单一肌纤维培养测定法用于评估体外成人肌肉干细胞功能

成人骨骼肌是有丝分裂后组织，主要由多核肌纤维组成，肌纤维是自主运动的效应细胞。它具有显着的再生能力，这一过程类似于胚胎肌原，并经历年龄和疾病的损害¹。骨骼肌的这种惊人的再生能力取决于肌肉干细胞（MuSC），由于它们位于肌层和肌纤维的基底层之间，因此也称为卫星细胞^2，3。在静止条件下，MuSC是静止的，其特征在于转录因子Pax7和静音标记物如Sprouty1 4，5，6，7，8的表达。在激活时，例如，在损伤后，MuSC离开静止状态并上调肌源性调节因子MyoD⁹。Pax7 / MyoD双阳性MuSC增殖和分化，从而产生肌原前体细胞，这些细胞通常也被称为成肌细胞。然后，这些成肌细胞进一步分化成细长的肌细胞，这一过程与分子和形态变化相吻合，例如，Pax7的丧失和肌原蛋白表达¹⁰的上调。然后，肌细胞最终相互融合或融合到现有的肌纤维，从而修复受损组织。重要的是，一小部分肌肉干细胞恢复MyoD上调，并能够自我更新¹¹。通过研究Pax7，MyoD和Myogenin¹⁰等肌源标志物可以很容易地观察到MuSC分化和肌原进展的状态。

单一肌峰凝剂与其相邻的MuSCs的培养是在离体环境中研究MuSC功能的极好方法，因为MuSC保留在其内源性生态位^12，13中。MuSC的行为由内在信号以及由生态位提供的外在信号调节，生态位是一个特殊的解剖学位置，包括MuSC周围的细胞外基质（ECM）的成分和肌纤维本身。例如，MuSC静止的外在调节器之一是Notch信号传导。在这里，MuSC从肌纤维和ECM^14，15，16接收信号线索。此外，MuSC生态位对于控制MuSC的分裂轴非常重要，从而调节MuSC子细胞^17，18的细胞命运。合理地，不对称的MuSC分裂，肌源进展和自我更新等参数可以在这种实验设置中进行唯一的评估。例如，在培养期72小时后，一个MuSC可以形成多细胞簇，可以研究不同肌源性群体的发生和百分比，例如自我更新，增殖和进一步分化的MuSCs 8，19，20，21。MuSC的分化状态可以通过研究Pax7，MyoD和Myogenin的表达/共表达来确定。培养72小时后，可以通过以下参数区分簇中的细胞:Pax7只有细胞是自我更新的MuSC，而Pax7 / MyoD双阳性细胞是增殖/活化的MuSC，进一步分化的肌原细胞是Myogenin阳性^22。此外，除了肌原进展之外，还可以研究MuSC数量或重新进入细胞周期/活化，例如，通过基于上述参数的基于免疫荧光的分析。

在这里，描述了肌纤维分离和培养方案的独特特征，例如，保存MuSC与其龛位的相互作用。小鼠整个EDL（长指伸肌）肌肉被仔细解剖，被胶原酶消化，并物理研磨以获得单个肌纤维及其相关的MuSC进行进一步培养。此外，该协议还描述了用siRNA转染MuSC的步骤，用于候选基因的功能分析和基于免疫荧光的连续分析，而无需转基因动物。

动物的牺牲必须按照国家动物实验规定进行。这里描述的协议是根据莱布尼茨衰老研究所 - 弗里茨·李普曼研究所的指导方针和欧盟（EU）指令2010/63 / EU（器官摘取许可证编号:O_JvM_18-20）执行的。 图1总结了该协议的基本步骤。

