通过颈内动脉注射癌细胞模拟脑转移

脑转移是一种普遍的恶性肿瘤，预后非常差^1，2。脑转移患者的护理标准是多模式的，包括神经外科、全脑放疗和/或立体定向放射外科手术，具体取决于患者的一般健康状况、颅外疾病负担以及脑部肿瘤的数量和位置^3，4。最多 3 个颅内病变的患者适合手术切除或立体定向放射外科手术，而建议有多个病变的患者进行全脑放疗，以避免手术相关感染和水肿的风险⁵.然而，全脑放疗会对放射敏感的大脑结构造成损害，导致生活质量下降⁶。

全身治疗是治疗多发病变患者的非侵入性替代和合乎^{逻辑的方法7}。然而，由于长期以来认为全身治疗疗效不佳，因为通过血流被动递送细胞毒性药物无法在没有不安全毒性风险的情况下达到大脑中的治疗水平，因此较少考虑^8。随着最近美国食品和药物管理局（FDA）批准的全身治疗（图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨用于转移性HER2+乳腺癌脑^转移）9，¹⁰，11，12以及治疗指南的更新，包括考虑脑转移患者的全身治疗选择，这种范式开始改变^13，14。

在这种情况下，分子靶向治疗，免疫疗法和替代药物递送系统（例如靶向纳米药物载体）领域的发展可以潜在地克服脑转移治疗的挑战¹⁵，¹⁶，^17，18。此外，还正在研究通过脑肿瘤屏障透化来改善药物递送的化学和机械方法^19，20。为了研究和优化这些方法以适应目的，使用临床前模型至关重要，这些模型不仅反映了脑转移的复杂生理学，而且还允许对颅内药物反应进行客观分析。

从广义上讲，目前模拟体内脑转移的方法涉及心内（左心室），静脉内（通常是尾静脉），颅内或颈内（颈总动脉）注射小鼠的癌细胞²¹，^22，23，²⁴，²⁵，^26，27.除了肿瘤植入策略外，通过去除肿瘤抑制基因或激活癌基因触发肿瘤形成的基因工程小鼠模型可用于肿瘤建模。然而，据报道，只有少数基因工程小鼠模型产生继发性肿瘤，甚至更少可靠地产生脑转移瘤²⁸，^29，30。

植入方法，如心内（左心室）和静脉注射（通常是尾静脉）模仿癌症的全身播散。这些模型通常在多个器官（例如，脑、肺、肝、肾、脾脏）中产生病变，这取决于在循环"首次通过"期间捕获大多数肿瘤细胞的毛细血管床³¹。然而，不一致的脑植入率将需要更多的动物才能达到所需统计功效的样本量。通过这些心内和静脉注射方法 最终 在大脑中建立的肿瘤细胞数量是可变的。因此，脑转移肿瘤负荷可能因动物而异，进展的差异可能使标准化实验时间表和结果解释成为一项挑战。颅外肿瘤负荷可导致非脑转移死亡，使这些模型不适合评估颅内疗效。已经使用人工克隆选择过程建立了脑-热带细胞系以减少颅外建立，但摄取速率不一致，并且克隆选择过程可以降低通常在人类肿瘤中发现的异质性³²。

