活生物库的创建和维护 - 我们如何做到这一点

近年来，对癌症的形态学、临床学和遗传特性积累的知识导致癌症被概念为一种异质的个体疾病。因此，除了临床和病理特征外，肿瘤的突变特征对临床决策也越来越重要，并为各种分子改变开发了许多靶向疗法。例如，通过对KRAS和PIK3CA突变状态¹的分析，可以预测腹腔瘤在结肠直肠癌治疗中的疗效。精密医学旨在量身定做的方法，为每位患者提供最高的治疗反应，避免无能疗法的毒性^。生物库含有癌症患者的组织、血液和其他生物材料，这些物质与临床数据相关联，因此是转化癌症研究的绝佳工具。由于大量的临床样本，生物库能够检测罕见但可能具有药物性的突变，这为个别患者提供了新的治疗机会^。

为了尽可能广泛地涵盖肿瘤研究范围，我们并没有单独限制采集样本的活动，而是专注于建立患者衍生的癌细胞系和异种移植物（PDX）。传统的2D细胞系仍然是体外研究的角石，是大规模药物筛选^4、5的主要选择。此外，细胞线分析往往更容易，更便宜，更容易获得。此外，由于患者衍生的外周血淋巴细胞（PBL）是可用的，肿瘤免疫学也可以研究体外^6。然而，大多数新开发的药物在基于细胞体外或体内实验的细胞中具有有希望的临床前效应，在临床试验⁷中都显示出令人失望的结果。相比之下，基于PDX的临床前研究在体内研究中更忠实地反映了反塑性剂的临床活性^。由于PDX组织密切反映供体肿瘤的组织学和分子特性，PDX模型是传播通常非常有限的存活肿瘤组织以保持生物库的完整性和允许研究组和机构之间交换样本的好方法。此外，从PDX组织中提取的癌细胞系比原发性癌细胞系⁹更容易建立。近年来，我们的工作组通过逐步标准化和优化所有有关生物样本的工作流程，建立了全面的结肠直肠癌和胰腺癌综合生物库（图1）。

图1:生物库的工作流程和组织 请点击这里查看此图的较大版本。

以下研究已获罗斯托克大学医学中心机构审查委员会批准（II HV 43/2004，A 45/2007，A 2018-0054，A 2019-0187和A 2019-0222）。此外，所有兽医相关程序都已得到兰德萨姆特·费尔特沙尔察夫特、莱本斯密特尔西切莱特和菲舍雷·梅克伦堡-沃尔波默恩的核准，注册号为LALLF M-V/TSD/7221.3-2-020/17和7221.3-1-007/19。

1. 实验先决条件

1. 满足建立和维护生物库的若干重要框架条件。
   1. 使用具有外科部门和足够数量的肿瘤切除术的诊所，以及设备齐全的实验室和充足的学术人员。良好的基础设施和与合作病理部门的牢固联系是进一步的先决条件。
   2. 在体内研究中，使用适合免疫性小鼠的住房条件的动物设施。
   3. 获得医疗保健道德委员会对患者源性材料的任何研究的授权。根据当地法规，获得主管机关的 现场研究批准 。

2. 样本收集

1. 手术前一天
   1. 评估所有可伸缩结直肠或胰腺癌患者和/或相应的转移生物库资格。避免包括与新判断预处理的病例，非常小的肿瘤，不确定的尊严或病变的肿瘤，已经部分重新解剖内窥镜之前。
   2. 在有关外科手术的知情同意讨论中，获得患者参与的书面批准。及时通知所有参与的外科医生、实验室团队以及病理学家。
2. 样本采集
   1. 在手术开始前立即通知手术室 （OR） 中的所有服务员有关生物库的组织收集情况。
      注:组织不得固定在正式素中，这一点至关重要。如果组织被浸入甲醛中，它就不适合综合生物库。
   2. 在麻醉诱导后立即抽取40 mL的肝化血（2 x 20 mL注射器）以及标准的7.5 mL血清管，并迅速转移到实验室进行PBL隔离和血清处理（见步骤3-4）。
   3. 直接从操作台获取重新切除的标本，将其放入适当的容器中，并将其带到病理部门。写下脱离循环、切除和到达病理学的时间点。
      注:生物库标本的适用性应由解剖肿瘤和非恶性组织的合作病理学家进行评估。不要自行去除标本的任何部分，这可能会损害随后的病理报告。
   4. 将两个组织件放在单独的 15 到 50 mL 聚丙烯管中，在冰上放置 10 到 30 mL 组织存储液（或 DPBS）。写下接收时间，并立即将标本转移到实验室。
      注:以下协议步骤 3-6 必须在严格的无菌条件下在层流柜中执行。在室温下使用所有液体。

