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方法文章

小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程

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DOI：

10.3791/64175

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2022年7月7日

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细的实验方案，用于培养出生后小鼠中枢神经系统不同区域来源的高度富集的星形胶质细胞，并通过强制表达转录因子将其直接转化为功能性神经元。

摘要

直接神经元重编程是一种强大的技术，能够将不同起始细胞群体直接转化为功能性神经元，而无需经过多能性中间阶段。该技术不仅在疾病建模领域具有广阔前景——例如可将患有神经退行性疾病患者的成纤维细胞转化为神经元——同时也为基于细胞的替代疗法提供了极具潜力的替代方案。在此背景下，一项重要的科学突破在于证实中枢神经系统内已分化的非神经细胞（如星形胶质细胞）亦可被转化为功能性神经元。 体外。自那时起， 体外 星形胶质细胞直接重编程为神经元的研究已为揭示强制性细胞身份转换背后的分子机制以及阻碍高效重编程的障碍提供了重要见解。然而，来自 体外 由于不同实验室在分离、培养和重编程星形胶质细胞时所采用的方法存在差异，导致实验结果难以相互比较。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，可从出生后小鼠中枢神经系统的不同脑区可靠地分离和培养高纯度的星形胶质细胞。 通过 磁性细胞分选。此外，我们提供了将培养的星形胶质细胞重编程为神经元的实验方案 通过 病毒转导或DNA转染。该简化且标准化的实验方案可用于研究细胞身份维持的分子机制、新神经元身份的建立，以及特定神经元亚型的生成及其功能特性。

引言

哺乳动物的中枢神经系统（CNS）高度复杂，包含数百种不同类型的细胞，其中包括大量不同的神经元亚型1,2,3,4,5,6。与其他器官或组织7,8,9不同，哺乳动物的中枢神经系统再生能力极为有限；创伤性脑损伤或神经退行性病变导致的神经元丢失是不可逆的，常导致运动和认知功能障碍10。为了恢复脑功能，目前正深入研究多种替代丢失神经元的策略11。其中，将体细胞直接重编程为功能性神经元的方法正成为一种有前景的治疗手段12。直接重编程，又称转分化，是指将一种已分化的细胞类型直接转化为另一种细胞身份，而不经过中间的增殖状态或多能状态13,14,15,16。该方法最初由发现MyoD1因子足以将成纤维细胞转化为肌细胞而开创17,18，此后已成功应用于将多种细胞类型重编程为功能性神经元19,20,21。

星形胶质细胞，中枢神经系统中最丰富的巨胶质细胞22,23，是直接神经元重编程的一种极具前景的细胞类型，原因如下。首先，它们在中枢神经系统中分布广泛且均匀，可提供充足的 原位 新生神经元的来源。其次，星形胶质细胞与神经元在发育上关系密切，因为在胚胎发育过程中它们拥有共同的祖先细胞——放射状胶质细胞24两种细胞类型具有共同的胚胎起源，这似乎比来自不同胚层细胞的重编程更有利于神经元转化。19,21此外，星形胶质细胞通过其放射状胶质细胞起源所获得的模式化信息在成年星形胶质细胞中也得以维持25,26,27，并且似乎有助于生成具有区域特异性的神经元亚型28,29,30因此，研究并理解星形胶质细胞向神经元的转化，是实现该技术在基于细胞替代治疗策略中全部潜力的重要组成部分。

转化 体外 将培养的星形胶质细胞转化为神经元已在直接神经元重编程领域取得多项突破，包括：i）鉴定出足以从星形胶质细胞生成神经元的转录因子15,19,31，ii) 在相同细胞环境下由不同重编程因子触发的分子机制的解析32，以及 iii) 强调星形胶质细胞发育起源对诱导不同神经元亚型的影响28,29,33此外， 体外 星形胶质细胞的直接转化揭示了限制直接神经元重编程的多个主要障碍34,35，例如活性氧（ROS）生成增加34 星形胶质细胞与神经元线粒体蛋白质组之间的差异35因此，这些观察结果有力地支持将星形胶质细胞的原代培养物作为直接神经元重编程的模型，用于研究生物学中的多个基本问题12，涉及细胞身份维持、阻碍细胞命运转变的障碍，以及代谢在重编程中的作用。