1. 培养板、培养基和巴斯德移液器的制备

注意:分离和培养单个肌峰布所需的所有材料和设备都需要尽可能无菌。因此，建议在半无菌解剖罩下分离单个肌纤维。

1. 使用无菌HS（马血清）涂覆组织培养板。涂层可防止单个肌纤维附着在塑料表面。对于每只小鼠，需要4孔12孔板用于分离，24孔板的专用孔用于培养。将1 mL的12孔板的孔和具有0.5mL HS的24孔板的孔在室温（室温）下孵育5分钟，然后取出HS并让板再干燥5分钟。
   注意:如果保持无菌，HS可以多次收集并重复用于涂层目的。
2. 通过补充DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）和20%FBS（胎儿牛血清）来制备肌纤维分离培养基，通过0.22μm过滤器过滤。在分离前约30分钟将培养基加入预包被的隔离板（12孔板，每孔2-4mL分离培养基），并在加湿的37°C培养箱中平衡，其中CO₂为5%。
3. 通过补充DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）和20%FBS（胎儿牛血清）和1%鸡胚提取物来制备肌纤维培养基，通过0.22μm过滤器过滤。在分离前约30分钟向预包衣培养板（24孔板）的每个孔中加入0.5mL培养基，并在加湿的37°C培养箱中平衡，其中CO_为5%。
4. 通过将0.2%（w / v）胶原酶1型（来自组织 溶解梭状芽胞杆菌）溶解在DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）中来制备胶原酶消化溶液，通过0.22μm过滤器过滤。对于两个EDL（长指伸肌）肌肉，在无菌的15 mL反应管中使用2.5 mL胶原酶溶液。此外，在开始隔离之前，在37°C的循环水浴中预热溶液约10分钟。
5. 准备无菌巴斯德移液器，用于胶原酶消化的肌肉的研磨。使用钻石笔切割巴斯德移液器。
   1. 对于每只小鼠，使用一个大孔径移液器，开口约0.3厘米，长度约10-12厘米，第二个玻璃移液器，小开口约0.1厘米，长度约22厘米（图2F）。
   2. 通过用本生燃烧器的火焰进行热抛光，使两个移液器的边缘变得光滑。轻轻移动，将移液器吸头放入火焰中5-10秒，以允许均匀的热量分布，直到锋利的玻璃边缘变得平滑。
   3. 使用前立即用无菌HS涂覆两种类型的玻璃移液器，在整个移液器中加入〜2mL HS5分钟，然后，弹出HS并让移液器在室温下干燥5分钟。

2. EDL肌肉分离和胶原酶消化

1. 用70%乙醇喷洒所有设备，以避免污染。
2. 按照国家动物实验规定牺牲小鼠。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠的后肢。使用硬化的细弯曲剪刀（24毫米切削刃）和细镊子（Dumont 7，弯曲或直）去除皮肤并暴露下面的肌肉。避免下层肌肉与皮毛接触（增加污染的风险）。
4. 用细小弯曲的镊子去除周围的筋膜，而不会损坏下面的肌肉（图2A）。合上镊子以避免弯曲。
5. 使用弯曲的镊子暴露TA（胫骨前）和EDL肌肉的远端肌腱。要去除TA，请用镊子抓住远端TA肌腱，并用精细的Vannas弹簧剪刀（5毫米切削刃，0.35毫米尖端直径）切割。当将TA保持在肌腱处时，将其拉向膝盖并切开靠近膝盖的肌肉（图2B），EDL肌肉现在暴露在外。
   注意:请确保在此步骤中仅抓住TA肌腱，否则下面的EDL可能会损坏。当切断TA肌肉时，请确保膝盖处的肌腱在之后可以很容易地看到。
6. 用细弯曲的镊子抬起远端EDL肌腱，并用细Vannas弹簧剪刀切割（图2C）。通过小心地将EDL拉向膝盖来暴露近端EDL肌腱。用细的Vannas弹簧剪刀剪开近端肌腱。将EDL肌肉转移到步骤1.4的15mL反应管中预热的37°C的2.5mL胶原酶消化溶液中。（图2D）。
   注意:在外膝关节结缔组织做一个小切口，以完全暴露EDL肌腱近端。确保只抓住肌腱，不要过度拉伸EDL。
7. 重复步骤 2.3。到 2.6.与第二个EDL。将两块EDL肌肉加入装有2.5 mL胶原酶消化溶液的同一15 mL反应管中。
8. 将EDL肌肉在循环水浴中在37°C的反应管中孵育。
   注意:孵育时间取决于几个因素，例如胶原酶活性，小鼠年龄和纤维化组织的数量。成年小鼠（2-6个月大）的EDL肌肉的典型孵育时间为1-1.5小时，老年小鼠（18个月大）的典型孵育时间为1.5-2小时。
9. 为避免肌肉过度消化，请在消化时间检查肌肉。当肌肉松弛并且可以看到单个肌纤维时停止消化（图2E）。用大口径移液管小心地将肌肉转移到含有肌纤维分离培养基的预热12孔板的第一孔（图2G）。

