本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
类器官与免疫细胞的复杂共培养体系为研究黏膜稳态背后双向相互作用提供了多功能工具。这种三维多细胞系统为研究多因素疾病以及解决在分析组织驻留固有淋巴细胞（ILC）等稀有细胞类型时遇到的技术难题提供了一种简化的模型。本文描述了一种小鼠体系，将小肠类器官与来源于小肠固有层的辅助样1型固有淋巴细胞（ILC1s）相结合，该体系可轻松扩展至其他ILC或免疫细胞群体。ILC是一类在黏膜中尤为富集的组织驻留型细胞群体，能够促进稳态，并在组织损伤或感染时迅速响应。类器官与ILC的共培养已开始揭示肠道中上皮-免疫信号模块的新机制，阐明不同ILC亚群如何影响肠上皮屏障的完整性与再生能力。本实验方案将推动上皮细胞与免疫细胞之间双向相互作用的进一步研究，有望为黏膜稳态与炎症机制提供新的见解。
引言
肠道上皮与肠道定居免疫系统之间的相互作用对于维持肠道稳态至关重要1。这些相互作用的紊乱与局部及全身性疾病相关，包括炎症性肠病（IBD）和胃肠道癌症2。近年来研究发现一个对稳态具有重要调控作用的例子，即天然淋巴细胞（ILCs）的研究，这类细胞已被确认为肠道免疫环境中的关键参与者3。ILCs 是一组异质性的天然免疫细胞，主要通过细胞因子介导的信号传导来调节肠道稳态并协调炎症反应4。
小鼠ILC根据转录因子、受体和细胞因子表达谱 broadly 分为亚型51型固有淋巴细胞（ILC1s），包括具有细胞毒性的自然杀伤（NK）细胞和辅助样1型固有淋巴细胞（ILC1s），其特征是表达转录因子eomesodermin（Eomes）以及T细胞中表达的T-box蛋白（T-bet）。6，分别分泌与T辅助细胞1型（TH1）免疫：在白细胞介素（IL）-12、IL-15 和 IL-18 刺激下产生的干扰素-γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子（TNF）7在稳态条件下，组织驻留的 ILC1 分泌转化生长因子 β（TGF-β），以促进上皮细胞增殖和基质重塑。
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方案
所有实验必须依照并遵守有关动物使用的各项相关法规和机构指南。以下文章和视频中所述研究的伦理审批已依照并遵守有关动物使用的各项相关法规和机构指南获得。
所有小鼠均按照标准伦理程序，由经过培训的人员实施颈椎脱位处死。在采集器官和组织之前，根据具体实验方案的需要，进行股动脉切开或断头操作，以确认动物死亡。动物饲养于特定病原体阴性（SPF）条件下（除非另有说明），饲养场所为经认证的商业机构以及伦敦国王学院动物实验中心，均遵循英国《1986年动物（科学程序）法案》（英国政府内政部项目许可证：PPL:70/7869，有效期至2018年9月；P9720273E，自2018年9月起）。
1. 建立小鼠小肠类器官
注意：本实验方案部分描述了从小鼠小肠组织生成肠道类器官的方法。首先从小鼠小肠组织中分离隐窝，重悬于TBEM中，然后在含有EGF、Noggin和R-Spondin（ENR）的培养基中孵育。建立小鼠小肠类器官的方法在其他文献中也已有详细描述24,25,27。
- 将TBEM置于冰上解冻（每孔40 µL），并将标准组织培养处理的24孔板（指具....
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结果
成功时，新分离的隐窝应在2-4天内形成出芽状的隐窝结构（图1A）。健康且状态良好的类器官培养物应处于活跃生长状态，可按照本方案中详述的步骤进行传代和扩增。
本方案描述了从小肠中分离RORγtGFP转基因报告小鼠品系的固有淋巴细胞1型（ILC1）的方法，该品系可用于通过流式细胞荧光分选（FACS）分离活的ILC1（图2）。采用本方案，预期可获得350–3,500个分离的ILC1细胞。
接种类器官后，可通过免疫细胞化学方法观察共培养体系（图3A-B）。ILC和上皮细胞也可通过流式细胞术进行分析，如图3C所示。ILC1可上调上皮细胞中CD44的表达，流式细胞术分析（图.......