本文介绍了一种从出生后（P）小鼠中分离星形胶质细胞的详细方案，可获得极高纯度的细胞，已通过从小鼠脊髓中分离星形胶质细胞得到验证29我们还提供了将星形胶质细胞重编程为神经元的实验方案 通过 病毒转导或DNA质粒转染。重编程细胞可在转导后7天（7 DPT）进行分析，以评估重编程效率和神经元形态等指标，也可在培养中维持数周，以评估其随时间的成熟情况。值得注意的是，本方案并非特异针对脊髓星形胶质细胞，可直接应用于分离来自其他多种脑区的星形胶质细胞，包括大脑皮层灰质、中脑和小脑。

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方案

以下操作步骤遵循德国慕尼黑亥姆霍兹中心（Helmholtz Zentrum Munich）的动物护理指南，符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU。请确保遵守实施解剖操作所在机构的动物护理指南。

1. 解剖、解离和培养材料的准备

注意：所有培养试剂均需在生物安全柜内配制，并仅使用经高压灭菌或无菌的器械进行操作。解剖和解离试剂可在生物安全柜外配制。

  1. 通过将T25培养瓶用聚-D-赖氨酸（储存液1 mg/mL；工作液20 µg/mL）溶于H2O中，至少包被2小时来准备培养瓶。之后用H2O冲洗3次，并风干。
  2. 通过将5 mL的1 M HEPES缓冲液加入500 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中来制备解离缓冲液。
  3. 每处理六根脊髓准备一个C管（见材料表），向其中加入1950 µL神经组织解离试剂盒中的缓冲液X（见材料表）。解剖过程中置于冰上保存。通过每C管加入20 µL缓冲液Y和10 µL缓冲液A（属于神经组织解离试剂盒；见材料表）制备酶消化主混合液。充分混匀后于4 °C保存，待用时取出。
  4. 制备含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（1×PBS），并置于冰上。通过向485 mL DMEM/F12培养基中加入5 mL青霉素-链霉素（终浓度100 U/mL）、5 mL 45% D-葡萄糖和5 mL谷氨酰胺补充剂（终浓度2 mM；见材料表）来制备基础培养基。基础培养基在4 °C下可稳定保存4周。
  5. 通过向44 mL基础培养基中加入1 mL B27补充剂和5 mL胎牛血清（FBS）来制备星形胶质细胞培养基。使用前向适量培养基中添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（各10 ng/mL）。
  6. 脊髓组织解剖时，使用一对弯头大镊子、一对弯头小镊子、一对直头小镊子、一把小剪刀和一把小刮勺。

2. 星形胶质细胞的分离

  1. 从出生后小鼠的脊髓中分离星形胶质细胞，用于将其直接重编程为功能性神经元（图1A）。本方案中，采集出生后第2至第3天小鼠的脊髓组织，每次实验采集六至八根脊髓用于星形胶质细胞的分离。该方案同样适用于从中枢神经系统的其他区域（如大脑皮层、中脑和小脑）分离星形胶质细胞；对于这些区域，应在出生后第5至第7天获取细胞。
    ​注意：若需从本方案未提及的其他脑区分离星形胶质细胞，其取材年龄和组织来源需通过实验自行确定。

3. 脊髓组织解剖

注意：组织解剖可在生物安全柜外进行。

  1. 在 P2-P3 期通过断头法处死小鼠，无需对动物进行麻醉。将躯干置于 35 mm 培养皿中，并置于冰上保存。
  2. 用剪刀切开皮肤，用小剪刀取出脊椎，分离脊髓，并将其放入冰上的解剖缓冲液中。在体视显微镜下（放大倍数为 2 倍）使用镊子去除分离的脊髓上的脑膜，然后将解剖并清洁后的脊髓组织转移至 C-tube 中。