脑特异性植入方法，如颅内和颈内注射，可实现更一致和有效的脑转移建模。在颅内方法³³中，癌细胞通常被注射到额叶大脑皮层中，其产生快速且可重复的肿瘤生长，全身受累低。虽然该手术耐受性良好，死亡率低³³，但需要注意的是，这是一种相对粗糙的方法，可迅速在大脑中引入（局部）细胞推注，并且不能模拟早期脑转移发病机制。针头会破坏脑组织脉管系统，然后引起局部炎症^5，34。根据经验，在拔针过程中，肿瘤细胞注射有反流的趋势，导致软脑膜受累。或者，颈内方法将细胞输送到颈总动脉中，脑微脉管系统作为遇到的第一个毛细血管床，模拟循环、外渗和定植的存活率²⁴。与其他人^一致25，我们使用这种方法的经验发现，由于癌细胞通过颈外动脉 无意 中递送到这些组织中的毛细血管床，它可能导致面部肿瘤（未发表的数据）。通过在颈总动脉注射之前首先结扎颈外动脉可以预防面部肿瘤（图1）。在本文的其余部分，这种方法被称为"颈内动脉注射"。根据经验，颈内动脉注射方法始终如一地产生脑转移，全身性事件很少，并且已成功生成不同原发性癌症（例如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌）的脑转移模型（图 1）。缺点是它在技术上具有挑战性、耗时、侵入性强，并且需要仔细优化细胞数量和监测时间表。总之，颅内和颈内动脉注射方法都产生了适合评估对脑肿瘤相关生存益处的治疗影响的小鼠模型。

该协议描述了颈内动脉注射方法，以产生几乎没有全身参与的脑转移小鼠模型，因此适用于药物分布和实验疗法疗效的临床前评估。

图1:脑转移的颈内动脉注射方案示意图。 颈内动脉注射与颈外动脉结扎可以可靠地产生来自各种原发性癌症的脑转移模型。在该协议中，三个结扎放置在颈动脉上（图中注释为L1-L3）。 请点击此处查看此图的大图。

所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会（UQCCR/186/19）和澳大利亚科学动物护理和使用守则的指导方针下进行。

1.注射用癌细胞的制备

注意:在这项研究中，使用了人乳腺癌细胞系BT-474（BT474）。BT474在完全生长培养基中培养，该培养基含有补充有10%胎牛血清和1%胰岛素的RPMI 1640培养基。将细胞保持在37°C的培养箱中，空气中有5%的二氧化碳。通过卫星串联重复检测³⁵鉴定细胞系，确认报告蛋白（例如荧光素酶）的表达（如果有），并检查支原体感染。

1. 注射前，使用10mL完全生长培养基和培养物（在37°C下，5%CO 2）将接种密度为_2.0 x 10⁶个细胞的BT474癌细胞接种到T75烧瓶中至70%-80%汇合度。
2. 在注射当天，丢弃生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞单层两次。
3. 加入5mL预热的细胞培养解离试剂（参见 材料表），并在37°C下孵育5分钟或直到细胞分离。5分钟后，轻轻敲击烧瓶以帮助细胞分离。
4. 加入 5 mL 含有 10% 胎牛血清的完全生长培养基以淬灭解离试剂活性。
5. 通过移液轻轻重悬细胞以减少细胞团块。
6. 将细胞悬液转移到 50 mL 管中，并在室温下以 180 x g 离心 3 分钟。
7. 倒出上清液并将细胞沉淀重悬于不含钙和镁的 10 mL 汉克平衡盐溶液 （HBSS） 中，以尽量减少细胞结块。
8. 在室温下以180× g 离心细胞悬液3分钟。
9. 倒出上清液以除去残留的血清/解离试剂，并将细胞沉淀重悬于 3 mL HBSS 中。
10. 将 100 μm 细胞过滤器放在新鲜的 50 mL 锥形管上，并将细胞悬液通过以去除细胞团块。
    注意:单细胞悬液对于最大限度地减少血管闭塞和注射时中风的风险至关重要。
11. 使用台盼蓝排除和具有标准方法的血细胞计数器计算活细胞的数量。
12. 用HBSS将细胞悬液稀释至2.5 x 10⁶ 个细胞/ mL的细胞浓度。
13. 将管子水平放在冰上，并定期轻轻摇动管子以尽量减少结块。细胞悬液可以在冰上储存最多6小时。
    注意:摇摆是手动完成的，但也可以使用低转速的振动台来完成。

2.为该程序准备鼠标

注意:在这项研究中，使用了4-5周龄的雌性NOD scid小鼠。在手术前3天向小鼠引入软饮食恢复食物（例如，减肥凝胶，水凝胶，捣碎的小鼠食物），以鼓励手术后进食。