3. 血清处理

1. 在预冷离心机中将 7.5 mL 血清管在 1128 x g 和 4 °C 下离心 15 分钟。
2. 在预先标记的低温管中，每管1 mL血清，并冻结在液氮中。

4. 按密度梯度离心隔离PBL

注:与两个 20 mL 注射器中的每一个平行工作。

1. 将 20 mL 的肝化血液填充到 50 mL 聚丙烯管中，并添加 15 mL 的 DPBS。
2. 用血清学移液器取15 mL的Pancoll，小心地将移液器插入聚丙烯管的底部，然后非常缓慢地释放潘科尔，在血液/DBPS柱下形成一层。
3. 离心机在375 x g 15分钟 没有 刹车。
4. 将两个样品的中柱和顶柱之间的不透明相间层吸气并转移到新鲜的 50 mL 聚丙烯管中，并填充 DPBS 至 50 mL。
5. 离心机在270 x g 15分钟 与 刹车。
6. 吸气和丢弃超纳坦，在4.5 mL的冷冻介质中重新悬浮细胞颗粒。
7. 每低温管的悬架为 1.5 mL，将管子紧紧关闭，并将其放置在适合缓慢冷冻的冷冻容器中，并储存在 -80 °C。

5. 组织处理

注:从生成肿瘤和健康组织的快速冷冻样本开始，以保持核酸的完整性。

1. 肿瘤组织标本
   1. 将肿瘤标本与几个 mL 的组织存储溶液从聚丙烯管转移到培养皿。如有必要，用 DPBS 冲洗。避免触摸标本，使用两个无菌手术刀处理组织。随时避免干燥。
   2. 在单独的盘中以方便的尺度称量肿瘤标本，并注意组织重量。
   3. 切割前评估肿瘤组织的大小、形状和组织质量。旨在获得至少一块约针头大小的捕捉冻结和四个立方体约30毫米^3（ 边缘长度3 x 3x 3毫米），每个至关重要的低温保存。以四倍的速度生成尽可能多的 30 mm³ -立方体，并生成一块，每 5 个立方体进行捕捉冻结。还要考虑到坏死部分必须被切断，以便立方体只由重要组织组成。
   4. 生成 3 毫米厚度的切片。切断坏死部分，可区分为凝胶状或液体质量，并将切片切成两个所需尺寸的立方体。
      注意:此时 不要丢弃任何组织。
   5. 捕捉冻结
      1. 相应地标记低温管（见步骤 7.7）。
      2. 将一块小纸巾放在每个预先标记的低温管上。立即将样品浸入液氮中几分钟，然后储存在-80°C。
   6. 重要组织的冷冻保存
      1. 相应地标记低温管（见步骤 7.7），并填充每个 1.5 mL 的冰柜介质。把冷冻容器放在长凳旁边。
         注意:请尽快遵循下一步。由于冷冻介质中的DMSO具有细胞毒性特性，在没有适当冷却的情况下，组织被浸入冰柜介质的时间不应超过2分钟。
      2. 将 30 mm³ 立方体排列为四倍。将坏死组织和其他残留物推到盘子的边缘，但不要丢弃它们。
      3. 用手术刀刀片铲立方体，每个低温管传输 4 个立方体。确保肿瘤块完全淹没在冰柜介质中。将管子紧紧地关闭，放在适合慢速冷冻的冷冻容器中，并存放在-80°C的冰柜中。
      4. 将低温管转移到适合的存储系统中，在-140°C或更低时进行长期存储。实验室库存管理系统中的文档是强制性的。
2. 健康组织标本:重复步骤 5.1.1。健康组织标本为5.1.6.4。

6. 原始细胞培养

1. 将培养皿中的肿瘤组织（包括坏死残片）的残留物分解为尽可能小的手术刀。
2. 将无菌细胞过滤器（100μm 孔径）放在 50 mL 聚丙烯管上。
3. 使用血清学移液器将 5-10 mL 的 DPBS 添加到培养皿中，将组织残留物和移液器上下浮动以产生悬架。
4. 将带移液器的悬架转移到细胞过滤器中。
5. 重复步骤 6.3-6.4，直到从培养皿中解决所有组织残留问题。
6. 使用 20 mL 单向注射器的柱塞通过细胞过滤器挤压细胞和组织悬架。
7. 用 5-10 mL 的新鲜 DPBS 冲洗，丢弃细胞过滤器并正确关闭管子。
8. 将悬架在 180 x g 下停机 5-10 分钟。
9. 准备一个胶原蛋白-I预涂6井板与1.5 mL的中等每口井。
10. 吸气并丢弃超生剂。将颗粒重新悬浮在 3 mL 的 DPBS 或介质中，并在每个油井中添加 500μL 的悬架。将板放入孵化器（100% 湿度、5% CO2、37 °C）
11. 每天监测板的细胞生长和污染。
    注:此处没有描述到建立永久细胞系的进一步细胞培养。

