建立猪外维沃角膜模型研究药物治疗细菌性角膜炎

角膜感染是致盲的重要原因，在低收入和中等收入国家流行。这种疾病的病因因地区而异，但细菌占这些病例的绝大多数。伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨是导致一种快速进步的疾病的重要病原体。在许多情况下，患者留下频闪疤痕，不规则的散光，需要移植或在最坏的情况下，失去一只眼睛^1，2。

由 P.aeruginosa 引起的细菌性角膜炎是一种难以治疗的眼睛感染，特别是由于抗微生物药物耐药菌 株的日益出现。在过去十年中，很明显，测试和开发新的治疗角膜感染的方法，一般来说，特别是那些由 伪多莫纳斯 sp.引起的，对于对抗抗生素耐药性³的当前趋势至关重要。

为了测试角膜感染新疗法的疗效，传统的体外微生物方法是一种糟糕的替代方法，因为在实验室培养期间和在体内感染期间细菌生理学的差异，以及由于缺乏宿主接口^4，5。然而，体内动物模型昂贵、耗时，只能提供少量的复制品，并引起人们对动物福利的担忧。

在本文中，我们展示了一个简单和可重复的角膜炎体外猪模型，可用于测试急性和慢性感染的各种治疗方法。我们已经使用 P.aeruginosa 进行这个实验，但模型也与其他细菌，以及生物体，如真菌和酵母，导致角膜炎运作良好。

白化病实验室的兔子被牺牲在实验室里，根据内政部批准的协议进行其他计划中的实验工作。这些研究不需要眼睛进行实验性使用，因此它们用于此协议。

1. 绝育

1. 关键步骤:在蒸馏水中浸泡 1 小时（v/v/v） Distel 溶液，用刷子清洁，用自来水冲洗，并在 185 °C 的烤箱中消毒，至少 2 小时，对所有钳子和剪刀进行消毒。
2. 通过在 121 °C 下自动拍击 15 分钟或根据制造商的指示准备试剂，对所有其他玻璃器皿和试剂进行消毒。在 II 类微生物安全柜中执行以下程序。

2. 样本收集

1. 猪眼的集合
   1. 大型白色陆地赛母猪，一个十字架与汉普郡野猪被使用。动物们被电流惊呆了，眼睛在2小时后在屠宰场被细胞核化了。
   2. 关键步骤:一旦电子核化，将眼睛转移到实验室在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液，以防止他们干涸，并在抵达后立即处理他们。
2. 兔子眼的集合
   1. 将角膜消费税化，然后用无菌PBS送到实验室。

3. 角膜硬膜按钮的准备

1. 使用无菌钳子握住眼球周围的组织，并将其转移到培养皿中。使用 15 号手术刀刀片和钳子取出培养皿上的眼球周围的结膜和肌肉组织。
2. 轻轻抬起眼球，同时用钳子握住视神经，转移到一个装满无菌PBS的0.5L罐子里。
3. 一旦所有的眼睛都清除了周围的组织，用无菌钳子将它们转移到另一个0.5升罐中，里面装满了PBS中3%（v/v）的多维酮碘，然后离开1分钟。
4. 将眼球转移到另一个带有无菌 PBS 的 0.5 L 罐子上。
5. 使用钳子将眼睛静止在培养皿上，并用没有 10A 的手术刀刀片在角膜附近切开。
6. 关键步骤:抓住切口的边缘，用剪刀切除角膜，在角膜周围留下大约3毫米的硬膜。确保剪刀的锐端不会刺穿虹膜或胆囊组织，并处于超胆囊空间。
7. 用钳子按住角膜硬化按钮，然后使用另一对尖端钳子轻轻地分离子宫组织。
8. 将角膜硬化按钮从剩余的球体中提起，并在 12 个井板中的 PBS 中短暂冲洗 1.5% （v/v） povidone 碘溶液。
9. 将角膜硬盘按钮放入另一个充满无菌 PBS 的 12 个井板中。
10. 处理完所有眼睛（建议一批最多40只眼睛），将每个角膜硬化按钮放在单个培养皿（直径34毫米）上部，倒入3mL的培养介质预热至37°C。
    注:培养介质的组成如下:杜尔贝科的改良鹰的介质（DMEM）:哈姆的[1:1]辅以5微克^∙mL-1胰岛素和10∙mL-1表皮生长因子（EGF），1 10% （v/v） 胎儿小腿血清 （FCS）， 100 U∙mL^-1青霉素， 100 U∙mL^{- 1}链霉素和 2.5 μg∙mL^{- 1}安非他明 B.作为可选步骤，可补充50克^∙L-1德克斯特兰，以防止在进一步的孵化步骤中切除角膜肿胀。
11. 在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。

