人鼻上皮类器官的培养和成像

技术介绍
基于离体培养的检测是精准医学和疾病病理生理学研究中日益常用的工具。原发性人鼻上皮（HNE）细胞培养物已被用于囊性纤维化^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9}，^{10，11，12，13}的众多研究中，一种影响多个器官上皮细胞功能的常染色体隐性遗传病。HNE 培养提供可再生的气道上皮来源，可前瞻性地获得，并概括电生理和生化特性，以测试囊性纤维化跨膜传导调节剂 （CFTR） 活性。HNE细胞可以以最小的副作用¹⁴进行采样，类似于普通的病毒呼吸道拭子。描述源自HNE刷式活检的囊性纤维化研究模型的研究工作最近发表了^11，13。虽然与使用原代HNE^2，3和肠组织^{15，16，17，18，19}的其他模型相似，但此处描述了该模型的分化和成像的详细表征，以用于CF研究和辅助其他气道疾病的研究¹³.类器官模型不像永生化细胞系那样是无限的，但可以通过条件重编程（使用辐照和灭活的饲养层成纤维细胞和Rho激酶抑制剂）扩展到更像干细胞的状态^{20，21，22，23}。使用这种方法处理HNE刷活检可产生大量上皮细胞，用于多种应用，具有更高的通量，同时仍保留完全分化的能力。虽然该方案是使用饲养层细胞开发的，但希望避免使用饲养层细胞技术的研究者可以使用其他方法^14，24。

该技术对肺生物学的重要性
一项重要的研究致力于了解上皮细胞细胞膜中缺乏规则的，功能正常的CFTR如何导致肺，胰腺，肝脏，肠道或其他组织的功能障碍。功能失调的上皮离子转运，特别是氯化物和碳酸氢盐的上皮离子转运，导致上皮衬里液体积减少和粘液分泌物改变，导致粘液淤滞和梗阻。在其他气道疾病中，例如原发性纤毛运动障碍，睫状体运动改变会损害粘膜纤毛清除并导致粘液淤滞和梗阻²⁵。因此，目前的HNE类器官模型已经针对各种应用而开发，这取决于研究者的实验设计和资源。这包括使用活细胞染色剂的活细胞成像;固定和切片以表征形态;用抗体和全贴片共聚焦成像进行免疫荧光染色，以避免破坏腔内结构;和明场成像和微光学相干断层扫描，用于定量测量纤毛搏动频率和粘膜纤毛转运¹³.为了便于扩展到其他研究者，市售试剂和用品被用于培养。开发了一种功能测定法，使用常见的显微镜技术和更专业的设备。总体而言，虽然本模型被设计为在基线或响应于治疗时评估CFTR活性，但该方案中描述的技术可以应用于涉及上皮细胞功能的其他疾病，特别是上皮细胞液运输。

与其他方法的比较
最近，通过将患者类器官的体外CFTR调节剂反应与其临床反应相关联，开发了这种类器官模型的实用性¹¹。值得注意的是，本模型还证明了在相同患者中并行的短路电流响应，这是评估CFTR功能的当前金标准。短路电流不同于溶胀测定，因为前者通过离子输运²⁶测量CFTR功能。相比之下，该测定测量流体运输的下游效应，提供有关CFTR^{27，28，29，}30^，31，32的整体功能的额外^信息。短路电流测量仍然是确定CFTR氯化物通道活性^1，33的常用可靠方法。这些电生理测定需要专门的昂贵设备，每个实验重复需要比类器官测定多许多倍的细胞，不容易自动化，并且不适合扩大规模以适应更高的通量应用。另一种衍生自肠上皮细胞的类器官模型具有^{15、16、17、18}的附加优点，例如更优异的复制能力，但既不是从气道组织衍生的，也不是普遍可用的。HNE刷牙是用廉价的细胞学刷获得的，无需镇静，风险最小。刷牙不需要临床医生，可以由训练有素的研究协调员和其他研究人员进行¹⁴.HNE类器官模型可以由任何具有原代细胞培养能力的实验室进行培养，并且某些应用可以使用标准显微镜技术进行。总而言之，这些优势为评估气道上皮功能提供了额外的技术，否则某些实验室可能无法获得这些技术。此外，HNE类器官可用于研究影响气道的其他疾病状态，例如原发性睫状体运动障碍²⁵或病毒感染，而肠道类器官则不能。

