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方法文章

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型

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DOI：

10.3791/64216

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2022年8月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Centre for Advanced Imaging, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology and ARC Training Centre for Innovation in Biomedical Imaging Technology, The University of Queensland, 3School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 4Mater Research and Mater Research Institute, The University of Queensland, 5Pathology Queensland, Royal Brisbane Women's Hospital

通讯作者： Sunil R. Lakhani <s.lakhani@uq.edu.au>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。

摘要

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因之一。转移性疾病的某些关键方面，例如复杂的神经微环境以及基质细胞间的相互作用，无法完全通过 体外 检测方法；因此，动物模型对于研究和理解治疗干预的效果至关重要。然而，大多数脑肿瘤异种移植方法在时间框架和肿瘤负荷方面难以稳定地产生脑转移。通过心内注射癌细胞建立的脑转移模型可能导致非预期的颅外肿瘤负荷，进而引起非脑转移相关的发病和死亡。尽管颅内注射癌细胞可限制颅外肿瘤的形成，但该方法存在若干局限性，例如注射的细胞常在注射部位形成单一的肿瘤团块、软脑膜受累程度较高，以及针头穿刺过程中对脑血管系统的损伤。本实验方案描述了一种通过颈内动脉注射建立的小鼠脑转移模型。该方法能够稳定地产生颅内肿瘤，且不累及其他器官，可用于脑转移治疗药物的评估。

引言

脑转移是一种常见的恶性肿瘤，预后极差1,2。脑转移患者的治疗标准为多模式治疗，根据患者的一般健康状况、颅外疾病负荷以及脑内肿瘤的数量和位置，可包括神经外科手术、全脑放疗和/或立体定向放射外科治疗3,4。对于脑内病灶数量不超过三个的患者，可考虑手术切除或立体定向放射外科治疗；而对于多发性病灶的患者，则推荐采用全脑放疗，以避免手术相关感染和水肿的风险5。然而，全脑放疗可能对放射敏感的脑结构造成损伤，从而导致生活质量下降6。

全身治疗是一种非侵入性的合理方法，可用于治疗具有多发病灶的患者7然而，由于长期以来认为系统性治疗疗效较差，其原因是细胞毒性药物的被动递送 通过 血液中的药物无法在不产生不安全毒性的风险下达到脑内的治疗浓度8这一范式正随着近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准的全身治疗方案（图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨，用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌脑转移）而开始改变9,10,11,12 以及治疗指南的更新，将脑转移患者的全身治疗方案纳入考虑范围13,14.

在此背景下，分子靶向治疗、免疫治疗以及替代性药物递送系统（如靶向纳米药物载体）领域的进展，有望克服脑转移治疗所面临的挑战15,16,17,18此外，改善药物递送的化学与机械方法 通过 血脑肿瘤屏障的通透性增强方法也正在被研究19,20为了研究并优化这些方法以满足特定需求，至关重要的是采用不仅能够模拟脑转移的复杂生理特征，而且能够对颅内药物反应进行客观分析的临床前模型。

总体而言，目前建立脑转移模型的方法 体内 包括在小鼠体内进行心内（左心室）、静脉（通常为尾静脉）、颅内或颈动脉（颈总动脉）注射癌细胞21,22,23,24,25,26,27除了肿瘤移植策略外，通过敲除抑癌基因或激活癌基因来诱导肿瘤形成的基因工程小鼠模型也适用于肿瘤建模。然而，仅有少数基因工程小鼠模型被报道能够产生继发性肿瘤，能够稳定形成脑转移的模型则更为罕见。28,29,30.

通过心内（左心室）和静脉（通常为尾静脉）注射等移植方法可模拟癌症的全身性扩散。这些模型通常会在多个器官（如脑、肺、肝、肾、脾）中形成病灶，具体分布取决于循环过程中肿瘤细胞首次通过时被毛细血管床截留的主要部位31然而，脑内移植成功率的不一致性将需要使用更多的动物以达到所需统计效能的样本量。最终在脑内定植的肿瘤细胞数量 通过 这些心脏内和静脉注射方法的效果存在差异。因此，动物之间的脑转移肿瘤负荷可能有所不同，疾病进展的差异使得实验时间线的标准化和结果解读变得困难。颅外肿瘤负荷可能导致非脑转移相关的死亡，从而使这些模型不适合用于评估颅内治疗效果。已通过人工克隆筛选方法建立了具有脑趋向性的细胞系，以减少颅外定植，但定植率一直不稳定，且克隆筛选过程可能降低人类肿瘤中原本存在的异质性。32.

