFP的斧子，并选择一个金字塔神经元进行贴片记录。
5. 向上移动目标。
6. 使用硼硅酸盐玻璃中的棕色火焰电极拉拔器拉移器。拉拔器设置为产生尖端直径约为 1 μm 的移液器。用基于K-葡萄糖酸的内部溶液填充移液器。
7. 将移液器安装在头台上的移液器支架中。将移液器降低，并找到目标下方的吸头。移液器电阻应在 3~8 MΩ 之间。用注射器施加光正压，以便看到溶液锥流出移液器，并逐渐降低移液器和物镜表面。
8. 在电压夹配置中修补电池:接近已识别的神经元，并巧妙地将移液器尖端压到索马上。正压应在膜表面产生一个酒窝。释放压力以形成千兆欧姆密封件（>1 GΩ 电阻）。密封后，将保持电压设置为 -65 mV。用负压的脉冲打破膜:这是通过对连接到移液器支架的管子施加强吸力来实现的。
9. 在全细胞电流钳模式下记录神经元对超极化和去极化电流步数的反应（图2A）。
   注: 此协议将用于确定单元的主动和被动内部属性。自定义编写的 MATLAB 例程用于线下分析^10、16。
10. 记录对全场 475 nm LED 刺激的电流或电压夹子反应，以表达 Chronos 的发泡纤维。在 20 Hz 时，用 10 次 2 ms 持续时间的 10 次刺激刺激（图 2B，C）。光照强度可能从 0.1–2 mW 不等。
    注:光强度由配备光电二极管传感器的数字手持式光功率控制台测量，该控制台位于目标下方。2⁄4 ms 的响应延迟是单突触连接的特征。
11. 为了研究长距离亲和力和记录神经元之间的突触传播的性质，可以使用不同的药理剂。为了从药理学上区分直接、单突反应和通过网络激活的间接反应，向ACSF添加1μM TTX和100μM 4-AP。
    注:浴液应用谷氨酸受体阻滞剂，可以确定释放的神经递质的性质和午贴受体的身份。例如，AMPA型谷氨酸受体将被NBQX（10μM）和NMDA受体APV（100μM）阻断。根据研究的目的，可以设想协议来研究突触反应或响应动力学随时间的变化而对电压的依赖性。
12. 用原始的ACSF溶液清洗以修补另一个细胞，或将含有生物细胞素的神经元的切片转移到一个装满4%PFA的小小瓶中。
13. 在 4% PFA 中过夜固定后，在 0.1 M PBS 中清洗切片（2 次 5 分钟，1 次 20 分钟）。
14. 储存在4°C的30%蔗糖中。

6. 生物青锡启示

1. 将含有生物细胞填充神经元的固定切片转移到玻璃刀片上，滴30%蔗糖，并执行三个冷冻解冻周期:将刀片放在发泡胶盒中的干冰上1分钟，直到蔗糖滴完全冻结，然后将刀片压在手掌上解冻。
2. 在 0.1 M PBS 中清洗切片 3 倍（2 x 5 分钟，1 倍 1 小时和 50 分钟），轻轻搅拌。最后一次洗涤时不要超过 2 小时。
3. 在含有2%奶粉（0.4克在20 mL）的搅拌缓冲溶液中预孵化片2小时，以饱和非特异性部位和0.5%Triton X100（0.1 mL在20 mL中）以渗透0.1M PBS中的膜。
4. 在含有 2% 奶粉、1% Triton X100、链球菌-Cy5 偶联 （1/500） 和 DAPI （1/1000） 的溶液中，在 0.1 M PBS 中，在 4°C 下孵育过夜，轻轻搅拌。
5. 在 0.1 M PBS 中清洗切片三次（2 次，5 分钟，1 次 2 小时）。最后一次洗涤可以持续更长的时间，长达4小时，以减少背景染色。
6. 安装切片之前，使用 10 倍放大倍率的荧光显微镜，以观察 Cy5 荧光标记，以便识别充满 PBS 的腔室中包含标记细胞的切片的一侧。
7. 将切片转移到刀片上，将细胞侧向上，用纸巾擦干，并使用高电阻安装介质将其安装。
8. 在 Cy5 和 DAPI 配置中，使用 10 倍放大倍率的荧光显微镜来检查细胞体的位置，在 GFP 配置中观察标记的关联，或以 20 倍的高分辨率共聚焦显微镜进行详细的体体、斧心和树突形态学 （图 2D， E. .过滤器设置在材料表中详细说明。

