Method Article

多孔设备固体培养基上分离秀 丽隐杆线虫 的长期培养和监测

DOI:

10.3791/64681

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December 9th, 2022

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

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这里介绍的是一种优化的方案，用于在微加工多孔设备中的固体培养基上培养分离的单个线虫。这种方法允许在个体动物的一生中监测与衰老和健康相关的各种表型，包括活动、体型和形状、运动几何形状和存活率。

Abstract

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线虫秀 丽隐杆线虫 是衰老研究中最常用的模型系统之一，因为它的培养技术简单且便宜，繁殖周期快（~3天），寿命短（~3周），以及许多可用的遗传操作和分子分析工具。在 秀丽隐杆线虫中进行衰老研究的最常见方法（包括生存分析）涉及在培养皿中的固体线虫生长培养基（NGM）上一起培养数十至数百只动物的种群。虽然这种方法收集了动物种群的数据，但大多数协议不会随着时间的推移跟踪个体动物。这里介绍的是在称为WorMotels的微加工聚二甲基硅氧烷（PDMS）设备上长期培养个体动物的优化方案。每个装置允许在含有NGM的小孔中培养多达240只动物，每个孔由含硫酸铜的护城河隔离，以防止动物逃跑。本文以原始 WorMotel 描述为基础，提供了用于成型、准备和填充每个设备的详细协议，并描述了常见的技术复杂性和故障排除建议。在该协议中，有用于一致加载小容量NGM的技术，NGM和细菌食品的一致干燥，提供药物干预的选项，重复使用PDMS设备的说明和实际限制，以及即使在低湿度环境中也能最大限度地减少干燥的技巧。该技术允许在类似于培养皿中固体培养基上群体培养的标准技术的环境中纵向监测各种生理参数，包括刺激活动、未刺激活动、体型、运动几何形状、健康跨度和生存。当与自动显微镜和分析软件结合使用时，该方法与高通量数据收集兼容。最后，讨论了该技术的局限性，并将该方法与最近开发的方法进行了比较，该方法使用微托盘在固体培养基上培养分离的线虫。

Introduction

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秀丽隐杆线虫 通常用于衰老研究，因为它们的生成时间短（约3天），寿命短（约3周），易于在实验室中培养，与哺乳动物的分子过程和途径的高度进化保守，以及遗传操作技术的广泛可用性。在衰老研究的背景下， 秀丽隐杆线虫 允许快速生成长寿数据和老年人口，以分析活体动物的晚年表型。进行蠕虫老化研究的典型方法包括在6cm培养皿1中手动测量固体琼脂线虫生长培养基（NGM）上以20至70只动物为一组的蠕虫群的寿命。使用年龄同步的种群可以测量整个种群中个体动物的寿命或横截面表型，但这种方法排除了随着时间的推移监测个体动物的特征。这种方法也是劳动密集型的，因此限制了可以测试的人口规模。

允许在秀丽隐杆线虫的整个生命周期中纵向监测的培养方法数量有限，每种方法都有一系列独特的优点和缺点。微流体设备，包括WormFarm2，NemaLife3和"行为"芯片4，以及5，6，7，允许随着时间的推移监测个体动物。使用多孔板在液体培养物中培养蠕虫同样允许随着时间的推移监测单个动物或少量秀丽隐杆线虫种群8，9。液体环境代表了与培养皿中固体培养基上的常见培养环境不同的环境背景，这可以改变与衰老相关的动物生理学方面，包括脂肪含量和应激反应基因的表达10，11。将这些研究与收集的大多数关于老年秀丽隐杆线虫的数据直接进行比较的能力受到潜在重要环境变量差异的限制。蠕虫畜栏12是一种在更接近于复制典型固体培养基培养物的环境中容纳个体动物的方法。蠕虫畜栏在使用水凝胶的显微镜载玻片上为每只动物包含一个密封室，可以对孤立的动物进行纵向监测。该方法使用标准明场成像来记录形态数据，例如体型和活动。然而，动物作为胚胎被放置在水凝胶环境中，在那里它们在整个生命周期中不受干扰。这需要使用有条件的无菌突变体或转基因遗传背景，这既限制了遗传筛选的能力，因为每个新的突变或转基因都需要杂交到具有条件不育的背景中，以及药物筛选的能力，因为治疗只能作为胚胎应用于动物一次。