脑特异性移植方法，如颅内注射和颈动脉注射，可实现更稳定且高效的脑转移建模。在颅内注射法中33，通常将癌细胞注射至大脑额叶皮层，可快速、可重复地形成肿瘤，且全身受累较少。该操作耐受性良好，死亡率较低33需要注意的是，该方法是一种相对粗略的技术，可快速将细胞团块（局部）注入脑内，但无法模拟早期脑转移的发病过程。此外，针头会损伤脑组织中的血管系统，进而引发局部炎症反应。5,34根据经验，拔出针头时肿瘤细胞悬液容易发生反流，导致软脑膜受累。另一种方法是颈内动脉注射法，将细胞注入颈总动脉，使脑部微血管成为细胞首先到达的毛细血管床，从而模拟细胞在循环中的存活、血管外渗及定植过程。24. 与其他研究结果一致25，我们使用该方法的经验发现，由于意外递送癌细胞，可能导致面部肿瘤 通过 外部颈动脉至这些组织的毛细血管床（未发表数据）。可通过在颈总动脉注射前先行结扎外部颈动脉以预防面部肿瘤的发生。图1）。在本文其余部分，该方法被称为“颈内动脉注射”。根据经验，颈内动脉注射法能够稳定地建立脑转移模型，且全身性转移事件极少，已成功用于构建多种原发性癌症的脑转移模型（如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌）。图1其缺点在于技术难度高、耗时长、具有侵入性，且需要对细胞数量和监测时间线进行仔细优化。总之，颅内注射和颈内动脉注射两种方法均可建立适用于评估治疗手段对脑肿瘤相关生存获益影响的小鼠模型。

本方案描述了颈内动脉注射方法，用于建立几乎不涉及全身的脑转移小鼠模型，因此适用于实验性治疗药物的药物分布及疗效的临床前评估。

小鼠脑转移模型示意图；癌细胞注入颈内动脉；病理结果示明黑色素瘤、肺癌、乳腺癌脑转移。
图1：脑转移模型颈内动脉注射方案示意图。通过结扎颈外动脉并经颈内动脉注射，可稳定建立来源于多种原发性癌症的脑转移模型。在本方案中，颈总动脉上放置三个结扎线（图中标注为 L1-L3）。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会（UQCCR/186/19）以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》的指导下进行。

1. 注射用癌细胞的制备

注意：本研究使用了人乳腺癌细胞系 BT-474（BT474）。BT474 在完全培养基中培养，培养基成分为添加了 10% 胎牛血清和 1% 胰岛素的 RPMI 1640 培养基。细胞置于 37 °C、5% 二氧化碳空气环境的培养箱中维持培养。通过卫星串联重复序列检测对细胞系进行鉴定35，如有报告蛋白（例如荧光素酶）表达，需进行确认，并检测支原体污染情况。

  1. 将BT474癌细胞以2.0 × 106个细胞的接种密度接种于T75培养瓶中，加入10 mL完全培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合度达70%–80%，用于后续注射。
  2. 注射当天，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞单层两次。
  3. 加入5 mL预热的细胞培养解离试剂（见材料表），在37 °C孵育5分钟，或直至细胞脱落。5分钟后，轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。
  4. 加入5 mL含10%胎牛血清的完全培养基以中和解离试剂的活性。
  5. 用移液器轻柔吹打，重悬细胞，减少细胞团块。
  6. 将细胞悬液转移至50 mL离心管中，在室温下以180 × g离心3分钟。
  7. 弃去上清液，将细胞沉淀用10 mL不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）重悬，以尽量减少细胞聚集。
  8. 将细胞悬液在室温下以180 × g离心3分钟。
  9. 弃去上清液以去除残留的血清/解离试剂，并将细胞沉淀用3 mL HBSS重悬。
  10. 将100 µm细胞筛置于新的50 mL锥形离心管上，将细胞悬液过筛以去除细胞团块。
    注：单细胞悬液对于最小化注射时的血管阻塞和中风风险至关重要。
  11. 使用台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板，按照标准方法计算活细胞数量。
  12. 用HBSS将细胞悬液稀释至细胞浓度为2.5 × 106个细胞/mL。
  13. 将离心管水平放置于冰上，并定期轻柔摇动以减少细胞聚集。细胞悬液在冰上最多可保存6小时。
    ​注：摇动操作为手动完成，也可使用低转速摇床进行。