HNE样本是在阿拉巴马州儿童医院收集的。此处描述的所有程序和方法均已获得伯明翰阿拉巴马大学IRB（UAB IRB #151030001）的批准。为了促进人鼻上皮细胞（HNEs）的扩增和功能的提高，本培养方法改编自公知的气液界面（ALI）培养方法^28，34。如前面描述的^12，14所示，最初通过刷子活检收集HNE，唯一的区别是使用细胞学刷。所有样品处理步骤和细胞培养都在生物安全柜中进行。

1. 鼻上皮细胞的细胞培养和扩增

1. 刷牙后，将鼻活检样品储存在8 mLRPMI培养基中，置于冰上15 mL锥形管中，并在4小时（不超过24小时）内将其转移到实验室。
2. 将鼻刷活检结果解离到 15 mL 锥形管中的 8 mL 脊柱重整米培养基中，方法是将细胞学刷通过 1 mL 大口径移液器吸头（切除吸头）数次，直到刷子清除组织。
3. 将细胞在4°C下以500× g 离心5分钟，除去上清液，然后将细胞沉淀重新悬浮在3mL细胞分离溶液中（参见 材料表），并在室温下孵育16分钟以消化。
4. 使用5 mL扩增培养基（表1）洗涤细胞两次。然后，将细胞加入预先接种有辐照和灭活的3T3成纤维细胞²² （50%-60%汇合）的T75烧瓶中，以共培养细胞并在扩增培养基中扩增7-14天（参见 图1 中的相应集落）。使用前，测试照射的3T3成纤维细胞，以确保它们不会增殖，这将对上皮细胞的扩张产生负面影响。
   注意:如果鼻上皮细胞汇合度在14天内未达到70%，则丢弃细胞。
5. 对于源自CF患者的细胞，将4种抗生素（100μg/mL妥布霉素，2.5μg/mL两性霉素B，100μg/mL头孢他啶，100μg/mL万古霉素，见 材料表）引入扩增培养基中，对培养基进行前3天消毒，然后用无抗生素扩增培养基替换培养基，每2天更换一次培养基。
   注意:这种抗生素的有限使用旨在减少由于细菌定植引起的培养损失，同时鼓励在去除其他抗生素后增殖。如果需要，这些抗生素可以根据患者的特定微生物学结果进行定制，并具有敏感性。
6. 一旦细胞达到约80%汇合，使用双胰蛋白酶消化法²² 从共培养中收获HNE。这种方法确保从烧瓶中除去辐照和灭活的3T3成纤维细胞，并且它们不会污染随后的类器官播种。
   1. 用1x DPBS洗涤细胞，然后将1.5mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA加入T75烧瓶中，在37°C下4分钟，以从培养物中除去照射和灭活的3T3成纤维细胞。
   2. 用1x DPBS冲洗T75烧瓶两次，以彻底洗掉任何剩余的3T3成纤维细胞;将1.5mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA加入T75烧瓶中，在37°C下10分钟以分离HNE。
   3. 用大豆胰蛋白酶抑制剂（见 材料表）以1:1的比例中和胰蛋白酶。将细胞以500× g 离心5分钟，然后除去上清液。用5mL扩增培养基洗涤细胞一次后，细胞准备好接种以生长类器官。
      注意:推荐将传代数为3的HNE用于进一步的实验。