3. 肌纤维解离与培养

1. 对于以下步骤，请使用立体双目显微镜，最好配备加热板（37°C）。使用大口径移液器用温隔离培养基冲洗肌肉，直到释放单个肌排纤维。用大口径移液器解离肌肉，直到所需数量的肌纤维在溶液中自由漂浮。
   注意:避免过度研磨，以降低肌纤维受损的风险。强烈建议使用加热板进行肌纤维解离，因为在分离过程中温度会下降，这将导致肌纤维死亡。
2. 将带有HS涂层的小口径玻璃移液器的非收缩肌峰（图2H）转移到充满隔离介质的第二孔中，以洗去碎片和收缩（损坏的）肌峰（图2I）。
   注意:为避免孤立的肌纤维过度移动，可以将它们转移到第二个孔中，然后可以继续研磨过程。
3. 将未收缩的肌纤维转移到下一个（第3^个）充满隔离培养基的孔中再次洗涤。
4. 使用涂有HS的小口径玻璃移液器将约50-100个非收缩肌力移植到含有肌纤维培养基的24孔板中。
5. 在37°C，5%CO₂ 下孵育肌纤维，用于专用时间（建议最长96小时）。
   注意:μSCs在培养42小时后分裂一次平面或顶端基底。此外，在培养72小时后，MuSCs形成由自我更新，增殖或承诺（分化）MuSC组成的多细胞簇。

4. 硅核酸转染

1. 肌纤维分离后4小时，用脂质转染试剂转染肌纤维相关MuSCs（在充满500μL培养基的24孔板的一个孔中转染50-100个非收缩肌奥夫体），例如根据制造商的方案，终浓度为5 pmol siRNA。因此，将25μLOpti-MEM和相应体积的siRNA加入到含有1.5μL转染试剂的25μL Opti-MEM中。孵育反应混合物5分钟，然后加入到500μL培养基中。
   注意:对于较长的培养期，例如超过48小时，建议在24小时或48小时后进行第二次转染。转染后无需更换培养基。