4. 磁珠激活细胞分选（MACS）

  1. 向每个C管中加入50 µL神经组织解离试剂盒中的酶P（见材料表）以及30 µL预先配制的酶混合液。将C管倒置，并放置于加热解离仪上（见材料表），确保所有组织均收集在管盖中。
  2. 运行37_NTDK_1解离程序，运行时间约为22分钟。在程序即将结束前，将70 µm细胞筛网（见材料表）置于与所用C管数量相等的15 mL离心管上，并用2 mL预冷的PBS润湿筛网。在整个MACS过程中，将1x PBS置于冰上保存。
  3. 程序结束后，取出C管并短暂离心，使组织沉降至管底。将解离后的组织通过筛网转移至已准备好的15 mL离心管中。筛网保留在15 mL离心管上。
  4. 用10 mL 1x PBS冲洗C管以回收残留组织，并再次通过筛网收集至同一15 mL离心管中。将含有解离组织的15 mL离心管在室温下以300 x g离心10分钟。
    注意：此步骤后需将离心机预冷至4 °C。
  5. 在不扰动细胞沉淀的前提下吸除上清液，然后将细胞重悬于80 µL 1x PBS中；加入 10 µL小鼠抗ACSA-2微珠试剂盒中的封闭试剂（见材料表）。用移液器轻轻吹打混匀。
  6. 在4 °C避光孵育10分钟（冰箱中）。加入10 µL偶联抗星形胶质细胞表面抗原-2的微珠 （见材料表），用移液器轻轻吹打混匀。在4 °C避光孵育15分钟。
  7. 加入3 mL 1x PBS洗涤细胞，并在4 °C以300 x g离心10分钟。离心期间，将适当数量的磁性分选柱（见材料表）安装到磁力分离器上（见材料表），并在其下方放置15 mL收集管。用500 µL 1x PBS预洗分选柱。
  8. 吸除上清液，将细胞重悬于500 µL 1x PBS中，然后将细胞悬液转移至磁性分选柱中，依靠重力自然流下。用500 µL 1x PBS冲洗15 mL离心管，并将冲洗液加至分选柱中。再用500 µL 1x PBS对分选柱进行两次额外冲洗。
  9. 将分选柱从磁力分离器上取下，加入800 µL星形胶质细胞培养基，并使用配套的推杆将细胞从柱中推出，完成洗脱。
  10. 将细胞接种至预先准备的培养瓶中，加入4.2 mL含EGF和bFGF的星形胶质细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养。
    注意：从其他脑区分离的星形胶质细胞无需包被培养瓶，但脊髓来源的星形胶质细胞在包被后的培养基质上生长更佳。
  11. 培养细胞约7天，直至达到汇合状态（80%-90%）。若7天后细胞未汇合，可继续培养至最多10天再进行传代。超过10天后，细胞增殖能力下降，重编程效率也随之降低。

5. 星形胶质细胞重编程的接种

注意：以下步骤必须在生物安全等级1级（SL1）的生物安全柜中进行。

  1. 以与之前准备培养瓶相同的方法，用多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片准备24孔板。为确定所需板数，需考虑星形胶质细胞在24孔板中的接种密度为每孔 5-5.5 × 104 个细胞。通常，从6只P2小鼠的脊髓中分离可获得约1 × 106 个细胞。
  2. 吸去含有培养星形胶质细胞的T25培养瓶中的培养基，并用1× PBS洗涤一次。加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育5分钟，使星形胶质细胞从培养瓶表面脱落。轻轻敲击培养瓶侧面以促进细胞脱落，并在10倍物镜下使用明场显微镜检查细胞脱落情况。
  3. 加入2.5 mL星形胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。以300 × g 离心5分钟，吸去上清液，用1 mL星形胶质细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数系统测定细胞浓度。
  4. 根据细胞数量，用新鲜星形胶质细胞培养基将细胞悬液稀释至每毫升含1-1.1 × 105 个细胞。向培养基中添加EGF和bFGF，每种因子终浓度为10 ng/mL。向预先准备好的24孔板的每孔中加入500 µL细胞悬液（相当于5-5.5 × 104 个细胞），于37 °C、5% CO2 条件下培养。

6. 转录因子的强制表达

注意：在开始实验方案之前，必须合理设计实验。特别是，重编程实验必须包含阴性对照，即不表达任何重编程因子的条件。例如，当使用携带重编程因子cDNA和报告基因（如绿色荧光蛋白（GFP）、DsRed）的载体时，阴性对照应为仅携带报告基因的相同载体。当表达携带不同报告基因的多个因子时，阴性对照应相应地进行调整。