Fang-Yen实验室开发的另一种方法允许在称为WorMotel13，14的微加工聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的单个孔中的固体培养基上培养蠕虫。每个装置都放置在单孔托盘中（即，尺寸与96孔板相同），并具有240个孔，由充满厌恶溶液的护城河隔开，以防止蠕虫在孔之间移动。每口井在其生命周期内可以容纳一个蠕虫。该设备被吸水聚丙烯酰胺凝胶颗粒（称为"水晶体"）包围，托盘用石蜡膜实验室薄膜密封，以保持湿度并最大限度地减少介质的干燥。该系统允许收集个体动物的健康寿命和寿命数据，而固体培养基的使用可以更好地概括绝大多数已发表的 秀丽隐杆线虫 寿命研究中动物所经历的环境，从而允许更直接的比较。最近，已经使用最初用于微细胞毒性测定15 的聚苯乙烯微托盘代替PDMS装置16开发了类似的技术。微托盘方法允许收集在固体培养基上培养的蠕虫的个性化数据，并提高了在通常会导致逃跑的条件下（例如，压力源或饮食限制）容纳蠕虫的能力，权衡是每个微托盘只能包含96只动物16，而这里使用的多孔装置最多可以容纳240只动物。

这里介绍的是用于制备多孔设备的详细方案，该方案针对板对板的一致性和并行制备多个设备进行了优化。该协议改编自方颜实验室13的原始协议。具体来说，有关于最小化污染、优化固体培养基和细菌食物源的一致干燥以及输送RNAi和药物的技术的描述。该系统可用于跟踪个人健康寿命、寿命和其他表型，例如体型和形状。这些多孔设备与现有的高通量系统兼容，可以测量寿命，这可以消除传统寿命实验中涉及的大部分体力劳动，并为大规模对单个 秀丽隐杆线虫 进行自动化、直接的寿命测量和健康跟踪提供机会。

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Protocol

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1. 储备溶液和培养基的制备

注意:在开始制备多孔设备之前，请准备以下储备溶液和培养基。

  1. 线虫生长培养基 （NGM） 和低熔点 NGM （lmNGM） 的储备溶液:
    1. 准备 1 M K 2 HPO4:将 174.18 gK 2HPO4 加入1 L 瓶中，并用无菌去离子水填充至 1 L。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并在室温（RT）下储存。
    2. 准备 1 M KPi，pH 6.0:将 136.09 g KH2HPO4 加入 1 L 瓶中，并用无菌去离子水填充至 1 L。用 1 M K2HPO4 滴定至 pH 6.0。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并储存在室温下。
    3. 准备 1 M CaCl 2:将 73.5 g CaCl2 加入 500 mL 瓶中，并用无菌去离子水填充至 500 mL。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并储存在室温下。
    4. 准备 1 M MgSO 4:将 123.25 g MgSO4 加入 500 mL 瓶中，并用无菌去离子水填充至 500 mL。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并储存在室温下。
    5. 准备 5 毫克/毫升胆固醇:将 2.5 克胆固醇、275 毫升 100% 乙醇和 25 毫升无菌去离子水混合在 500 毫升琥珀色瓶中。存放在RT。
    6. 准备 50 mM 氟尿苷:将 0.1231 g 氟尿苷和 10 mL 无菌去离子水混合在 15 mL 锥形管中。使用10 mL注射器用0.22μm过滤器对其进行过滤灭菌。将每个1mL分装到10个微量离心管中，并将其储存在-20°C。