2.载玻片和培养插入物中类器官的生长和分化

1. 在4°C下解冻类器官培养细胞外基质（ECM）过夜。 将移液器吸头冷却至4°C，并在4°C下将15孔血管生成载玻片（参见 材料表）过夜。
   注意:ECM应在需要进行细胞收获的前一天晚上置于4°C。
2. 将载玻片涂有5μL冷的100%ECM在冰上（移液器5μL冷的100%ECM与冷移液器尖端进入15孔载玻片的每个孔），然后将其放入37°C的细胞培养箱中至少30分钟以进行巩固。
3. 使用血细胞计数器计数从共培养中收获的HNE，并将细胞稀释至500个细胞/ μL，总数量为20%，用分化培养基稀释的ECM（表2）在冰上。然后，将5μL冷细胞/ ECM混合物接种到涂有ECM的载玻片的每个孔中。
4. 立即将载玻片转移到37°C的培养箱中1小时以巩固细胞/ ECM混合物。
5. 用50μL分化培养基喂养15孔血管生成载玻片的每个孔中的细胞。每隔一天更换培养基，直到类器官准备好进行进一步的实验。
   注意:类器官通常可以在1-2天后可视化。在载玻片的每个孔中通常形成20-90个类器官。类器官通常可以在ECM中存活40-60天，当保持在37°C的加湿培养箱中时，每隔一天喂食一次。
6. 按照下面提到的步骤，在培养插入物中培养类器官（参见 材料表），以用于特定应用（例如组织学或免疫荧光的切片）进行更大数量。
   1. 为了在培养插入物中生长类器官，准备类器官培养ECM，移液器吸头和插入物，如步骤2.1-2.2中所述。用100μL冷的100%ECM涂覆插入物。
   2. 在插入片段的ECM包衣顶部接种60μL细胞/ ECM混合物（500个细胞/ μL，分化培养基中20%ECM）。
      注意:在插入物中制造类器官的所有其他步骤与载玻片中执行的步骤相同，步骤2.4-2.5。
   3. 将600μL分化培养基加入插入物的底部。每隔一天更换培养基，直到将类器官用于实验，通常为2-3周。

3. 用于全挂载免疫荧光的类器官的制备和分离

1. 类器官的分离和固定
   1. 按照参考文献35，用细胞粘合剂（见 材料表）预处理8孔玻璃底室载玻片³⁰分钟。丢弃溶液后，将孔风干30分钟。
   2. 为了收获类器官，从ECM顶部取出培养基，然后将50μL冷的1x PBS加入到冰上15孔载玻片的每个孔中（ECM体积为1:1）。
   3. 使用200μL大口径移液器吸头上下移液3-5次，然后将溶液分配到8孔腔室载玻片孔的中心。
   4. 立即通过细吸管从孔中除去多余的液体。然后，将腔室载玻片放入37°C培养箱中40分钟，以增强粘附在玻璃底的类器官。
   5. 用1x PBS轻轻洗涤两次后，在每个孔中用300μL4%多聚甲醛固定类器官30分钟，在室温（RT）下。
   6. 用1x PBS洗涤两次，并将类器官储存在4°C的1x PBS中以进行免疫染色长达2周。
2. 免疫荧光染色
   1. 为了减少自发荧光，在1x PBS中加入250μL的50mM NH₄Cl，以RT进入每个载玻片孔30分钟，同时在振荡器上以20rpm轻轻摇动。
   2. 用1x PBS洗涤两次后，用0.1%Triton X-100透化细胞，在室温下30分钟，同时以20rpm轻轻摇动。
   3. 用1x PBS洗涤两次后，在1x PBS中加入300μL封闭溶液，包括5%BSA和0.1%Triton X-100，在室温下加入每个孔中1小时。
   4. 洗涤后，将一抗加入适当的孔中，然后加入二抗（见 材料表）。在 2% BSA 和 0.3% Triton X-100 中制备 1x PBS 中的一抗和二抗溶液。将所有一抗在4°C下孵育2天，将所有二抗在4°C下孵育1天。
      注意:最终浓度取决于实验所需的蛋白质。请在制造商的数据表上查看库存浓度。然后，根据 材料表中使用的稀释液计算最终浓度。
   5. 孵育后，用1x PBS彻底洗涤孔，并在2%BSA和0.3%Triton X-100中加入DAPI到每个孔中进行核染色。
   6. 使用共聚焦激光扫描显微镜对类器官进行成像，使用20-60x油浸物镜（参见 材料表）。使用 Z 堆栈模式设置图像的上限和下限，并使用共聚焦软件确定的推荐最佳 Z 步长。
      注意:使用以下四种共聚焦激光激发波长:408.7 nm、489.1 nm、561.7 nm 和 637.9 nm。

4. 用于组织学切片的类器官的制备和分离

1. 为了收获用于组织学研究的类器官，从培养物中取出培养基，并向冰上每个载玻片孔中加入50μL冷的1x PBS。
2. 使用 200 μL 大口径移液器吸头上下移液三到五次，将 15 孔载玻片或培养插入物中的所有溶液合并到冰上的 15 mL 锥形管中。通过添加额外的冷1x PBS将管中的总溶液体积调节至10 mL。
3. 将管在4°C，300× g 离心5分钟;吸出上清液并加入60μL温组凝胶（参见 材料表）以使用200μL大口径移液器吸头与类器官沉淀混合。
4. 立即将悬浮液转移到组织学模具中。在室温下固结组织凝胶后，将模具块放入4%多聚甲醛中，在4°C下固定过夜。
5. 嵌入石蜡后，将组织凝胶块切割成5μm横截面（例如，用切片机），将切片固定在载玻片上，并使用苏木精和曙红（H&E）或免疫荧光标记抗体染色。使用明场显微镜或倒置落射荧光显微镜拍摄图像（见 材料表）。