  1. 铺板后的第二天，检查24孔板，确保细胞已贴附在盖玻片上。
  2. 根据实验目的和可用资源，重编程因子的强制表达可通过病毒转导（见步骤6.3）或DNA转染（见步骤6.4）实现。
    注意：使用逆转录病毒或慢病毒须获得政府主管部门批准，且必须在生物安全二级（SL2）实验室的生物安全柜内进行操作。
  3. 通过逆转录病毒或慢病毒转导细胞，以导入表达目的重编程因子所需的遗传信息，从而对星形胶质细胞进行重编程，具体步骤如下所述。
    1. 以高病毒滴度（1 x 10）转导细胞10-1 × 1012 通过将1 µL细胞悬液直接加入星形胶质细胞培养基中，使病毒颗粒浓度达到每毫升若干颗粒，以确保高感染率。根据实验目的，将细胞在含病毒颗粒的星形胶质细胞培养基中于37 °C培养24–36小时，随后进行第7节或第8节操作。
      注意：可使用不同的启动子来驱动转基因的表达（另见代表性结果）。组成型启动子（如 CMV、CAG）诱导转基因表达的时间早于可诱导型启动子；然而，这两类启动子均已成功用于将细胞重编程为神经元。
  4. DNA 质粒也可被导入星形胶质细胞 通过 如下所述进行DNA转染。
    注意：此步骤可在符合安全等级1（SL1）标准的生物安全柜中进行。
    1. 转染前，准备好转染试剂、含有目标构建物的质粒DNA、新鲜的星形胶质细胞培养基以及减血清培养基（参见 材料表）。计算所需血清减量培养基的量（参见 材料表) 考虑到24孔板的每孔需要300 µL的低血清培养基，将适量的低血清培养基加入50 mL离心管中，并预热至37 °C。
    2. 当无血清培养基温热后，吸出所有孔中的星形胶质细胞培养基，并收集至50 mL离心管中。使用0.45 µm注射器滤器过滤收集的星形胶质细胞培养基，以去除脱落的细胞。
    3. 向过滤后的培养基中加入等体积的新鲜星形胶质细胞培养基，以获得每孔可添加1 mL星形胶质细胞培养基的溶液。将星形胶质细胞条件培养基置于37 °C培养箱中保存至使用（步骤6.4.9）。
      注意：培养基被重复使用，因为它含有多种支持细胞存活的分泌因子。
    4. 向每个孔中加入300 µL预热的低血清培养基，将24孔板放回培养箱中。
    5. 配制溶液A，包含DNA和减血清培养基。每孔使用总量为0.6 µg的DNA，将其加入50 µL减血清培养基中。溶液A于室温保存，待用。
      注意：通常每个条件设置三个技术重复。因此，需配制足够进行3.5次反应的混合液（例如，将2.1 µg总DNA溶于175 µL低血清培养基中），以确保有足够的材料转染24孔板中的三个孔。
    6. 配制溶液B，由转染试剂和减血清培养基组成。每孔将0.75 µL转染试剂加入50 µL减血清培养基中。由于该溶液适用于所有转染条件，建议批量配制以减少不同转染之间的差异。
    7. 将溶液B在室温下孵育5分钟。以1:1的比例将溶液B逐滴加入溶液A中，轻轻混匀。切勿涡旋。将溶液A+B在室温下于通风橱中孵育20-30分钟。
    8. 对所有转染条件重复步骤6.4.5–6.4.7。20–30分钟后，将溶液A+B逐滴加入每孔，终体积为100 µL。轻轻摇动培养板，将细胞放回37 °C培养箱中孵育4小时。
    9. 孵育4小时后，移除转染培养基，加入1 mL 步骤6.4.3中制备的预温星形胶质细胞条件培养基。根据实验目的，继续培养细胞36–48小时，随后进行第7节或第8节的操作。

7. 星形胶质细胞重编程（7 天分析）

  1. 通过将1 mL B27添加剂加入49 mL基础培养基中制备神经元分化培养基（见步骤1.4）。根据细胞是否经过转导或转染（分别见步骤6.3和6.4），在24–48小时后，将每孔中的星形胶质细胞培养基更换为1 mL神经元分化培养基，并将细胞置于37 °C、9% CO₂条件下继续培养2.
    注意：细胞也可在5% CO₂条件下保存2 若无9% CO2 培养箱可用。然而，在这些条件下，神经元重编程的效率更高。
  2. 可选：为提高重编程效率，在将星形胶质细胞培养基更换为神经元分化培养基时，补充Forskolin（终浓度30 µM）和Dorsomorphin（终浓度1 µM）。若选择使用Forskolin和Dorsomorphin处理细胞，则在首次处理后2天追加一次Dorsomorphin，直接加入培养基中。
  3. 小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元细胞通常在换液后7天内发生。因此，在启动神经元重编程7天后，固定或收集细胞用于后续分析。