1. 高压灭菌手术工具。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术区域和设备，然后用70%乙醇。
2. 在手术板下方放置动物加热垫以防止体温过低。在手术前30分钟打开它。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术板，然后用70%乙醇。
3. 准备一个干净的动物笼子和一个温暖的加热垫以进行恢复。
4. 穿上干净的个人防护装备（防护服、口罩、发网和手套）。通过使用干净的检查手套和"仅器械尖端"技术，在整个过程中保持无菌。
5. 用麻醉室麻醉小鼠，使用5%异氟醚，氧气流量为2L / min，直到小鼠失去踏板反射。
6. 将动物从腔室中取出，并将其放入鼻锥中，以2 L / min的氧气流量提供2%异氟醚，用于剩余的外科手术。
7. 用于识别的打耳鼠标，并使用电动剪从颈部区域剃掉皮毛。用胶带清洁裸露皮肤上多余的毛发。
8. 称量小鼠以计算所需的麻醉和镇痛药物剂量。通过皮下注射分别以50μg/ kg和1mg / kg给予丁丙诺啡和美洛昔康。
9. 将鼠标转移到温暖的手术板上，并用胶带固定鼻锥。
10. 将眼部润滑剂涂抹在眼睛上以防止干燥。
11. 首先用粘在手术板上的线钩住上门牙，然后用胶带粘住前腿和后腿，轻轻地固定鼠标。这一步在手术过程中伸展身体并保持颈部伸直。
12. 进行术前皮肤准备，如下所述。
    1. 用局部消毒剂（聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物群落负荷并去除松散的毛发。从皮肤中心清洁，向外工作以防止切口部位再次污染。使用70%乙醇重复该过程。进行三轮碘和乙醇交替进行消毒。
    2. 在动物身上铺上手术布。这是从一块无菌纸巾或高压灭菌袋切割和成型的。
13. 摆放无菌纸巾或高压灭菌袋作为手术工具。
14. 在继续手术之前， 通过 "捏测"检查反射以确保充分麻醉。

3.颈内注射

注意:在该实验中，使用31 G输液插管和脚激活注射器驱动器设置来促进注射过程（补充图1）。此设置是可选的，用户可以使用 31 G 胰岛素注射器并跳过步骤 3.11 和 3.12。为了准备输液插管，使用两对缝合夹将针头部分与31 G针头的注射器接头部分拉动并分离。接下来，将针头部分连接到长度约为 10 cm 的细输液管的一端。

