脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。
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摘要
摘要
脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因之一。转移性疾病的某些关键方面，例如复杂的神经微环境以及基质细胞间的相互作用，无法完全通过 体外 检测方法；因此，动物模型对于研究和理解治疗干预的效果至关重要。然而，大多数脑肿瘤异种移植方法在时间框架和肿瘤负荷方面难以稳定地产生脑转移。通过心内注射癌细胞建立的脑转移模型可能导致非预期的颅外肿瘤负荷，进而引起非脑转移相关的发病和死亡。尽管颅内注射癌细胞可限制颅外肿瘤的形成，但该方法存在若干局限性，例如注射的细胞常在注射部位形成单一的肿瘤团块、软脑膜受累程度较高，以及针头穿刺过程中对脑血管系统的损伤。本实验方案描述了一种通过颈内动脉注射建立的小鼠脑转移模型。该方法能够稳定地产生颅内肿瘤，且不累及其他器官，可用于脑转移治疗药物的评估。
引言
脑转移是一种常见的恶性肿瘤，预后极差1,2。脑转移患者的治疗标准为多模式治疗，根据患者的一般健康状况、颅外疾病负荷以及脑内肿瘤的数量和位置，可包括神经外科手术、全脑放疗和/或立体定向放射外科治疗3,4。对于脑内病灶数量不超过三个的患者，可考虑手术切除或立体定向放射外科治疗；而对于多发性病灶的患者，则推荐采用全脑放疗，以避免手术相关感染和水肿的风险5。然而，全脑放疗可能对放射敏感的脑结构造成损伤，从而导致生活质量下降6。
全身治疗是一种非侵入性的合理方法，可用于治疗具有多发病灶的患者7然而，由于长期以来认为系统性治疗疗效较差，其原因是细胞毒性药物的被动递送 通过 血液中的药物无法在不产生不安全毒性的风险下达到脑内的治疗浓度8这一范式正随着近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准的全身治疗方案（图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨，用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌脑转移）而开始改变9,
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方案
所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会（UQCCR/186/19）以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》的指导下进行。
1. 注射用癌细胞的制备
注意：本研究使用了人乳腺癌细胞系 BT-474（BT474）。BT474 在完全培养基中培养，培养基成分为添加了 10% 胎牛血清和 1% 胰岛素的 RPMI 1640 培养基。细胞置于 37 °C、5% 二氧化碳空气环境的培养箱中维持培养。通过卫星串联重复序列检测对细胞系进行鉴定35，如有报告蛋白（例如荧光素酶）表达，需进行确认，并检测支原体污染情况。
- 将BT474癌细胞以2.0 × 106个细胞的接种密度接种于T75培养瓶中，加入10 mL完全培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合度达70%–80%，用于后续注射。
- 注射当天，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞单层两次。
- 加入5 mL预热的细胞培养解离试剂（见材料表），在37 °C孵育5分钟，或直至细胞脱落。5分钟后，轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。
- 加入5 mL含10%胎牛血清的完全培养基以中和解离试剂的活性。
- 用移液器轻柔吹打，重悬细胞....
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结果
比较颈总动脉注射结扎与不结扎颈外动脉的方法
当癌细胞被注射时 通过 颈总动脉，但未先结扎颈外动脉24，移植小鼠中77.8%出现面部肿瘤（n = 7/9 只动物）。面部肿瘤的一个示例如图所示 补充图3本方案所述方法通过在结扎颈总动脉之前先结扎颈外动脉，以防止意外的面部转移。
为比较两种方法，将凝集素注入安乐死小鼠的颈总动脉，部分小鼠同时结扎颈外动脉。随后固定面部组织和脑组织，进行处理并在荧光显微镜下观察。免疫荧光分析显示，当颈外动脉被结扎时，颊部组织中的凝集素信号减少。图2A- B）。结果还显示，颈外动脉结扎并未影响物质向脑部的递送，因为在接受颈总动脉注射并同时进行颈外动脉结扎的小鼠脑组织中仍可观察到凝集素的存在。图2C- D）。因此，这一额.......
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讨论
脑转移是癌细胞从原发部位扩散至大脑的复杂过程。目前已有多种动物模型可用于模拟这一多步骤过程的特定阶段，在设计临床前转移研究时需考虑生理学和实际操作因素。41,42大多数已发表的研究在探讨纳米医学用于脑转移治疗时，均采用了心内注射43,44 和颅内45,46,47,48,49 模型。移植癌细胞 通过 颈动脉可能更准确地重现转移过程及脑转移的病理生物学特征。
然而，根据经验，颈总动脉注射技术导致多只动物在早期出现明.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、论文撰写，以及决定发表论文方面均未发挥任何作用。
致谢
本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）资助，项目编号APP1162560。ML获得了昆士兰大学研究生研究奖学金的资助。我们谨向所有协助动物饲养工作的人员表示感谢 体内 对动物进行成像。我们感谢皇家布里斯班妇女医院为本研究捐赠了锆样品。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100µm 细胞滤筛 | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance 针头 | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II 胰岛素注射器 | BD | 326103 | |
| 弯头镊子 | Proscitech | T67A-SS | 尖端细长、弯头无齿，尖端长度 18 mm，总长 128 mm |
| 动物加热垫 | |||
| 抗生素与抗真菌剂 | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| 高压灭菌袋 | |||
| BT-474 (HTB-20) 乳腺癌细胞系 | ATCC | HTB-20 | |
| 丁丙诺啡（TEMGESIC） | |||
| Countess 细胞计数仪 | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A 饲料 | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| 解剖显微镜 | |||
| 耳标打孔器 | |||
| 电动剪毛器 | |||
| 精细弯头镊子 | Proscitech | DEF11063-07 | 45° 弯角，尖端光滑，尖端宽度：0.4 mm，尖端尺寸：0.4 × 0.3 mm，长度 9 cm |
| 导管用细管，管外径（英寸）1/32，管内径（英寸）1/100 | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| 无钙镁 Hank's 平衡盐溶液 | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| 水凝胶 | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| 异氟烷 | |||
| Kimwipes 低尘一次性擦拭纸 | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| 研磨小鼠饲料 | |||
| 美洛昔康（METACAM） | |||
| 鼻罩 | 由微量离心管制成 | ||
| PAA 眼科润滑剂（Carbomer 2 mg/g） | Bausch and lomb | ||
| 聚维酮碘溶液 | Betadine | 2505692 | |
| 个人防护装备（手套、口罩、防护服、头帽） | |||
| 牵开器 | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 培养基 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| 丝线缝合线 13 mm 5-0，P3，45 cm | Ethicon | JJ-640G | |
| 无菌生理盐水 | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| 粘性胶带 | |||
| 手术板 | 用可高压灭菌袋包裹的切菜板 | ||
| 手术剪刀 | Proscitech | T104 | 尖端尺寸（长×宽）：38×7 mm，总长 115 mm |
| 持针钳/弯头 Brophy 镊子 | Proscitech | T113C | 弯曲、圆头窄尖 2 mm，带齿，长度 165 mm |
| 缝合针持（Olsen Hegar 针持） | Proscitech | TC1322-180 | 长度 190 mm，带棘轮夹 |
| 注射泵（带脚踏开关）/UMP3 超微量泵 | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 组织培养瓶 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 缝合线 | |||
| Trigene II 表面消毒剂 | Ceva | ||
| 台盼蓝与细胞计数板载玻片 | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express 消化液 | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
参考文献
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S.
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重印与许可