7. PDX 生成

1. 只有符合您管辖权主管机关要求的适当合格人员进行 in 活体 实验。
2. 在特定无病原体 （SPF） 条件下，家庭免疫机能小鼠满足使用的小鼠菌株的需求。卫生措施包括单独通风的笼子、自动包装食品、水和筑巢材料以及安全气闸和佩戴个人防护设备。
3. 事先自动切开所有仪器，每个肿瘤病例只使用一套仪器，以避免交叉污染。尽可能处理肿瘤组织。下面命名的所有塑料物品应无菌、一次性，并在每次手术后丢弃。
   注:PDX生成的方法由每个冷冻管冻结四个肿瘤组织块的方法确定，每个样本需要两只小鼠，理想情况下可产生四个PDX肿瘤。
4. 通过实验室库存管理系统选择所需的主肿瘤进行雕刻，并将样品（保存完好的肿瘤组织）从主储罐转移到便携式液氮容器（干冰上-80°C的中间储存也很方便）。
5. 在进入SPF区（磨砂、木块、围裙、护发罩、外科口罩和过鞋）之前，先穿上个人防护装备，对双手和所有设备进行消毒。
6. 马特里格尔浸泡
   1. 取出液氮容器中的低温管，等待标本解冻。
   2. 标记 50 mL 聚丙烯管，并填充 35 mL 的 DPBS。
   3. 向上和向下倾斜低温管，并在组织中浆转移后立即将内容转移到聚丙烯管中。轻轻冲洗肿瘤组织块，将主体积从管子中丢弃在单独的容器中，合上盖子，将管子向上向下，使四个组织块聚集在盖子中。
   4. 将培养皿放在冷却蓄能器上，将 100μL 的 Matrigel 作为单个液滴放入中间。使用解剖钳子将肿瘤碎片转移到母体。确保每一块都完全覆盖着马特里格尔。在4°C下孵育10分钟。
7. 小鼠麻醉（每个样本2只小鼠，并行工作）
   1. 准备3:1 - 氯胺酮（100毫克/mL）和西拉津（20毫克/mL）麻醉剂。建议剂量为 90/6 毫克/千克体重。
   2. 称重鼠标，将必要的麻醉液绘制成一次性胰岛素注射器。
   3. 将鼠标放在笼子的网格上，用一只手轻轻地拉着它的尾巴，以诱导向前移动，同时用另一只手的紧握夹住颈部。抬起网格的鼠标，转动握手，使动物的背部放在手掌上。用你的小指固定后腿之一， 并注射麻醉剂内腹。把老鼠放回笼子里，等待麻醉剂的上岗。
   4. 将麻醉鼠标放在加热板上，用软膏遮住眼睛，以避免角膜损伤。用手术钳子轻轻捏捏老鼠的后脚，以评估麻醉的深度。
      注:缺乏运动表示深度嗜睡。任何类型的运动要么需要更多的时间来达到所需的麻醉深度或额外的麻醉剂剂量。
8. 手术
   1. 通过捏住鼠标的脖子形成皮肤褶皱，然后用施用器皮下注入微芯片（有关编程详细信息，请参阅步骤 9）
   2. 如有必要，剃光鼠的侧翼（NMRI^nu/nu 小鼠不需要剃须），用棉签涂抹波维酮碘，并使用手术窗帘创建无菌场。
   3. 用手术钳抬起侧翼的皮肤，用剪刀做一个约4毫米的小切口，用剪刀做钝制，形成一个小皮下口袋。
   4. 将一块肿瘤片放入每个口袋，放在后端。
   5. 夹住 100 μL 移液器尖端，从培养皿中吸出剩余的 Matrigel，并将其均等地涂入每个皮肤口袋。
   6. 用简单的中断缝合线关闭伤口，并涂上喷雾敷料。
9. 扫描微芯片并检查小鼠和肿瘤 ID 的有效性。
10. 准备一个新的笼子与新鲜的床上用品和筑巢材料，以及啃棒。用纸巾折叠一个"垫子"，用高架头将鼠标放在红外热灯下。
11. 将 0.25 mL 的三叶醇/硫化物氧化物（400 毫克/80 毫克）与 100 mL 的饮用水混合，并通过饮用水瓶进行管理。考虑一只小鼠每天消耗大约 150 mL 的体重。
    注:由于皮下PDX模型与术后疼痛无关，无论是在伤口愈合过程中，还是在肿瘤生长过程中，都不需要术后镇痛。请注意，您机构/当局的动物福利准则可能有所不同。
12. 实验动物监测
    1. 每天监测老鼠的苦恼迹象。这可以委托给合格的动物饲养员。
    2. 继续使用上述剂量进行术后抗生素治疗4周。每周更换两次抗生素混合物。
    3. 每周至少测量一次肿瘤大小，理想情况下每天用卡钳（肿瘤体积 = 0.52 x 长度 x 宽度 x 高度 [mm^3]）测量肿瘤大小，并在数据库中记录。