5. 活体类器官的成像

注:以下步骤使用自动成像系统执行（参见 材料表）。不同的成像系统需要按照其特定制造商的说明调整这些步骤。无论使用何种设备，活体类器官成像都需要一个温度受控和加湿的环境室，并带有随附的CO₂ 气体控制器。

1. 为了在进行功能性溶胀测定³⁶之前监测类器官的分化，请使用任何明场显微镜或自动成像系统手动捕获整个载玻片图像，如下所述。
   1. 打开自动成像系统和 CO₂/O₂ 气体控制器的电源，让系统完成自动校准（约 30 分钟）。
   2. 完成后，将成像系统温度设置为37°C;向加湿储液槽中加入15mL无菌水，打开CO₂ 阀门，关闭盖子，让成像系统在成像前预孵育至少30分钟。
   3. 打开自动成像软件以设置成像方案，并选择保存原始实验数据的位置。
      注:一个特定于成像系统的示例实验方案文件（补充文件 1）已作为类器官自动成像的模板提供，以监测类器官分化。
   4. 一旦满足环境设置，立即将两台带盖的15孔载玻片转移到自动成像系统的载玻片支架插件中的环境室中（参见 材料表）。
   5. 选择要成像的孔并开始成像以完成所需孔的成像。
      注意:基本的推荐设置是:4x和10x空气物镜，明场通道，2 x 2蒙太奇用于4x物镜以覆盖整个井区域，4 x 4蒙太奇用于10x物镜。Z 轴堆叠设置:三到六个 Z 堆叠切片，Z 步长 = 50-100 μm，自动对焦点以下有一到两个切片，上方有三到五个切片。
2. 要对活体类器官进行成像以用于毛喉素诱导肿胀（FIS）测定，请使用带有自动载物台的显微镜，该显微镜配备了环境控制的成像室，可控制温度和CO₂ 。
   1. 从步骤5.1.1-5.1.4开始，将步骤5.1.3中的实验方案文件替换为示例实验方案文件（补充文件2）中提供的协议文件，其中包含特定于执行FIS测定的设置。
   2. 在每次实验之前，通过评估每张载玻片的至少三个孔（最左边，中间和最右边）来调整曝光设置。应用 X 和 Y 坐标偏移，以确保所有孔的目标都位于井的中心。
      注意:建议的基本设置是:4x 空气物镜，通道 1 = 明场，通道 2 = DAPI，2 x 2 蒙太奇（四个图像图块）。Z 轴堆叠设置:三到四个 Z 堆叠切片，Z 步长 = 50-100 μm，一个切片位于自动对焦点下方，两到三个切片位于上方。图像采集时间:8小时，间隔20分钟（总读取次数= 25;读取 1 表示 T = 0）。
   3. 正确选择所有设置后，选择要为两张载玻片成像的孔，或全选，然后按照设备的说明开始运行。
   4. 运行后，保存实验，关闭成像软件，并关闭成像系统³⁷。

6. 基线流明测量

注:这是使用手动成像分析软件完成的（参见 材料表）。可以使用开源软件³⁸ 或任何可以测量图像上区域面积的软件来遵循类似的方法。

1. 在软件中，通过右键单击屏幕底部打开 "自动测量"面板 ，选择" 测量"，然后选择" 自动测量结果"。测量的每个感兴趣区域 （ROI） 的区域将显示在那里。
2. 在软件中打开类器官图像，然后选择5-10个具有可见管腔的类器官。
   注意:管腔将是类器官中间的圆形区域，其颜色明显不同于类器官的其余部分（图2A）。
3. 使用多边形ROI测量功能，右键单击图像以打开菜单，然后选择 多边形ROI 以勾勒出完整的类器官，以获得类器官的总表面积（TSA）。然后使用相同的特征，勾勒出流明面积（LA）（图2B）。
4. 对孔中剩余的类器官和测定中的所有孔重复上述步骤。
5. 将数据导出到 Excel。将LA除以TSA并平均样品中的所有类器官，以获得基线流明比（BLR）^11，13。
   注意:通常，约87%的非CF类器官的BLR将超过0.6，97%将超过0.5，而只有14%的CF类器官的BLR超过0.6，31%将超过0.5。