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讨论
本方案描述了建立小鼠小肠类器官、通过最大限度减少肠道解离过程中淋巴细胞丢失来分离稀有ILC1细胞，以及在这两类组分之间建立共培养体系的方法。该方案包含多个步骤，其中部分步骤虽针对ILC1细胞，但此方法亦可应用于其他肠道免疫细胞类型，共培养体系亦可根据具体研究问题进行模块化调整。本文重点指出了若干关键步骤（建议不得偏离）以及针对技术上较具挑战性环节的故障排除指南。
利用单个Lgr5+-eGFP肠干细胞培养小鼠小肠类器官的方法已日益成熟33,34；然而，本方案建议从CD45.1动物中分离完整的利贝昆隐窝（crypts of Lieberkühn）。完整的隐窝不仅比单个Lgr5+细胞恢复更快，而且使用无GFP报告基因的CD45.1动物可确保在类器官共培养体系中不会混入污染性的CD45.2+固有淋巴样细胞（ILC），同时也兼容含有GFP报告系统的免疫细胞的使用。根据作者的经验，类器官经过1-3次传代.......
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致谢
E.R. 感谢惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：215027/Z/18/Z）提供的博士研究生奖学金。G.M.J. 感谢惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：203757/Z/16/A）提供的博士研究生奖学金。D.C. 感谢英国国家卫生研究所盖伊与圣托马斯生物医学研究中心（NIHR GSTT BRC）提供的博士研究生助学金。J.F.N. 感谢玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里奖学金、国王奖学者项目、RCUK/UKRI卢瑟福基金奖学金（MR/R024812/1）以及惠康信托基金科学种子奖（204394/Z/16/Z）。我们还感谢位于盖伊医院的BRC流式细胞术核心团队。Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 报告基因小鼠由 G. Eberl（法国巴黎巴斯德研究所）慷慨惠赠。CD45.1 C57BL/6 小鼠由 T. Lawrence（伦敦国王学院，伦敦）和 P. Barral（伦敦国王学院，伦敦）惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 抗小鼠 CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| 抗小鼠 NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 补充剂 (50X)，无血清 | Gibco | 17504044 | |
| CD127 单克隆抗体 (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 单克隆抗体 (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e 单克隆抗体 (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 单克隆抗体 (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| 胶原酶 D，500 mg | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA-RSpondin1-Fc HEK293T 细胞 | 该细胞系用于收集条件培养基中的 RSpondin1 上清液，细胞系及材料转移协议由 Leland Stanford Junior University 董事会（Calvin Kuo，医学博士，哲学博士，斯坦福大学）提供 | ||
| 中性蛋白酶 II（中性蛋白酶，II 型级） | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) 改良 Eagle 培养基与 F-12 营养混合物（高级 DMEM/F12） | Gibco | 11320033 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I，II 型级 | Merck | 10104159001 | |
| 杜氏改良 Eagle 培养基 (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| 乙二胺四乙酸 | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC 封闭剂 | 2B Scientific | BE0307 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks 平衡盐溶液 (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T-mNoggin-Fc 细胞 | 该细胞系用于收集条件培养基中的 Noggin 上清液，细胞系通过与荷兰乌得勒支 Uppsalalaan 8, 3584 CT 乌得勒支的 Hubrecht 研究所签订材料转移协议获得，基于 Farin、Van Es 和 Clevers 在 Gastroenterology（2012）发表的研究 | ||
| HEPES 缓冲液 (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 单克隆抗体 (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| 活/死可固定蓝色死细胞染色试剂盒，适用于紫外激发 | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C 单克隆抗体 (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel 生长因子减少型基底膜基质，无酚红，无 LDEV | Corning | 356231 | |
| N-2 补充剂 (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸 (500 mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 单克隆抗体 (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1X) pH 7.2 | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| 重组人 EGF，无动物成分蛋白 | R&D Systems | AFL236 | |
| 重组人 IL-15 GMP 蛋白，CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| 重组人 IL-2（无载体） | BioLegend | 589106 | |
| 重组小鼠 IL-7（无载体） | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂） | Bio-techne | 1254 | |
| 耗材 | |||
| 50 mL 管 | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL 管 | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL 移液管 | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL 管 | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL 移液管 | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 移液器吸头 | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 移液器吸头 | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 移液器吸头 | StarLab | E1011-0921 | |
| 标准组织培养处理的 24 孔板 | Falcon | 353047 | |
| 设备 | |||
| 离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| CO₂ 和温度控制培养箱 | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| 流式细胞分选仪 | BD equipment | FACS Aria II | |
| 加热振荡器 | Stuart Equipment | SI500 | |
| 冰盒 | - | - | |
| 倒置光学显微镜 | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core 成像系统 (AMEX1000) | |
| p10 移液器 | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 移液器 | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 移液器 | Eppendorf | 3124000032 | |
| 移液枪 | Eppendorf | 4430000018 | |
| 湿冰 | - | - |
参考文献
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune ho....
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重印与许可