2. 实验小鼠的术前准备

注意：本研究使用4至5周龄的雌性NOD scid小鼠。在实验操作前3天为小鼠提供软质恢复饮食（例如饮食凝胶、水凝胶或捣碎的小鼠饲料），以促进操作后进食。

  1. 高压灭菌手术器械。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术区域和设备，随后用70%乙醇擦拭。
  2. 在手术板下方放置动物加热垫以防止低体温，术前30分钟开启加热。使用表面消毒剂喷洒并擦拭手术板，随后用70%乙醇喷洒并擦拭。
  3. 准备一个干净的动物饲养笼和一个用于恢复的温热加热垫。
  4. 穿戴干净的个人防护装备（防护服、口罩、发网和手套）。 在整个操作过程中，使用清洁的检查手套并采用“仅接触器械尖端”的技术以保持无菌状态。
  5. 使用含5%异氟烷和2 L/min氧气流速的麻醉舱对小鼠进行麻醉，直至小鼠失去足底反射。
  6. 将动物从舱室中取出，放入鼻罩中，以2 L/min的氧气流速持续输送2%异氟烷，用于后续手术操作。
  7. 用耳标法标记小鼠以用于识别，并使用电动剪毛器剃除颈部区域的毛发。用胶带清除暴露皮肤上的多余毛发。
  8. 称重小鼠以计算所需的麻醉药和镇痛药剂量。通过皮下注射给予每千克体重50 µg的丁丙诺啡和每千克体重1 mg的美洛昔康。
  9. 将小鼠转移至温暖的手术板上，并用胶带固定鼻罩。
  10. 涂抹眼用润滑剂以防止眼睛干燥。
  11. 用固定在手术板上的细线钩住小鼠的上门齿，然后固定其前肢和后肢，轻柔地固定小鼠。此步骤可伸展小鼠身体，并在操作过程中保持颈部平直。
  12. 按照以下步骤进行术前皮肤准备。
    1. 用局部消毒剂（聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物负荷并清除松散的毛发。从皮肤中心向外周清洁，以防止切口部位再次污染。使用70%乙醇重复该过程。交替进行三轮碘和乙醇消毒。
    2. 将手术巾覆盖在动物身上。手术巾由无菌纸巾或灭菌袋裁剪而成。
  13. 为手术器械准备无菌纸巾或 autoclave 袋。
  14. 检查反射 通过 在继续操作前，通过“夹捏试验”确认麻醉是否充分。

3. 颈内动脉注射

注意：本实验中使用了31 G输注套管和脚控注射泵装置以方便注射操作（补充图1）。该装置为可选配置，使用者也可采用31 G胰岛素注射器，并跳过步骤3.11和3.12。准备输注套管时，使用两把缝线钳将31 G针头的针体部分与注射器连接部分拉开并分离。随后，将针体部分连接至一段约10 cm长的细输注管的一端。