8. PDX 收获和加工

1. 收获和处理PDX肿瘤，时间:
   肿瘤大小达到1.500毫米³的目标体积。
   带有疼痛和/或疾病和治疗的肿瘤携带动物的迹象是徒劳的。
   肿瘤变渗透或穿透小鼠的皮肤。
2. 读取微芯片以识别正确的 PDX。
3. 通过法律方法（取决于国家指南）对小鼠实施安乐死，例如 CO₂- 窒息或氯胺酮/西拉津注射，然后是宫颈脱位。
4. 用手术钳在侧翼抬起皮肤，用与肿瘤相距几毫米的梅森鲍姆剪刀切除。
5. 通过钝化准备分离肿瘤上方的皮肤，然后用解剖钳子小心地抓住肿瘤，将肿瘤从身体的表面筋膜中分离。
6. 用 DPBS 冲洗肿瘤，放入培养皿中，并切除相邻的结缔组织。
7. 此时，执行以下一项:
   1. 切割 30 mm³ 立方体并创建新的 PDX（在点 7.7.4 处使用协议）。
   2. 将肿瘤切成切片，然后转移到形态盒式磁带中，保存在4%甲醛中，供以后的石蜡嵌入。
   3. 用组织存储溶液将肿瘤保存在管子中，将其添加到生物库（在第 3 步使用协议）和/或创建 PDX 衍生的细胞系（在第 4 步使用协议）

9. 生物库和数据管理

1. 根据 表 1为每个肿瘤病例分配内部 ID 。

表1:样本ID的定义。

2. 将患者同意书与肿瘤 ID 一起以电子和纸质形式存储。
3. 收集尽可能多的临床数据，并单独存储它们。
4. 使用数据管理软件（例如冷冻机）或其他软件，并创建一个带有标签打印软件的界面，以生成耐温、自粘条形码标签。
5. 通过打开数据管理软件添加新样本，定义标本类型并记录以下信息:肿瘤 ID、组织类型、冻结方法、日期、负责员工、通道号、鼠标 ID 和鼠标菌株。
6. 将样品分配到储罐中的特定位置。
7. PDX 的跟踪和监控（适用于步骤 7-8）
   1. 在便携式蓝牙设备（笔记本电脑或平板电脑）上使用 MS Access 数据库（或类似系统）来记录肿瘤 ID、植入日期、安乐死日期、鼠标年龄和菌株以及肿瘤随着时间的推移的生长。
   2. 将微芯片读取器连接到设备，并在植入前读取微芯片。
   3. 为每个鼠标分配特定 ID:我们使用以下方案:（见下表2）
   4. 植入后，将 ID 与鼠标特征一起记录在数据库中。
   5. 重读微芯片并检查微芯片的规格、数据库和低温管标签是否一致。
   6. 相应地为每个鼠标笼创建一个标签。
      注:要创建物理备份，请将带有相应微芯片标签的低温管标签贴在小册子中，并注明日期和鼠标应变。
   7. 要监测单个 PDX 的肿瘤生长，使用连接到数据库设备的读卡器扫描小鼠的微芯片，以进行识别，并记录每周由卡钳测量的肿瘤大小。
   8. 通过分析肿瘤的生长曲线，规划PDX收获的理想时间点。

表2:PDX ID的定义。

在我们手中，初级细胞培养（图2A和B）的建立率是12.9%，在一个大系列9。&d

没有。