4. 角膜硬性按钮的维护

1. 24小时后，使用无菌技术去除介质，代之以含有抗生素的3mL新鲜预热培养物。用抗生素将角膜硬性按钮放在介质中48小时，对角膜进行消毒。在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。
2. 关键步骤: 48 小时后， 取出介质， 用 2 ml 的 Pbs 冲洗角膜。然后在无抗生素介质中将角膜硬化按钮保存至少两天或理想情况下，在实验感染前三天，从组织中取出残留的抗生素。
3. 在加湿组织培养孵化器中以37°C孵化。在这三天内至少再更换一次媒体。如果无抗生素介质中出现任何浊度，请丢弃角膜。

5. 准备接种

1. 用泡沫塞将 10 毫升 LB 汤倒入 50 毫升圆锥形烧瓶中。
2. 将一群 P.阿鲁吉诺萨 菌株PAO1或菌株PA14从新鲜的醋板中转移，在37°C下孵育3-4小时，直到细菌处于中日志阶段。
3. 将细菌培养转移到 50 mL 管和离心机中，3，000 x g，5 分钟。取出超常剂并重新悬浮 PBS 中的细胞颗粒。
4. 重复步骤 5.3 两次来清洗细胞。重新悬挂PBS中的细胞颗粒，并将光学密度调整为600nm至0.6左右，使用无菌PBS作为空白。

6. 感染角膜硬膜按钮

1. 从培养皿中取出介质，用 1 mL 无菌 PBS 冲洗角膜两次。
2. 轻轻挤压钳子，同时夹住中间的角膜。使用 10A 手术刀在角膜硬化按钮的中心部分（通过上皮层到底层频闪）进行四次切割（两次垂直，两次水平）。
3. 将无菌玻璃模具放在一个6井板中，宽部分向上，并将角膜放在玻璃模具中间，上皮侧朝下。在玻璃模具底部的中心进行切割。
4. 关键步骤: 倒 1 毫升 1% （w/v） 低熔点琼脂溶解在 DMEM 中， 以完全填充玻璃模具角膜。
5. 让琼脂设置，然后倒置玻璃模具，使角膜上皮朝上。
6. 带 OD_600nm = 0.6 的细菌培养物的移液器 15 μL（对于 P. aeruginosa 来说，这相当于大约 1 x 10⁷ 菌落形成单位 （CFU） 在 15 μL 中直接进入切割区域，然后将 85 μL 的 PBS 添加到顶部以保持角膜上皮湿润。稀释阿加上剩余的细菌培养和板，以计数菌落形成单位的培养。
7. 加入1毫升的DMEM没有抗生素到每个井的底部与玻璃模具。在 37 °C 的加湿孵化器中用受感染的角膜硬化按钮孵化 6 井板，5% CO₂ 可长达 24 小时。
8. 在每个实验旁边设置未受感染的对照角膜。要建立未受感染的控制，在步骤 6.6 中用无菌 PBS 替换 15 μL 的细菌培养。