    7. 准备 50 mg/mL 羧苄青霉素:在 15 mL 锥形管中，将 500 mg 羧苄青霉素与 10 mL 无菌去离子水混合。使用10 mL注射器用0.22μm过滤器对其进行过滤灭菌。将每个1mL分装到10个微量离心管中，并将其储存在-20°C。
    8. 制备 1 mM 异丙基 ß-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）:在 15 mL 锥形管中，将 2.38 g IPTG 与 10 mL 无菌去离子水混合。使用10 mL注射器用0.22μm过滤器对其进行过滤灭菌。将每个1mL分装到10个微量离心管中，并将其储存在-20°C。
    9. 准备 100 mg/mL 氨苄青霉素:在 15 mL 锥形管中，将 1 g 氨苄西林与 10 mL 无菌去离子水混合。使用10 mL注射器用0.22μm过滤器对其进行过滤灭菌。将每个1mL分装到10个微量离心管中，并将其储存在-20°C。
  2. 制备线虫生长培养基（NGM）用于一般 秀丽隐杆线虫 维护
    1. 要制作 50 个板，请在 1 L 烧瓶中混合 10 g 杆菌琼脂、1.5 g NaCl、1.25 g 杆菌蛋白胨和 486 mL 超纯水。在液体循环（121°C，15psig）上高压灭菌至少30分钟以灭菌。
    2. 高压灭菌后，在培养基冷却至 55 °C 后，加入 12.5 mL 的 1 M KPi、500 μL 的 1 M MgSO4、500 μL 的 1 M CaCl2 和 500 μL 的 5 mg/mL 胆固醇。
    3. 使用无菌技术，将 10 mL 培养基倒入每个 60 mm 板（共 50 个）中。培养基凝固后（倒入后至少30分钟），将300μL细菌培养物（根据步骤4和步骤10制备）移液到板的中心。将板放在工作台上，让细菌培养物干燥并变厚（1-2天）。将板储存在4°C。
  3. 制备低熔点线虫生长培养基 （lmNGM） 预混合物:
    1. 在 500 mL 烧瓶中，混合 4 g 低熔点琼脂糖、0.5 g 杆菌蛋白胨和 195 mL 超纯水。在液体循环（121°C，15psig）上高压灭菌至少30分钟以灭菌。
    2. 当培养基仍熔融时，将 10 mL 等分试样分配到无菌玻璃试管中。用封口膜密封每个试管，然后用试管盖密封，以保存lmNGM预混合物并防止干燥。培养基会凝固，使用前可在室温下储存~2周。
  4. 准备 142.8 mM NaCl:在 250 mL 瓶中，混合 0.8345 g NaCl 和 100 mL 无菌去离子水。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并储存在室温下。
  5. 准备洗涤剂溶液:在 15 mL 锥形管中，混合 3 mL 吐温 20 和 7 mL 无菌去离子水。充分混合，使用10mL注射器用0.22μm过滤器过滤灭菌，并储存在室温下。
  6. 制备硫酸铜溶液:在无菌 50 mL 瓶中，混合 20 mL 无菌去离子水、0.5 g CuSO4 和 100 μL 洗涤剂溶液（在步骤 1.5 中制备）。混合直至CuSO4 溶解。存放在RT。
  7. 制备吸水聚丙烯酰胺晶体:在高压灭菌器安全的挤压瓶中，混合 150 mL 去离子水和 1 g S 型高吸水性聚合物。将瓶子倒置几次，轻轻混合。在液体循环（121°C，15psig）上高压灭菌至少20分钟，并储存在室温下。
  8. 准备溶原肉汤（LB）:在1升或更大的烧杯中，将20克LB粉末与1升去离子水混合。分装到两个 500 mL 烧杯中。高压灭菌器（121°C，15psig）30分钟，并储存在室温下
  9. 准备溶原肉汤（LB）琼脂平板:
    1. 在 1 L 烧瓶中，混合 10 g LB 粉末、7.5 g 杆菌琼脂和 500 mL 去离子水。在液体循环（121°C，15psig）上高压灭菌30分钟。
    2. 如果需要，添加可选的抗生素（高压灭菌后，培养基冷却至 55 °C 后）:500 μL 100 mg/mL 氨苄西林。使用无菌技术，将20mL培养基倒入每个100mm板（总共25个）中，并储存在4°C。

