用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

摘要

在此工作中，一个 体外 采用重建方法在受控条件下研究肌动球蛋白凝胶的多孔弹性。通过量化肌动球蛋白凝胶及其嵌入溶剂的动力学行为，揭示了网络的多孔弹性特性。我们还讨论了实验中的挑战、常见误区及其与细胞骨架力学的相关性。

摘要

细胞能够主动改变其形状并获得运动能力，这一特性依赖于其内部结构的主动重组能力。该特性主要归因于细胞骨架，特别是肌动球蛋白细胞骨架所具有的力学与动态特性。肌动球蛋白细胞骨架是一种由极性肌动蛋白丝、肌球蛋白马达蛋白及辅助蛋白组成的活性凝胶，具有内在的收缩特性。通常认为，细胞骨架表现为一种黏弹性材料。然而，这一模型并不总能解释实验结果，而这些结果更符合将细胞骨架描述为一种多孔弹性活性材料——即嵌入细胞质溶胶的弹性网络。肌球蛋白马达产生的收缩力梯度驱动细胞质溶胶在凝胶孔隙中的流动，表明细胞骨架的力学特性与细胞质溶胶的流动动力学紧密耦合。多孔弹性的一个主要特征是网络中应力的扩散弛豫，其特征为一个有效扩散系数，该系数取决于凝胶的弹性模量、孔隙率以及细胞质溶胶（溶剂）的黏度。由于细胞具有多种调控其结构与材料特性的途径，目前对于细胞骨架力学与细胞质溶胶流动动力学如何耦合的理解仍然十分有限。本文介绍了一种 体外 采用重组方法来表征多孔弹性肌动球蛋白凝胶的材料特性，以此作为细胞骨架的模型系统。凝胶的收缩由肌球蛋白马达的收缩力驱动，从而引发渗透溶剂的流动。本文描述了此类凝胶的制备方法及实验操作流程，并讨论如何在局部和整体尺度上测量与分析溶剂流动和凝胶收缩。文中给出了用于数据量化的各种标度关系。最后，探讨了实验中的常见挑战与潜在误区，及其对细胞骨架力学研究的相关性。

引言

活细胞具有独特的力学特性。除了能够被动地响应外加力之外，它们还能主动产生力以应对外部刺激¹。这些特性在多种细胞过程中至关重要，尤其是在细胞运动期间，主要归因于细胞骨架的力学和动态特性，特别是肌动球蛋白细胞骨架。肌动球蛋白细胞骨架是由极性肌动蛋白丝、肌球蛋白分子马达以及辅助蛋白组成的活性凝胶。这些肌动球蛋白网络表现出由肌球蛋白马达蛋白驱动的内在自组织和收缩特性，肌球蛋白通过交联肌动蛋白丝并利用ATP水解提供的能量在网络中主动产生机械应力²。

已有大量实验和理论研究用于探究细胞骨架的材料特性³。目前普遍接受的观点是，细胞骨架表现出黏弹性材料的性质⁴。这意味着在较短的时间尺度上，细胞骨架表现为弹性材料；而在较长的时间尺度上，由于交联蛋白以及肌球蛋白马达的解离（和重新结合），网络结构能够动态更新，因而表现为黏性流体。然而在许多情况下，黏弹性模型无法解释实验结果，这些结果更符合一种将细胞骨架、更广义地说是细胞质，描述为一种具有活性的孔弹性材料的观点^5,6。这类材料具有两个主要特征。（i）第一个主要特征是由肌球蛋白马达驱动的收缩力梯度，引起细胞溶质（即"溶剂"）在凝胶....

方案

1. 玻璃表面处理与钝化：

注意：本节包括三个主要步骤（见图1）：(i) 清洗与亲水化处理，(ii) 硅烷化，以及 (iii) 表面钝化。

1. 清洗与亲水化
   1. 使用piranha溶液清洗玻璃表面。
      注意：piranha溶液由30% H₂O₂ 和70% H₂SO₄ 组成（材料表）。其主要目的是去除盖玻片表面的有机污染物，并暴露玻璃表面的羟基（OH）基团。通过此方式，玻璃表面变为亲水性。
   2. 将10–12片#1.5规格（22 mm × 22 mm）的玻璃盖玻片（材料表）放入自制的聚四氟乙烯支架中（底座面积：5.5 cm × 5.5 cm）。将该聚四氟乙烯支架转移至一个400 mL烧杯（材料表）中，并加入300 mL piranha溶液，于冰上并在通风橱中孵育2小时。
      注意：固定在支架底座上的聚四氟乙烯杆长12 cm，比烧杯（11 cm）更长，便于安全地将支架浸入或取出piranha溶液。由于piranha溶液仍可能具有高度反应性并产生大量热量，必须彻底终止反应。最简便的终止方法是将piranha溶液倒入（自来水）水中，实现至少50倍稀....