  1. 将解剖显微镜置于小鼠上方。
  2. 使用剪刀，从下颌下方5 mm处开始，沿颈部中线至胸廓入口，做一条15 mm长的纵向切口。
  3. 使用两对成角度的镊子分开皮肤及下方的唾液腺，并放置拉钩以保持气管暴露。下一步将暴露与气管平行的颈动脉鞘。
  4. 使用两把精细的弯头镊子，钝性分离气管旁的肌肉和脂肪组织，以暴露右侧颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、颈静脉和迷走神经的纤维层，可通过鲜红色的颈总动脉辨识该血管束。本研究中，注射操作在右侧颈总动脉进行。
  5. 在颈动脉分叉远端处，清除颈总动脉一段区域周围的筋膜，并将其与迷走神经和静脉分离。
  6. 分离并清除颈总动脉分叉处（连接颈外动脉和颈内动脉的交界部位）周围的神经和筋膜。将精细镊子置于颈外动脉下方，穿过一条丝线缝合线（5-0 规格），使其位于动脉下方。打结并收紧缝合线，剪除多余线头。
    注意：此结扎（L1）将阻止注入物通过颈外动脉流动。
  7. 将精细镊子置于颈总动脉下方，穿过一根丝线（5-0 规格）于动脉下方。打结并收紧丝线，结扎位置应位于预定注射部位的近端。剪去多余丝线，保留约 10 mm 线头。
    注意：第二根结扎线（L2）将在注射后限制血流和出血，同时用于在注射过程中固定和定位颈动脉。
  8. 剪取一条（已高压灭菌）低尘擦拭布并润湿（参见 材料表约10 mm × 5 mm。将条带折叠成4 mm × 5 mm、厚2-3 mm的尺寸，置于拟注射部位的颈动脉下方。这可在注射过程中支撑血管。
  9. 在预定注射部位的颈总动脉头端，用松结法结扎第三根缝线（L3）。该结仅在注射后（步骤 3.16）收紧。
  10. 轻轻振荡细胞悬液，用胰岛素注射器（带31 G针头）吸取200 µL细胞悬液。
  11. 将注射器装入与脚踏开关相连的注射泵中。
  12. 将带有31 G针头的细导管连接至注射器，并预充管路。
  13. 检查颈动脉是否位置良好并已加压。
  14. 使用两把精细的弯头镊子，一把轻轻牵拉第一根结扎线的末端，另一把夹住31 G针头，将针头斜面向上缓慢插入血管腔内，注意避免刺穿血管。
  15. 以10 µL/s的速度将100 µL细胞悬液（来自步骤1.13）缓慢注入颈总动脉。这将递送2.5 x 105 将细胞注入血管。成功的注射可通过观察到 通过 颈动脉血管中血液的清除。
  16. 轻轻提起并拉紧步骤3.9中留置的松散结扎线（L3），在拔出针头后立即操作，以防止回流和出血。剪除多余的缝线。
    注意：拔出针头后观察到少量血液喷出是正常现象。然而，在第三道结扎线收紧后，不得有任何活动性出血。
  17. 取下湿润的低絮一次性擦拭布。
  18. 使用 P200 移液枪，用 150–200 µL 无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。
  19. 再次检查有无出血，然后移除牵开器。
  20. 将软组织、唾液腺和皮肤重新覆盖于颈动脉和气管之上。
  21. 使用持针器、镊子和6/0单股可吸收或不可吸收缝线，以连续缝合方式闭合切口的皮肤层。
  22. 丢弃套管针注射器，并为下一只小鼠准备新的装置。使用新的注射器可确保每只小鼠注射的细胞数量一致。
    注意：该操作步骤的代表性截图位于 补充图2若血管被针头刺穿或撕裂，表现为注射液外漏或出血，则视为操作失败。此时必须撤出针头，并立即收紧第三道结扎线以防止进一步出血。若收紧缝线后仍持续出血，须使用戊巴比妥对动物实施安乐死。

4. 注射后恢复

  1. 注射布托啡诺（50 µg/kg）和美洛昔康（1 mg/kg） 通过 皮下注射作为术后镇痛。
  2. 将动物转移至温暖且洁净的笼子中，使其从麻醉中恢复。动物苏醒后活动减少（蜷缩不动或缓慢移动）属于正常现象。
  3. 30-45 分钟后，将小鼠转移至长期饲养设施。
  4. 术后至少一周内为小鼠提供软质饮食（饮食凝胶、水凝胶、糊状食物），并每日检查其身体状况，特别注意观察中风、感染及伤口周围出血等迹象。
  5. 术后两天，动物通常表现为活动减少、毛发轻度蓬乱，并丢失术前体重的15%。术后每日给予镇痛药（美洛昔康）1次，持续2–3天，以控制疼痛并促进恢复。
  6. 从第3天开始，动物应恢复活动，摄食和理毛频率增加，并开始恢复体重。若动物在术后4天后仍持续存在身体状况不良（如疼痛、蜷缩、无活动、体重减轻），应通过注射200 mg/kg戊巴比妥钠实施安乐死。 通过 腹腔注射
  7. 可使用麻醉及选定的成像方式（如生物发光成像、磁共振成像或正电子发射断层扫描/磁共振成像）监测肿瘤移植与进展。是否需要并能够开展此类成像，本质上取决于具体研究目标及实施场所的条件，同时也取决于所用细胞系的报告基因标签类型、相关放射性化学试剂的可及性以及核成像设施的配备情况。36,37
    注意：部分动物即使手术成功，也可能反应不佳并发生中风。术后若动物出现任何神经功能障碍症状（如头部偏向一侧、单侧牵拉、转圈行为、翻滚、剧烈挣扎、运动功能丧失），必须立即实施安乐死。