5. 固定和中频染色

1. 对于免疫染色，请使用立体双目显微镜。以下步骤中的所有体积都调整到24孔板的一个孔中。使用HS涂层的小口径移液器执行所有以下步骤。
2. 小心地丢弃肌纤维培养基，同时在孔中留下一些溶液（每24孔约100μL）。对于所有进一步的步骤，请执行此操作，除非另有说明以允许肌纤维漂浮。加入500μL2%PFA以将肌纤维与相邻的MuSC固定，在室温（RT）下孵育5分钟。
3. 小心地除去上清液，并用PBS洗涤肌峰三次（pH 7.4，500μL，每次室温5分钟）。
4. 加入500μL透化溶液（0.1%Triton X-100，PBS中0.1M甘氨酸，pH 7.4），在室温下孵育10分钟。
5. 除去透化溶液，加入500μL封闭溶液（PBS中的5%HS，pH 7.4）在室温下1小时。
   注意:检查推荐的一抗封闭溶液，以避免非特异性结合。
6. 除去封闭溶液，每孔加入300μL一抗稀释液（例如，抗Pax7（PAX7，DSHB，未稀释），抗MyoD（克隆G-1，Santa Cruz，1:200））。在4°C孵育过夜。
7. 用每孔500μLPBS洗涤三次（室温5分钟）。
8. 除去PBS，每孔加入300μL二抗稀释液（例如，抗小鼠IgG1-546和抗小鼠IgG2b-488 1:1000）。在避光室下孵育1小时。对于以下步骤，建议使用轻度减少条件。
9. 用每孔500μLPBS洗涤两次（室温5分钟）。
10. 通过在每孔使用500μL溶液（最终DAPI浓度10μg/ mL）在室温下进行5分钟进行DAPI染色。
11. 用每孔500μLPBS洗涤两次（室温5分钟）。
12. 使用疏水笔在微观载玻片上画一个圆圈，以形成防水屏障，防止含有肌纤维的液体溢出。将尽可能小体积的肌峰移送到显微载玻片上，并将它们分散在载玻片上。
    注意:避免在微观载玻片上物理拉动肌，因为这可能会导致摩擦，导致簇与肌纤维分离。
13. 用小口径巴斯德移液器或200μL移液器除去残留液体。
14. 使用两滴水性安装介质，并用盖玻片覆盖肌纤维。让载玻片在制造商建议的时间内干燥。将载玻片储存在4°C的黑暗中。

该协议为单肌峰管与来自小鼠EDL肌肉的相关MuSCs的成功衍生和培养提供了说明。 图1总结了该协议的基本步骤。小心地对EDL肌肉进行肌腱到肌腱的夹层（图2A-C）对于高产的活肌纤维至关重要。肌肉解离首先通过胶原酶消化（图2D）实现，然后通过物理研磨（图2G）实现。培养完整的肌纤维（图2H），而超包合和死亡的肌峰纤维（图2I）应排除在培养和分析之外。

MuSC在分离过程中保持肌纤维相关。转录因子Pax7的免疫荧光染色鉴定并区分了7-9个MuSC细胞核与每个肌纤维的大量肌核，当在分离过程完成后直接固定时（图3A）。图3B显示了图3A中具有额外明场通道的放大区域，该通道暴露了肌管的亚细胞肌原纤维结构，并在粘液素核中显示了Pax7免疫荧光信号。

肌纤维相关MuSC的激活和肌原进展可以通过肌原标志物表达进行分析。与新鲜分离的肌纤维（0小时）相关，可以发现大多数静止的MuSC，其特征在于Pax7表达和缺乏MyoD表达，因此类似于体内稳态状态（图4，0小时）。由于解剖/解离程序和肌纤维培养基组成，MuSC迅速激活和上调转录因子MyoD以促进增殖，正如在42小时观察到的那样，当MuSC经历第一次分裂时（图4，42小时）。培养72小时后，MuSC形成具有不同肌原命运的后代簇，与不同肌原标记的表达模式平行（图4，72小时）。只有Pax7 +细胞抵抗分化并成为自我更新的干细胞。Pax7 +和MyoD +双阳性细胞是增殖的，而只有MyoD +的细胞沿着肌原谱系进一步发展并会分化。

肌纤维培养系统允许通过各种干预措施有效地干扰MuSC活性，其中之一是siRNA转染，如本方案中详细描述的那样。为了监测肌纤维相关MuSC的转染效率，转染了荧光标记的非靶向siRNA。Pax7阳性MuSC以颗粒状方式积累细胞质siRNA，表明有效摄取（图5A）。在肌纤维的细胞质中没有观察到荧光颗粒，表明在分离后4小时肌纤维中存在天然的摄取屏障，并且siRNA转染特异性靶向MuSCs。对每个肌纤维的阳性转染Pax7 +细胞的定量显示，超过一半的MuSC在24小时完成第一轮分裂之前吸收了可见量的荧光标记siRNA。转染的Pax7 +细胞的数量在30小时后进一步增加至74%（图5B）。此外，在两个时间点，转染或未转染条件的每个肌纤维的Pax7 +细胞数量没有差异，表明转染程序对干细胞数量没有不利影响（图5C）。