结果

每次实验使用两片玻璃盖玻片。玻璃盖玻片需经过清洗并用聚乙二醇（PEG）聚合物进行钝化处理。钝化对于防止可溶性蛋白质在实验早期阶段黏附于玻璃表面，以及最小化收缩网络与玻璃壁之间的相互作用至关重要。若钝化效果不佳，可能导致网络收缩效率低下，甚至在极端情况下抑制肌动蛋白网络的形成。

图1 描述了表面处理过程的三个主要步骤。这些步骤包括：（i）使用Piranha溶液进行表面清洗和亲水化处理，以去除盖玻片表面的有机污染物，并暴露玻璃表面的OH基团；（ii）使用（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane）进行表面硅烷化，旨在将硅烷共价结合到玻璃表面，使每个硅烷分子末端带有SH基团；（iii）用PEG聚合物（mPEG-mal，5 kDa）进行钝化处理——在此步骤中，PEG聚合物的马来酰亚胺基团与（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷上的SH基团发生共价反应，从而在玻璃表面形成一层PEG单分子层。

进行Piranha处理和硅烷化.......

讨论

本文采用一种体外方法，将多孔弹性肌动球蛋白凝胶作为细胞骨架的模型系统，更广义地说，也作为细胞质的模型系统进行力学特性表征，已有研究表明细胞质表现出多孔弹性材料的性质^3,5。细胞骨架（细胞质）的流变学特性可通过一个孔弹性扩散常数来描述，该常数决定了在施加机械应力后，细胞内胞质液体在细胞内重新分布所需的时间。已有研究提出，细胞可利用这一机制来调控其形态⁵。

受这些发现的启发，我们开发了一个用于研究多孔弹性力学的框架 体外利用所提出的模型系统，我们揭示了肌球蛋白收缩性如何促进流体流动的产生，以及网络速度与溶剂速度的方向性和速率在时间和空间上的相关性。由此，我们证明了网络结构与其嵌入的溶剂相互关联，不能被视为彼此独立的实体。我们描述了实验装置，并提供了凝胶制备及实验操作的详细方案。同时，本文还提出了数据定量分析的完整框架。所提出的分析框架可轻松适用于多种实验装置和系统中的多孔弹性研究，不受具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-巯丙基)三甲氧基硅烷	Sigma-Aldrich 公司	175617	在氩气氛围下储存于 4 °C
乙酸	Bio-Lab 有限公司	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	用 DMSO 稀释，在氩气氛围下储存于 -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	用 DMSO 稀释，在氩气氛围下储存于 -20 °C
BSA	Sigma-Aldrich 公司	A3059	储存于 4 °C
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich 公司	C9322	原装瓶在干燥环境（硅胶）中于 -20 °C 保存
盖玻片	Mezel-glaser	CG2222-1.5	经 Piranha 溶液处理后保存于 milliQ 水中，3 周内使用
肌酸激酶	Roche 生命科学产品	10736988001	用甘氨酸缓冲液新鲜配制，置于冰上，3 天内使用。  原装瓶在干燥环境（硅胶）中于 4 °C 保存
磷酸肌酸	Roche 生命科学产品	10621714001	溶解后应于 -20 °C 保存，3 个月内使用。原装瓶在氩气氛围下于 4 °C 保存
DTT	Roche 生命科学产品	10708984001	溶解后应于 -20 °C 保存，3 个月内使用
双通道同步成像系统	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD 相机	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD 相机	Photometrics	Evolve Delta
乙醇	Bio-Lab 有限公司	525050300
荧光灯	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG 微球	Polysciences	17151-10	直径 200 nm
葡萄糖	ICN Biomedicals Inc	194024	溶解后应于 -20 °C 保存，3 个月内使用。
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich 公司	G7141	保存于 -20 °C，3 个月内使用。原装粉末在氩气氛围下于 -20 °C 保存
甘油	ICN Biomedicals Inc	800687
甘氨酸	MP Biomedicals	808822
过氧化氢	Sigma-Aldrich 公司	216763	储存于 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
甲醇	Bio-Lab 有限公司	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
显微镜	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	分子量 = 5000 Da。按重量分装成小批次。在氩气氛围下于 -20 °C 保存
尼罗红微球	Spherotech	FP-2056-2	直径 2300 nm
物镜 (10x)	Leica 德国	HC PL AP0	UPlanFL 数值孔径 = 0.3
物镜 (2.5x)	Leica 德国	506304	Plan-NEOFLUAR 数值孔径 = 0.075
烘箱	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS 缓冲液	Sigma-Aldrich 公司	P4417
快门驱动器	Vincet Associates	VMM D1
硅胶	Merck	1.01907.5000
超声仪	Elma	Elmasonic P
硫酸	Carlo Erba 试剂	410301
DV2 双通道同步成像系统	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
紫外-可见分光光度计	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 μL
MATLAB R2017b	MathWorks		数据量化
MetaMorph	Molecular Devices		光学成像系统的控制软件；数据量化（颗粒追踪分析、网络网格尺寸）