7. 角膜的同质化以收获细菌

1. 从 6 井板底部丢弃 DMEM 介质，并添加 1 mL 的无菌 PBS 冲洗井底。
2. 通过管道轻轻取出 PBS，而无需触摸角膜硬性按钮的中心部分。使用无菌钳子取出玻璃环，并将其放置在 5% Distel 中。
3. 用 1 mL 的 PBS 轻轻冲洗角膜硬化按钮的顶部两次 [可选] 。
4. 用细尖钳按住角膜硬化按钮的边缘，并将其从下面的琼脂中分离。
5. 将角膜转移到一个50 mL管充满了冰冷1-2 mL的PBS。
6. 使用精细的尖端同质化剂来纯粹的受感染角膜的顶部。组织不必完全液化。同质化剂有助于将细菌从角膜上皮和切口区域分离。
7. 在PBS中将角膜漩涡几秒钟以混合内容。
8. 将 20μL 的同质物添加到 180μL 的 PBS 中，并在 96 井板中执行串行稀释。
9. 连续稀释悬架至^10-4 和^10-5 稀释和移液器10μL的稀释同质细菌到血糖板。孵化板8小时，并计算CFU的数量。在测试抗菌素的效果时，必须通过实验得出适当的稀释因子。

玻璃模具的设计是一个创新和原创的想法，其使用使我们能够建立模型在一致的方式与最小的/没有污染的问题。这些模具是由谢菲尔德大学的玻璃鼓风机根据设计（图1A）制备的。实验设置保持角膜的凸形，并将细菌保存在发生感染的上皮上部（图1B）上。

猪角膜通常在中等的几天后膨胀。这是正常的，我们发现角膜之间没有显著的区别，没有添加德克斯特兰，这通常是为防止角膜肿胀（图1H）而添加的。角膜通常受伤，以帮助细菌穿透上皮。虽然受伤（切口）和未切割（未切割）角膜之间的感染进展没有显著差异，但我们注意到未切割角膜（图1C）的复制品之间存在更多差异。用PBS洗两次角膜可以去除不附着在上皮上的多余的细菌。24小时（图1D）中感染P.阿鲁吉诺萨PAO1的洗过和未洗过的猪角膜在CFU方面有显著差异。感染 PA14 和 PAO1 的猪角膜和兔角膜的 CFU 计数没有显著差异（图 1E，1F）。两种型号的结果都是可重复的。24小时后，感染假角膜菌株的角膜总是发育不透明，与未受感染的角膜（图1G）相比，切口区域变得更加明显和开放。

图1:感染 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨的外体角膜。（A） 用于维持角膜形状和促进细菌引入和治疗的玻璃模具的示意图图片。玻璃模具的厚度为 1.5 mm，与用牛酸盐玻璃制成的试管的厚度相同。（B） 实验设置的示意图。（C） 测试同质化后伤人对最终CFU计数的影响。未切割 （n = 16） 和切口 （n = 28） 角膜感染了 P. 阿鲁吉诺萨 PAO1 和 P. 阿鲁吉诺萨 PA14 24 小时。角膜在均质化前用 1 mL 的 PBS 洗净。错误条表示标准偏差。（D） 测试用2×1 mL的PBS（n = 6）清洗角膜的效果，并在感染 P.aeruginosa PAO1后24小时内不清洗（n =6）。错误条表示标准偏差。（E） 感染 P. 阿鲁吉诺萨 PAO1 和 P. 阿鲁吉诺萨 PA14 的猪角膜的最终 CFU 计数为 24 小时 （n = 10）。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。（F） 感染 P.阿鲁吉诺萨 PAO1和 P.阿鲁吉诺萨 PA14的兔子角膜的最终CFU计数为24小时（n =6）。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。（G） 感染 P.阿鲁吉诺萨 PAO1的外活猪角膜图片24小时。控制受伤，但没有添加细菌。受感染的角膜受伤，切口侧增加了10 7 个CFU。没有从对照角膜中恢复CFU。（H） 最终 CFU 在感染 P. aeruginosa PAO1 24 小时后从用德克斯特兰 （n = 2） 治疗的角膜和那些没有德克斯特兰 （n = 9） 的角膜中恢复。角膜被洗净和切开。错误条表示标准偏差。 请点击这里查看此数字的较大版本。

作者没有什么可透露的。