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结果

比较颈总动脉注射结扎与不结扎颈外动脉的方法
当癌细胞被注射时 通过 颈总动脉，但未先结扎颈外动脉24，移植小鼠中77.8%出现面部肿瘤（n = 7/9 只动物）。面部肿瘤的一个示例如图所示 补充图3本方案所述方法通过在结扎颈总动脉之前先结扎颈外动脉，以防止意外的面部转移。

为比较两种方法，将凝集素注入安乐死小鼠的颈总动脉，部分小鼠同时结扎颈外动脉。随后固定面部组织和脑组织，进行处理并在荧光显微镜下观察。免疫荧光分析显示，当颈外动脉被结扎时，颊部组织中的凝集素信号减少。图2A- B）。结果还显示，颈外动脉结扎并未影响物质向脑部的递送，因为在接受颈总动脉注射并同时进行颈外动脉结扎的小鼠脑组织中仍可观察到凝集素的存在。图2C- D）。因此，这一额...

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讨论

脑转移是癌细胞从原发部位扩散至大脑的复杂过程。目前已有多种动物模型可用于模拟这一多步骤过程的特定阶段，在设计临床前转移研究时需考虑生理学和实际操作因素。41,42大多数已发表的研究在探讨纳米医学用于脑转移治疗时，均采用了心内注射43,44 和颅内45,46,47,48,49 模型。移植癌细胞 通过 颈动脉可能更准确地重现转移过程及脑转移的病理生物学特征。

然而，根据经验，颈总动脉注射技术导致多只动物在早期出现明...

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披露

作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表论文方面均未发挥任何作用。

致谢

本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）资助，项目编号APP1162560。ML获得了昆士兰大学研究生研究奖学金的资助。我们谨向所有协助动物饲养工作的人员表示感谢 体内 对动物进行成像。我们感谢皇家布里斯班妇女医院为本研究捐赠了锆样品。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100µm 细胞滤筛CorningCLS431752
30G Microlance 针头BD23748
31G Ultra-Fine II 胰岛素注射器BD326103
弯头镊子ProscitechT67A-SS尖端细长、弯头无齿，尖端长度 18 mm，总长 128 mm
动物加热垫
抗生素与抗真菌剂ThermoFisher Scientific15240062
高压灭菌袋
BT-474 (HTB-20) 乳腺癌细胞系ATCCHTB-20
丁丙诺啡（TEMGESIC）
Countess 细胞计数仪ThermoFisher ScientificC10227
Diet-76A 饲料ClearH2O72-07-5022
解剖显微镜
耳标打孔器
电动剪毛器
精细弯头镊子ProscitechDEF11063-0745° 弯角，尖端光滑，尖端宽度：0.4 mm，尖端尺寸：0.4 × 0.3 mm，长度 9 cm
导管用细管，管外径（英寸）1/32，管内径（英寸）1/100Cole ParmerEW-06419-00
胎牛血清ThermoFisher Scientific26140079
无钙镁 Hank's 平衡盐溶液ThermoFisher Scientific14170120
水凝胶ClearH2O70-01-5022
异氟烷
Kimwipes 低尘一次性擦拭纸Kimberly Clark- KimwipesZ188964
研磨小鼠饲料
美洛昔康（METACAM）
鼻罩由微量离心管制成
PAA 眼科润滑剂（Carbomer 2 mg/g） Bausch and lomb
聚维酮碘溶液Betadine2505692
个人防护装备（手套、口罩、防护服、头帽）
牵开器Kent ScientificSURGI-5001
RPMI 1640 培养基ThermoFisher Scientific11875093
丝线缝合线 13 mm 5-0，P3，45 cmEthiconJJ-640G
无菌生理盐水ThermoFisher ScientificTM4469
粘性胶带
手术板用可高压灭菌袋包裹的切菜板
手术剪刀ProscitechT104尖端尺寸（长×宽）：38×7 mm，总长 115 mm
持针钳/弯头 Brophy 镊子ProscitechT113C弯曲、圆头窄尖 2 mm，带齿，长度 165 mm
缝合针持（Olsen Hegar 针持）ProscitechTC1322-180长度 190 mm，带棘轮夹
注射泵（带脚踏开关）/UMP3 超微量泵World Precision InstrumentsUMP3-3
T75 组织培养瓶ThermoFisher Scientific156499
缝合线
Trigene II 表面消毒剂Ceva
台盼蓝与细胞计数板载玻片ThermoFisher ScientificC10228
TrypLE Express 消化液ThermoFisher Scientific12605010

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