本文介绍了一种详细的实验方案，用于培养出生后小鼠中枢神经系统不同区域来源的高度富集的星形胶质细胞，并通过强制表达转录因子将其直接转化为功能性神经元。
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本文内容
摘要
摘要
直接神经元重编程是一种强大的技术，能够将不同起始细胞群体直接转化为功能性神经元，而无需经过多能性中间阶段。该技术不仅在疾病建模领域具有广阔前景——例如可将患有神经退行性疾病患者的成纤维细胞转化为神经元——同时也为基于细胞的替代疗法提供了极具潜力的替代方案。在此背景下，一项重要的科学突破在于证实中枢神经系统内已分化的非神经细胞（如星形胶质细胞）亦可被转化为功能性神经元。 体外。自那时起， 体外 星形胶质细胞直接重编程为神经元的研究已为揭示强制性细胞身份转换背后的分子机制以及阻碍高效重编程的障碍提供了重要见解。然而，来自 体外 由于不同实验室在分离、培养和重编程星形胶质细胞时所采用的方法存在差异，导致实验结果难以相互比较。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，可从出生后小鼠中枢神经系统的不同脑区可靠地分离和培养高纯度的星形胶质细胞。 通过 磁性细胞分选。此外，我们提供了将培养的星形胶质细胞重编程为神经元的实验方案 通过 病毒转导或DNA转染。该简化且标准化的实验方案可用于研究细胞身份维持的分子机制、新神经元身份的建立，以及特定神经元亚型的生成及其功能特性。
引言
哺乳动物的中枢神经系统（CNS）高度复杂，包含数百种不同类型的细胞，其中包括大量不同的神经元亚型1,2,3,4,5,6。与其他器官或组织7,8,9不同，哺乳动物的中枢神经系统再生能力极为有限；创伤性脑损伤或神经退行性病变导致的神经元丢失是不可逆的，常导致运动和认知功能障碍10。为了恢复脑功能，目前正深入研究多种替代丢失神经元的策略11。其中，将体细胞直接重编程为功能性神经元的方法正成为一种有前景的治疗手段12。直接重编程，又称转分化，是指将一种已分化的细胞类型直接转化为另一种细胞身份，而不经过中间的增殖状态或多能状态13,
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方案
以下操作步骤遵循德国慕尼黑亥姆霍兹中心（Helmholtz Zentrum Munich）的动物护理指南，符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU。请确保遵守实施解剖操作所在机构的动物护理指南。
1. 解剖、解离和培养材料的准备
注意：所有培养试剂均需在生物安全柜内配制，并仅使用经高压灭菌或无菌的器械进行操作。解剖和解离试剂可在生物安全柜外配制。
- 通过将T25培养瓶用聚-D-赖氨酸（储存液1 mg/mL；工作液20 µg/mL）溶于H2O中，至少包被2小时来准备培养瓶。之后用H2O冲洗3次，并风干。
- 通过将5 mL的1 M HEPES缓冲液加入500 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中来制备解离缓冲液。
- 每处理六根脊髓准备一个C管（见材料表），向其中加入1950 µL神经组织解离试剂盒中的缓冲液X（见材料表）。解剖过程中置于冰上保存。通过每C管加入20 µL缓冲液Y和10 µL缓冲液A（属于神经组织解离试剂盒；见材料表）制备酶消化主混合液。充分混匀后于4 °C保存，待用时取出。
- 制备含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（1×PBS），并置于冰上。....
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结果
星形胶质细胞的原代培养通常在经过MAC分选并接种后7至10天内达到80%–90%的融合度（图1B）。一般情况下，一个T25培养瓶可获得约1–1.5 × 106个细胞，足以在每孔接种密度为5–5.5 × 104个细胞时接种20–30个盖玻片。接种后第二天，细胞通常覆盖盖玻片表面的50%–60%（图1C）。在此阶段，培养物几乎完全由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型（如成神经细胞）几乎不存在（图1D）29。
重编程因子可递送至星形胶质细胞，方式包括 通过 逆转录病毒或慢病毒转导，或通过DNA质粒转染。通常，与转染相比，病毒转导可感染更多的细胞。由于直接神经元转化会导致大量细胞死亡34,35
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讨论
小鼠星形胶质细胞的原代培养是一种卓越的方法 体外 研究直接神经元重编程的模型系统。事实上，尽管这些细胞是在出生后阶段分离的，但仍表达典型的星形胶质细胞标志物29，保留模式形成基因的表达28,29，并保持增殖能力，类似于 体内 同龄的星形胶质细胞38经MACS分离后，细胞首先贴附于培养瓶，随后开始增殖，从而获得高度富集的星形胶质细胞培养物29重要的是，培养的星形胶质细胞不会去分化为多能细胞状态，也不会获得永生化特性。此外，在表达报告蛋白（如 DsRed 或 GFP）后，这些细胞不会自发产生神经元，而是维持星形胶质细胞的身份。同时，它们不会无限增殖，而是增殖速度逐渐减慢，并向更成熟的阶段过渡，从而降低其直接重编程为神经元的潜能。32,39
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Ines Mühlhahn在重编程载体构建方面的贡献，Paulina Chlebik在病毒制备方面的帮助，以及Magdalena Götz和Judith Fischer-Sternjak对本手稿提出的修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| 抗小鼠 IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| 抗小鼠 IgG1 生物素 | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| 抗小鼠 IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| 抗兔 Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount 封片剂 | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 添加剂 | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| 背侧形态发生素（Dorsomorphin） | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| 胎牛血清 | PAN Biotech | P30-3302 | |
| 佛司可林（Forskolin） | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000（转染试剂） | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 小鼠抗 ACSA-2 MicroBead 试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| 小鼠 IgG1 抗突触素 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| 小鼠 IgG2b 抗 Tuj-1（βIII-微管蛋白） | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 添加剂 | Life Technologies | 17502048 | |
| 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX（低血清培养基） | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140122 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma Aldrich | P1149 | |
| 兔抗 RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| 兔抗 Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| 链霉亲和素 Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
参考文献
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
- Lake, B. B., et al.
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