7. HNE类器官的预处理和自动成像

注:所有预处理步骤均在干净的生物安全柜中进行。在步骤7.1之前预先设置自动成像系统和用于记录测定的软件。DAPI的孵育是可选的，但如果明场图像的质量受到影响，建议将其作为故障安全。在这种情况下，可以分析DAPI通道（377 nm）。

1. 在37°C培养箱中，用50μL含有DAPI的DAPI（含或不带100μM CFTRinh-172（参见 材料表）的15孔载玻片孔中预孵育类器官1小时。当类器官孵育时，使用 补充文件2后面的肿胀测定定制方案执行步骤5.2.1。
2. 使用玻璃巴斯德移液器抽吸除预孵育培养基。向每个孔中加入10μM毛喉素和100μM IBMX（刺激鸡尾酒）（参见 材料表），使总体积为50μL分化培养基。
   注意:确保没有气泡被引入孔中。图像上的气泡会影响自动分析。
3. 按照步骤 5.2.2 到 5.2.4 开始 FIS 映像协议，不要延迟。每20分钟在每个孔中采集一次图像，总运行时间为8小时。

8. 毛喉素诱导的HNE类器官溶胀测定的自动分析

1. 打开自动成像分析软件，找到之前从步骤7.3保存的实验，并显示实验的图像。
2. 选择要评估的容器窗口，然后选择包含已拼接和 z 投影的已处理图像的选项。此步骤应提供整个孔的图像，其中包含成像框架内的所有类器官，以进行掩蔽评估和测量。
3. 选择要评估的油井图像。选择"分析"。对其他图像重复此过程，以确保对自动测量中包含的所有图像进行适当的遮罩。保存设置参数。
4. 完成分析设置后，应用更改。该软件将根据设置更改测量值。
   注意:初始图像预处理完成后，应执行质量控制 （QC） 措施以确保一致的遮罩。这些措施包括手动检查所有孔，以确保类器官在成像框架内，气泡或碎片没有被不恰当地掩盖，以及检查明场和DAPI通道中的掩蔽。
5. 导出汇总分析（包括绘图和统计分析）的数据。

高净值物质的扩张对于有机物文化的蓬勃发展至关重要。成功采集样本的HNE应在10天左右扩大到超过70%的汇合度。成功和不成功样本的示例分别如图1A和图1B所示。如果细胞在与辐照的3T3细胞共培养14天后不能达到70%汇合，则必须丢弃这些细胞。如果无法用其他抗菌剂快速抢救，任何受污染的细胞都应立即丢弃。

在15孔载玻片和培养插入物中比较类器官的生长。培养插入物比光学优化的载玻片更厚，离物镜更远，从而影响图像和分辨率。尽管如此，在这两种培养方法中未观察到形态学的显着差异，如图2所示。非CF和CF类器官之间可以看到形态学差异，如图3A所示。非CF类器官往往具有较大的腔内含有更多的液体。相比之下，CF类器官通常具有较小的管腔和较少的液体，有时充满粘液和碎屑。手动测量流明尺寸（图3B），计算基线流明比并如图3C所示。使用H&E和免疫荧光染色表征横截面类器官。代表性图像如图4A、B所示。气道上皮标志物（如纤毛、粘液和紧密连接）通过图 5A-D 所示的全装载免疫荧光染色在类器官中显示。根据应用的不同，可以采用切片或全安装免疫荧光。整体安装方法保持了类器官的三维性质，保持了类器官内部的完整性，如之前发表的工作13所示。