1. 将解剖显微镜放在鼠标上。
2. 用剪刀沿着颈部区域的中线做一个垂直的15毫米切口，从下颌下方5毫米开始到胸廓入口。
3. 使用两对倾斜的镊子，分开皮肤和下面的唾液腺，并应用牵开器以保持气管暴露。下一步将暴露与气管平行的颈动脉鞘。
4. 使用两对细角镊子，钝性地解剖气管附近的肌肉和脂肪组织，露出右颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、静脉和迷走神经的纤维层，该束可通过鲜红色的颈总动脉可见。在这项研究中，注射是在右颈动脉上进行的。
5. 清除颈总动脉尾部的一部分到周围筋膜的颈动脉分叉处，并将其与迷走神经和静脉分开。
6. 从周围神经和筋膜中分离并清除颈动脉分叉（连接颈外动脉和颈内动脉的连接处）。将细镊子放在颈外动脉下方，并在动脉下方通过丝线（5-0厚度）。打结并收紧缝合线并切断多余的线。
   注意:此结扎（L1）将防止注射液通过颈外动脉。
7. 将细钳放在颈总动脉下方，并在动脉下方通过丝线（5-0厚度）。打一个结，并在建议的注射部位附近的位置收紧缝合线。切开多余的缝合线，留下约10毫米的线。
   注意:第二次结扎（L2）将限制注射后的血流和出血。它还用于在注射过程中定位和保持颈动脉。
8. 切割并润湿一条（高压灭菌的）低绒毛一次性雨刷（见 材料表）约 10 毫米 x 5 毫米。将条带折叠成4毫米x 5毫米，2-3毫米厚，并将其放置在建议的注射部位的颈动脉下方。这将在注射过程中支撑容器。
9. 在拟议注射部位的颈总动脉口，放置第三个结扎（L3）。仅在注射后（在步骤3.16）拧紧。
10. 轻轻搅拌细胞悬液，并将 200 μL 细胞悬液吸入胰岛素注射器（用 31 G 针头）。
11. 将注射器装入连接到激活脚踏板的注射器驱动器中。
12. 用31 G针头将细插管连接到注射器上并灌注线。
13. 检查颈动脉位置是否良好并加压。
14. 使用两个细角镊子，一个轻轻张紧到第一个结扎的末端，另一个握住31 G针，慢慢地将带有斜面的针头插入血管腔，注意不要刺穿它。
15. 以 10 μL/s 的速度将 100 μL 细胞悬液（从步骤 1.13 开始）缓慢注入颈总动脉。这将把2.5 x 10⁵ 个细胞输送到血管中。通过清除颈动脉血管中的血液 来 可视化成功的注射。
16. 抽出针头后立即轻轻提起并收紧松散的结扎（L3）（从步骤3.9开始），以防止回流和出血。修剪多余的缝合线。
    注意:拔出针头后观察到少量血液喷出是正常的。但是，收紧第三个结扎后不得有任何活动性出血。
17. 取下一块湿润的低绒毛一次性雨刷器。
18. 使用 P200 移液器，用 150-200 μL 无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。
19. 再次检查出血，然后取下牵开器。
20. 将软组织、唾液腺和皮肤重新定位在颈动脉和气管上。
21. 使用缝合针支架，镊子和可吸收或不可吸收的6/0单丝缝合线以连续模式关闭切口的皮肤层。
22. 丢弃套管针头注射器并为下一个鼠标准备新的设置。使用新的注射器将确保注射到每只小鼠中的细胞数量是一致的。
    注意:该过程的代表性快照在 补充图2中。如果血管被针刺穿或撕裂，由注射液泄漏或出血表明，该过程被视为不成功。在此之后，必须拔出针头，并且必须立即收紧第三个结扎以防止进一步出血。如果在收紧缝合线后出血持续存在，则必须用戊巴比妥对动物实施安乐死。

4. 注射后恢复

1. 通过皮下注射 注射 丁丙诺啡（50μg/kg）和美洛昔康（1mg/kg）作为术后疼痛缓解。
2. 将动物移至温暖干净的笼子中以从麻醉中恢复。动物在醒来后活动受限（蜷缩和不活动或缓慢移动）是正常的。
3. 30-45分钟后，将小鼠转移到长期保持设施中。
4. 手术后至少一周为小鼠提供软饮食（减肥凝胶，水凝胶，醪液），并每天检查身体状况，特别注意伤口周围是否有中风，感染，出血的迹象。
5. 手术后两天，动物通常会活动减少，皮毛轻微褶皱，术前体重减轻 15%。手术后 2-3 天每天服用镇痛药（美洛昔康），以控制疼痛并帮助恢复。
6. 从第3天开始，动物必须恢复活动，增加喂养和梳理频率，并恢复体重。手术后 4 天通过腹腔注射 以 200 mg/kg 的戊巴比妥钠对身体状况持续缺陷（疼痛、蜷缩、不活动、体重减轻）的动物实施安乐死。
7. 肿瘤植入和进展可以使用麻醉和所选的成像方式（如生物发光成像、MRI 或 PET/MRI）进行监测。进行这种成像的要求和能力将取决于进行这种成像的单个项目目标和设施，并且取决于所用细胞系的报告标记类型、相关放射化学和核成像设施的可及性^36，37
   注意:尽管手术成功，但有些动物可能反应不佳并出现中风。手术后，出现任何神经痛苦症状（转头和拉向一侧，盘旋行为，滚动，捶打，运动功能丧失）的动物必须立即实施安乐死。