8. 星形胶质细胞重编程为成熟神经元（长期培养）

  1. 通过将1 mL B27补充剂加入49 mL基础培养基中（见步骤1.4）来制备神经元分化培养基。根据细胞是否经过转导或转染（分别见步骤6.3和6.4），在24–48小时后，将星形胶质细胞培养基更换为每孔1 mL含有Forskolin（终浓度30 µM）和Dorsomorphin（终浓度1 µM）的神经元分化培养基，并在37 °C、9% CO2条件下培养细胞。
    注意：若无9% CO2培养箱，也可在5% CO2条件下培养。但在该条件下，神经元重编程效率较低。
  2. 在初次处理后的第2天，通过直接将Dorsomorphin加入神经元分化培养基中，重复一次Dorsomorphin处理。
  3. 从神经元重编程开始第7天起，制备成熟培养基：将6 µL N2、1.2 µL NT3（储存液20 µg/mL）、1.2 µL BDNF（储存液20 µg/mL）、1.2 µL GDNF（储存液20 µg/mL）以及1.2 µL cAMP（储存液100 mM）加入189.2 µL神经元分化培养基中。向每孔现有的神经元分化培养基中添加200 µL成熟培养基。
    注意：成熟培养基仅在首次处理时添加。后续所有处理均按以下所述部分更换神经元分化培养基进行。
  4. 每周两次，通过移除200 µL神经元分化培养基并加入200 µL新鲜成熟培养基的方式重复小分子处理，持续最多6周。在成熟过程中，可于第21天或之后对细胞进行电生理实验，或固定细胞用于下游分析（如免疫荧光）。

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结果

星形胶质细胞的原代培养通常在经过MAC分选并接种后7至10天内达到80%–90%的融合度（图1B）。一般情况下，一个T25培养瓶可获得约1–1.5 × 106个细胞，足以在每孔接种密度为5–5.5 × 104个细胞时接种20–30个盖玻片。接种后第二天，细胞通常覆盖盖玻片表面的50%–60%（图1C）。在此阶段，培养物几乎完全由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型（如成神经细胞）几乎不存在（图1D）29。

重编程因子可递送至星形胶质细胞，方式包括 通过 逆转录病毒或慢病毒转导，或通过DNA质粒转染。通常，与转染相比，病毒转导可感染更多的细胞。由于直接神经元转化会导致大量细胞死亡34,35

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讨论

小鼠星形胶质细胞的原代培养是一种卓越的方法 体外 研究直接神经元重编程的模型系统。事实上，尽管这些细胞是在出生后阶段分离的，但仍表达典型的星形胶质细胞标志物29，保留模式形成基因的表达28,29，并保持增殖能力，类似于 体内 同龄的星形胶质细胞38经MACS分离后，细胞首先贴附于培养瓶，随后开始增殖，从而获得高度富集的星形胶质细胞培养物29重要的是，培养的星形胶质细胞不会去分化为多能细胞状态，也不会获得永生化特性。此外，在表达报告蛋白（如 DsRed 或 GFP）后，这些细胞不会自发产生神经元，而是维持星形胶质细胞的身份。同时，它们不会无限增殖，而是增殖速度逐渐减慢，并向更成熟的阶段过渡，从而降低其直接重编程为神经元的潜能。32,39

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Ines Mühlhahn在重编程载体构建方面的贡献，Paulina Chlebik在病毒制备方面的帮助，以及Magdalena Götz和Judith Fischer-Sternjak对本手稿提出的修改意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTALife Technologies25300054
4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI）Sigma-AldrichD9564
抗小鼠 IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
抗小鼠 IgG1 生物素SouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
抗小鼠 IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
抗兔 Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/Mount 封片剂PolysciencesCat# 18606-20
B27 添加剂Life Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
背侧形态发生素（Dorsomorphin）Sigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
胎牛血清PAN BiotechP30-3302
佛司可林（Forskolin）Sigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo 组织解离仪Miltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
葡萄糖Sigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000（转染试剂）Thermo FisherCat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µmMiltenyi Biotec130-098-462
MiniMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-102
小鼠抗 ACSA-2 MicroBead 试剂盒 Miltenyi Biotec130-097-678
小鼠 IgG1 抗突触素 1Synaptic SystemsCat# 101 011 RRID:AB_887824)
小鼠 IgG2b 抗 Tuj-1（βIII-微管蛋白）Sigma AldrichT8660
MS 柱Miltenyi Biotec130-042-201
N2 添加剂Life Technologies17502048
神经组织解离试剂盒 Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX（低血清培养基）Thermo FisherCat# 51985-026
青霉素/链霉素Life Technologies15140122
多聚-D-赖氨酸Sigma AldrichP1149
兔抗 RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
兔抗 Sox9Sigma-AldrichCat# AB5535; RRID:AB_2239761
链霉亲和素 Alexa 405Thermo FisherCat# S32351
曲拉通 X-100Sigma-AldrichCat# T9284

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