CFTR功能通过使用自动成像系统通过毛喉素诱导肿胀（FIS）测定进行评估。由于图像分辨率更高，因此仅使用15孔载玻片进行功能测定。 图6A 显示了非CF志愿者（n = 5名受试者）的具有代表性的毛喉素剂量反应实验，以说明优化成像时间和分析的基本原理。比较非CF和CF类器官反应的数据详见以前的出版物11，13。剂量反应显示CFTR活性的增量变化，以证明最佳的测量方法。评估了1小时和8小时的测定持续时间（图6B，C）以及使用平均分数变化（AFC）与曲线下面积（AUC）的分析见 图6C，D。根据我们以前的经验，大多数受试者和条件的肿胀在8小时后会趋于平稳，在某些情况下，会导致类器官在这段时间内破裂。因此，测定仅限于8小时。在这种延长的测定长度下，肿胀变得非线性。AUC的使用还考虑了尺寸的变化和变化率。因此，在最终方法中，超过8小时的AUC用于所有FIS测定。

图1:共培养中HNE的明场图像。 HNE在具有辐照和灭活的3T3成纤维细胞的扩增培养基中扩增10天。倒置明场显微镜用于细胞成像。（A）高净值企业在一个大簇中生长良好（黑色箭头）。相反，在（B）中，HNE在辐射的3T3细胞周围的两个小簇（黑色箭头）中生长不良。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图2:15孔载玻片和培养插入物中的HNE类器官形成。 使用倒置明场显微镜在21天内捕获类器官的明场图像。15孔载玻片（A）中的类器官比培养插入物（B）中的类器官具有更精确，更清晰的图像。在载玻片和插入物中培养的类器官之间没有观察到形态学差异。 请点击此处查看此图的大图。

图3:类器官管腔尺寸（图A）和管腔测量值（图B和C）。 （A）非CF类器官通常比CF（F508del / F508del）类器官具有更大的管腔和更多的液体。（B）一种手动测量红色轮廓所指示的总表面积（TSA）和由单个类器官中的绿色轮廓指示的管腔面积（LA）的方法。（C）使用总表面积和管腔面积来计算非CF与CF受试者的类器官的基线流明比（LA:TSA）的示例。误差线表示标准差。 请点击此处查看此图的大图。

图4:嵌在石蜡中的类器官的横截面。 （A）来自非CF和CF（F508del / F508del）受试者的类器官中的H&E染色示例。（B）类器官纤毛的免疫荧光染色。绿色是用乙酰化微管蛋白和FITC标记的二抗染色的纤毛（白色箭头），蓝色是用DAPI标记的细胞核。 请点击此处查看此图的大图。

图5:类器官中全贴片免疫荧光的共聚焦图像。 （A，C）两个代表性类器官的最大投影图像。（B，D）分别为（A）和（C）的三维重建图像。在共聚焦显微镜的平台上安装了8孔玻璃底载玻片，并使用40x透镜创建显微照片。成像分析软件应用于图像的成像和重建。白色箭头表示类器官管腔内的粘液（ B中）和纤毛（ C中）。 请点击此处查看此图的大图。

图6:溶胀测定长度和分析方法的基本原理。 毛喉素（FSK）诱导肿胀（FIS）测定，以测试原代鼻上皮细胞上的CFTR功能。将图中指示的不同剂量的毛喉素施用到分化培养基中21天大的类器官中;立即用自动成像仪记录类器官肿胀8小时。8小时后，使用平均分数变化（AFC）在（A）（n = 5，非CF受试者）中显示肿胀。将FSK剂量反应与1小时（B）与8小时（C）时的AFC进行比较，这表明8小时测定可以在不同的FSK剂量之间产生比1小时时更显着的肿胀差异。面板中的 X 轴 （B-D） 表示与图例中的符号对应的不同处理条件。图中的所有误差线都表示标准偏差。请点击此处查看此图的大图。

表1:用于制作扩展介质的所有组件。描述了有关试剂储备浓度、库存储存、用于制造 500 mL 培养基的库存量以及最终浓度的详细信息。 请按此下载此表格。

表2:用于制造差异化介质的所有组件。描述了有关试剂储备浓度、库存储存、用于制造 500 mL 培养基的库存量以及最终浓度的详细信息。 请按此下载此表格。

补充文件1:提供特定于成像系统的示例协议文件，作为类器官自动成像以监测类器官分化的模板。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2:包含特定于执行 FIS 测定的设置的示例实验方案文件。请点击此处下载此文件。

JSG在北卡罗来纳大学的专利申请20170242033中被列为发明人，该专利申请描述了类似的模型。当UNC的许可技术产生特许权使用费时，发明人将获得一部分收入。否则，作者声明没有利益冲突。资助者在研究的设计，数据的收集，分析或解释，手稿的撰写或发表结果的决定中没有任何作用。