颈总动脉注射联合或不联合颈外动脉结扎术的比较
当通过颈总动脉 注射 癌细胞而不首先结扎颈外动脉24时，在77.8%的移植小鼠中发现了面部肿瘤（n = 7/9动物）。面部肿瘤的一个例子如 补充图3所示。本协议中描述的方法通过在颈总动脉之前结扎颈外动脉来防止意外的面部转移。

为了比较这两种方法，将凝集素注射到有或没有颈外动脉结扎的扑杀小鼠的颈总动脉中。然后，对面部组织和大脑进行固定、处理，并在荧光显微镜下观察。当颈外动脉结扎时，在脸颊组织中的免疫荧光分析中观察到凝集素减少（图2A-B）。结果还表明，颈外动脉结扎术不影响大脑递送，因为凝集素可以在接受颈总动脉注射和颈外动脉结扎的小鼠的脑组织中观察到（图2C-D）。因此，这个额外的步骤可以将癌细胞通过颈内动脉输送到大脑中，同时最大限度地减少对面部组织的播种。

图2:有和没有颈外动脉结扎的颈内移植物递送。将凝集素（绿色）输送到颈总动脉的小鼠右颊肌肉（A，B）和大脑（C，D）的荧光成像，无论是（A，C）还是没有（B，D）颈外结扎。脸颊和大脑以20倍和5倍放大倍率成像，比例尺分别代表50和200μm。细胞核（蓝色）用DAPI染色。请点击此处查看此图的大图。

生物发光监测
本研究使用HER2扩增的乳腺癌细胞系BT474进行基因改造以表达荧光素酶，通过施用荧光素并进行 体内 生物发光成像来每周监测肿瘤进展。在这个BT474脑转移模型中，可以从颈动脉内注射后的第5周观察到生物发光信号，并且随着时间的推移逐渐增加强度（图3）。

图3:生物发光信号的生物发光监测和定量。 从第 0 周到第 7 周的代表性每周生物发光图像显示来自头部的强度增加。该图显示了小鼠生物发光信号的量化。数据是标准误差 （n = 4） ±平均值。请点击此处查看此图的大图。

磁共振成像 （MRI）
在第 2、5 和 8 周使用 T2 加权 MRI 对脑转移动物模型进行成像，以评估颅内肿瘤进展。从第 5 周到第 8 周，可以观察到具有异质信号强度的区域，表明颅内肿瘤伴有复杂的液体灌注，可能来自肿瘤脉管系统中断（图 4A）。脑转移模型中的血脑屏障被破坏，类似于临床脑转移。使用钆对比度增强，然后进行T1加权MRI序列进行评估。肿瘤区域内的钆浓度随着钆从血液循环泄漏到肿瘤组织中而增加。这可以通过代表T1弛豫时间缩短的黑暗区域来说明（图4B）。获得的数据可用于将药物获取与血脑屏障通透性相关联。此外，通过使用3D Slicer图像分析软件进行体积分割，可以得出颅内肿瘤体积和表面积（图4C）。这可以绘制在与时间的关系图上，以跟踪脑肿瘤的生长。

图 4:使用磁共振成像表征脑转移动物 模型。 （A） 第 1、5 和 8 周模型的 T2 加权横向、冠状和矢状扫描。在第 5 周，矢状视图（红色箭头）上可以看到一个微弱的斑块状区域，到 8 周时进展为高信号和异质区域。（B）动态对比增强T1加权MRI显示注射钆对比增强（CE）剂前后的脑肿瘤（红色区域）。深色区域表明钆渗漏和摄取。（C）使用3D Slicer图像分析软件对冠状面，横向面和矢状面上可视化的肿瘤进行注释和分割，以得出颅内肿瘤体积。 请点击此处查看此图的大图。