这里介绍的程序用于表达一种蓝色光敏通道，通过立体注射异位腺相关病毒，在丘拉他（ADN）的前背核中融合到GFP。立体坐标根据小鼠大脑图图确定，并通过注射200 nL荧光示踪荧光荧光荧光荧光红宝石进行测试。注射后10分钟，动物被牺牲，大脑被提取并固定过夜。冠状脑部分准备检查注射部位，该位置被正确放置在ADN中，并限制在ADN（图1A，B）。

为了在ADN神经元中表达Chronos-GFP，我们注射了300 nL的AAV5。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. 注射三周后，准备了急性水平脑切片。图 1C显示一个包含右半球缺血注射位点的大脑切片，GFP 表达式为绿色。在使用配备4x物镜的表观显微镜进行检查时，在子位前观察到了标有Thalmic axon的GFP标记（图1C，D）。有人指出，thalamic axon密集地将前子的表层I和III密集地内层（图1D）。

在全细胞贴片夹配置中记录了第三层前子神经元的活性。在记录膜电位变化时应用了超极化和去极化电流步骤（图2A）。数据存储在计算机上，以便以后离线分析有源和被动膜属性。前潜层III主细胞通常具有接近-63 mV的负静息电位，需要去极化电流注入，以驱动膜电位达到发射阈值。其内在属性的完整描述已发表11。

刺激表达Chronos-GFP的ADN斧头端子，在当前钳位模式下，在先期第三主细胞中激发出突触后电位（EPSPs）（图2B）。根据光强，EPSP 可能达到行动电位阈值。在电压夹击模式下也观察到柱状反应，因为引出兴奋的突触后电流（EPSC）（图2C）。光刺激引起的EPSC的发病延迟是短的（中位数，1.4 ms10），表明Thalamic辅助子和三层前子神经元之间的直接突触接触。在 TTX-4AP 条件下的持久化 EPSC 证实了这种单突触激活。值得注意的是，这些细胞对具有常规发射模式的一个发泡斧子的光刺激有可靠的反应。

图 1:在厌食性大核（ADN）中立体注射。（A）注射的原理表示。（B）在日冕部分用氟红宝石注射部位确认。内注表示食原位和与布雷格马的距离。（C） 在丘丘层注射AAV-Chronos-GFP后的水平切片。应注意对副副方的斧形投影。切片左侧的切口（以黑色三角形表示）标记了相反的半球。（B， C）缩放杆 1 mm. （D）放大的插入（C）与 ADN 投影到目前表面层。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:前潜层III神经元:内在特性，对光刺激的脂肪，和细胞形态的事后揭示。（A）第三层神经元的激发模式和膜电位变化，用于超极化和去极化电流步长。（B、 C）第三层神经元对2 ms光刺激（蓝色棒）的响应记录在 （B） 电流钳和 （C） 电压钳模式中。（D， E）第三层金字塔神经元（白色，由填充的黄色三角形表示）被用表观光显微镜成像的水平切片中，在表观表面层中表达Chronos-GFP（绿色）的Thalmic轴子表示Chronos-GFP（绿色）D，刻度杆 = 100 μm）和共聚焦显微镜，放大率高（E，刻度杆 = 50 μm）。（A）中的单元格用填充的黄色三角形表示。第二个部分填充的神经元存在于这个切片中，用空的黄色三角形表示。请点击此处查看此图的较大版本。

作者声明没有相互竞争的经济利益。