总之，该协议提供了EDL单肌力补板及其相邻肌肉干细胞的分离和培养的详细描述。它能够研究肌纤维相关的肌肉干细胞活体活性，例如，通过基于免疫荧光的分析。通过siRNA转染操作肌肉干细胞是有效的，并为功能分析提供了方法学基础。

图1:基本步骤的示意图摘要。 本图总结了分离和免疫染色程序的基本步骤。缩写:DMEM，Dulbecco的Modified Eagle's Medium;FBS，胎牛血清;CEE，鸡胚提取物;TA， 胫骨前部;EDL， extensor digitorum longus 请单击此处查看此图的放大版本。

图2:小鼠EDL解剖和单肌纤维分离（A）移除小鼠后肢的皮肤，拉开筋膜周围的肌肉，露出TA（胫骨前）肌。（B）去除TA肌以暴露EDL（长指伸肌）肌肉，以白色箭头标记。（C）EDL肌肉通过切割其肌腱进行解剖。（D） 两块EDL肌肉被胶原酶消化。（E）胶原酶消化肌肉的外观，可见单个肌纤维从组织核心松动。（F） 大口径和小口径巴斯德移液器与鳞片。（G） EDL肌肉（用黑色箭头标记）使用大口径巴斯德移液器进行物理研磨。（H）单个完整的肌纤维化物薄而有光泽，可以单独收集用于培养和分析。（I） 超包和死亡的肌纤维不适合培养和分析。使用N-Achroplan 5x物镜用显微镜捕获2H和2I的显微图像。比例尺为200μm，请点击此处查看此图的放大版本。

图3:整个单个肌纤维及其相关MuSC的显微图像。制备来自年轻C57BL / 6小鼠EDL的单个肌峰布，并在分离（0 h）后固定PFA。（A） Pax7 和 DAPI 免疫荧光染色可识别肌纤维相关肌肉干细胞（MuSC，用箭头标记）。使用配备Plan-Apochromat 40x油物镜的显微镜的瓷砖和z-stack功能捕获显微图像。比例尺为200μm.（B）放大倍率（A），显示明场中肌核，一个Pax7阳性核和来自肌原纤维结构的明暗图案。比例尺为10μm，请点击此处查看此图的放大版本。

图4:单次肌纤维培养过程中MuSC激活和肌原进展的免疫荧光图像。 新鲜分离的肌纤维（0小时）的肌肉干细胞（MuSC）代表接近体内静止的稳态状态，其特征在于Pax7的表达和缺乏MyoD表达。在单次肌纤维培养期间，大多数MuSC上调MyoD并重新进入细胞周期以分裂和增殖（42小时）。培养72小时后，可以根据肌源标记物表达来区分MuSC的命运。仅具有Pax7表达的细胞将自我更新（红色箭头），而Pax7和MyoD双阳性细胞（红色/绿色箭头）继续增殖。MyoD只有阳性细胞（绿色箭头）致力于肌源分化。使用具有Plan-Apochromat 20x物镜（0小时，42小时）或LD Plan-Neofluar 40x物镜（72小时）的显微镜捕获显微镜图像。比例尺为20μm， 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:MuSC的荧光siRNA转染和摄取分析。按照该方案提供的步骤制备EDL单肌奥非布，并用荧光标记的siRNA（siGLO）转染。（A）在培养30小时时，siGLO颗粒的细胞质特异性地积聚在单个肌纤维上的Pax7阳性肌肉干细胞（MuSC）中。使用具有Plan-Apochromat 100x油物镜的显微镜的z-stack和apotome功能捕获显微图像。比例尺为5μm（B）在培养24或30小时时Pax7阳性肌肉干细胞对siRNA的摄取进行定量。（C） 每根肌纤维的Pax7阳性细胞数，比较培养24或30小时时未转染和转染的情况。数据显示为平均值，标准偏差为n = 4只小鼠。请点击此处查看此图的放大版本。

作者声明没有竞争的经济利益。