PET/MR成像用于确定纳米医学的生物分布
通过增强的通透性和保留效果 ，破坏 的血脑屏障和渗漏的肿瘤脉管系统的组合促进了纳米级疗法的被动摄取和积累36，37。由于BT474脑转移模型过度表达HER2，因此使用正电子发射断层扫描/磁共振（PET / MR）成像进行了锆-89标记的HER2靶向纳米药物的大脑摄取（图5）。在一组BT474 BM小鼠中，肿瘤区域内检测到的纳米药物高于未受累脑区域，证实了脑转移瘤中纳米药物的积累。

图 5:BT474 脑转移小鼠中锆-89 标记的 HER2 靶向纳米药物 （89Zr-HER2-NM） 的代表性 PET/MR 图像。 （A）左图描绘了T2重量MRI（冠状视图），显示脑肿瘤（红色区域）和未受累的大脑（蓝色区域）。两个相邻的图像描绘了与PET叠加叠加的MRI图像（日冕和横向视图）。彩色PET覆盖显示，与未受累区域（蓝色/绿色）相比，肿瘤区域对纳米药物（白色，红色，黄色）的摄取更高。（B）该图说明了相对于未受累脑的脑肿瘤中PET信号强度和纳米药物摄取（每克注射剂量，ID / g）的增加（n = 12）。请点击此处查看此图的大图。

BM模型的生存和身体状况
BT474脑转移模型在注射后中位数存活了9周（图6）。随着脑转移的进展，动物开始减轻高达20%的体重，然后需要安乐死（在第6-9周之间）。在晚期脑转移瘤中，常见的表现包括皱皮和凸起和圆顶颅骨。这些动物通常不活动，蜷缩在一起，并且在运动技能和力量方面表现出功能缺陷。

图6:BT474脑转移小鼠模型的Kaplan Meier曲线。 中位生存期为注射后9周（n = 18）。 请点击此处查看此图的大图。

组织学
安乐死后，动物被灌注4%多聚甲醛溶液以保留脑组织学结构40。随后，对大脑和其他器官进行处理，切片并用苏木精和伊红（H&E）染色。在这个脑转移模型中，肿瘤是单侧定位的，与颈动脉注射的一侧相匹配（图7A）。BT474肿瘤主要表现为固体孤立肿块，在某些情况下几乎涉及大脑半球的一半（图7B）。经常观察到空隙的口袋，由坏死细胞组成（图7C）。一些动物中也存在较小的生长物（图7E）。免疫组织化学染色显示BT474脑转移表达强烈的HER2和HER3，表明该模型适用于HER2和HER3靶向治疗（图7F）。

图7:BT474脑转移模型的脑组织学。 （A）BT474 BM小鼠的代表性脑切片;彩色框标记了放大的感兴趣区域。比例尺= 2毫米。 （B）包含大量上皮样细胞的实体瘤。（C）空间内的坏死细胞。（D）肿瘤-脑界面（E）称为微转移的小生长。（B-E 比例尺 = 200 μm）。（F）免疫组织化学图像显示HER2和HER3阳性以及匹配的苏木精和伊红（H&E）。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。

全身性受累
在其他器官的组织切片中未观察到肿瘤（图8）。这一发现与生物发光数据一致，其中生物发光仅从动物的头部检测到。总之，结果表明该模型与未检测到的全身性肿瘤相关。

图8:其他器官的组织学。 筛查的器官中没有明显的肿瘤受累:骨、肝、肾、胰腺、肺、心脏、脾脏、肠道和卵巢。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。

补充图1:用于颈内动脉注射的套管注射器。请点击此处下载此文件。

补充图2:颈内动脉注射过程的快照。 补充 表 1 中提供了图像说明。 请点击此处下载此文件。

补充图3: T2加权MRI显示右侧面部组织中有一个大的肌内肿瘤 （红色轮廓）。H&E染色组织切片显示密集堆积的肿瘤细胞。比例尺 = 2 毫米（中心）和 100 微米（右）。 请点击此处下载此文件。

补充表1:补充图2中颈内动脉注射的分步说明。请点击此处下载此文件。

作者声明不存在利益冲突。资助者在研究的设计中没有作用;在数据的收集、分析或解释中;在手稿的撰写中，或在决定发表论文时。