2.打印3D多孔设备模具

注意:每个设备都是使用定制的3D打印模具从PDMS模制而成的。单个模具可以根据需要生产任意数量的设备;但是，如果尝试同时准备多个设备，则需要一个3D打印模具才能并行制作每个设备。

  1. 下载 STL 文件（请参阅 补充文件 1）。
  2. 使用高分辨率3D打印机打印模具。
    注:打印机的分辨率必须足够高，以允许一致的井和护城河体积。建议的打印机分辨率为~40μm的最小XY分辨率和28μm的层分辨率。3D打印机使用的材料同样重要，因为许多材料类型会阻止PDMS固化。根据经验，使用Vero Black打印材料的高分辨率PolyJet打印机（分辨率:X轴= 600 dpi，Y轴= 600 dpi，Z轴= 1，600 dpi）生产的模具始终如一。本研究中使用的模具的3D打印是外包的（打印细节可以在 材料表中找到）。

3. 多孔装置的制备

注意:本节介绍如何使用3D打印模具创建PDMS多孔设备。

  1. 将固化炉设置为55°C以允许预热。
  2. 确定要准备的设备数量。对于每个设备，使用一次性刮刀将 60 g PDMS 基料和 6 g 固化剂混合在大型一次性称重船（或类似的一次性容器）中。
  3. 将PDMS混合物置于真空室中，以-0.08MPa的速度放置30分钟以除去气泡。
  4. 将PDMS混合物倒入每个3D打印模具中。完全填充模具，PDMS混合物略高于模具顶部。保留多余的PDMS混合物以重新填充模具，以防溢出。
  5. 将填充的模具和任何额外的PDMS混合物以-0.08MPa放入真空室中25分钟，以去除浇注过程中产生的任何气泡。
  6. 从真空室中取出填充的模具，然后用一次性刮刀弹出任何剩余的气泡。使用刮刀将任何可见的碎屑或残留的气泡刷到模具边缘，远离孔。任何残留的碎屑或气泡都可能会干扰后续步骤中的成像。
  7. 确保模具完全填充PDMS混合物;一小部分混合物在真空室中或转移过程中溢出是很常见的。使用在步骤3.5中脱气的额外PDMS混合物重新填充。这不应该产生气泡，但如果有任何气泡形成，可以用刮刀轻轻地将它们刷到模具的侧面。
  8. 首先放置一个边缘并缓慢降低另一个边缘，直到丙烯酸平放在模具顶部，置换延伸到边缘上方的任何PDMS混合物，将扁平的亚克力板放在PDMS填充模具的顶部。如果在放置亚克力板时形成气泡，请慢慢取出亚克力，如果需要，用PDMS混合物重新填充模具，然后重新开始放置亚克力。亚克力板将为模制设备形成平底，并确保所有孔相对于底座处于同一水平。
  9. 将 2.5 磅的重量放在丙烯酸的顶部。可以堆叠多个模具，每个模具都有一个单独的亚克力板。将加重的模具放入烤箱中，让它们在55°C下固化过夜。
  10. 第二天，从烤箱中取出重物和模具。
  11. 小心地在丙烯酸和固化的PDMS之间使用剃须刀片以破坏密封。小心地从模具顶部取出丙烯酸。此时PDMS已经设置好，去除丙烯酸可能需要一些力量。
  12. 使用剃须刀或金属刮刀，小心地从模具上松开固化PDMS的侧面。在这个阶段很容易撕裂PDMS;在边缘缓慢而轻柔地工作，以完整地取出 PDMS 设备。
    注意:新打印的模具在前三种用途中特别粘，PDMS 在尝试取出设备时经常撕裂。随着用途的增加，从模具中去除固化的PDMS变得更加容易。
  13. 用铝箔包裹设备，并用高压灭菌胶带密封。在121°C下干循环高压灭菌至少15分钟，15psig灭菌。高压灭菌后，将包裹的设备存放在工作台上，并根据需要使用它们。

4. 划线细菌

注意:开始准备将在多孔设备上用作蠕虫食物来源的细菌。最常见的细菌是 大肠杆菌 菌株OP50（或用于RNAi实验的菌株HT115）。在将蠕虫添加到设备之前至少 2 天完成此步骤。

  1. 将细菌划线到新鲜的LB板上。确保LB板中包含任何菌株特异性选择性添加剂（例如，氨苄西林以选择赋予氨苄青霉素对细菌抗性的质粒）。
  2. 将板在37°C孵育过夜（~18小时）以使菌落生长。

5. 培养基加载多孔装置的制备

注意:构成设备的有机硅PDMS材料的表面是疏水的，这可以防止小体积的井和厌恶的护城河分别充满NGM和硫酸铜。为了解决这个问题，使用氧等离子体暂时改变装置的表面特性，使其具有亲水性，允许在有限的时间窗口（最多~2小时）内填充孔和护城河。本节列出了完成等离子清洗过程的步骤。在用细菌发现设备孔之前至少 1 天完成此步骤，因为等离子清洁的挥之不去的效果会干扰点样。考虑到第 5-7 节的时间安排，每个技术人员这些步骤的实际限制是三个设备并行。

  1. 将干珠浴培养箱预热至90°C，以准备第6节。
  2. 由于与培养皿相比，填充多孔装置孔所需的总培养基体积较小，因此请制备大量NGM，并将其等分到试管中（参见步骤1.3）。
    注意:这可以提前完成，因为培养基管可以在工作台上存放~2周。如果培养基已制备并等分到试管中，请继续执行步骤5.3。
  3. 戴手套时，打开高压灭菌的多孔装置;避免触摸任何井。在设备的右上角切一个小凹口，以指示其已被使用/重复使用的次数（有关清洁和重复使用每个设备的说明和建议，请参阅下面的第 15 节）。
  4. 将最多三个未包装的设备放入等离子清洁器中，孔朝上。运行等离子清洁器。
    注:以下详细说明适用于等离子刻蚀PE-50等离子清洗机。具体步骤和设置需要调整，并可能针对其他等离子清洗机进行重新优化。
    1. 检查等离子清洗机功率水平是否设置为 75%。
    2. 确保排气阀和隔离阀都处于 OFF 位置。
    3. 打开氧气罐上的主阀。等到调压阀压力降至 15 psig 和 20 psig 之间，然后将隔离阀转到 ON 位置。
    4. 打开真空泵和等离子清洁器。
    5. 在等离子清洗机上输入以下设置（首次使用），或验证先前编程的设置是否正确:
      等离子时间:3:00分钟
      真空设定点:149.5 mTorr
      大气通风口:45 s
      吹扫通风口:5 s
      气体稳定:15 s
      真空报警:3:00 分钟
      自动关机:开
    6. 按 回车 键转到 命令菜单。使用 向右键 选择 "设置菜单"，然后按 Enter。滚动浏览所有设置，方法是按 Enter 确认每个当前设置，然后按 向右键 移动到下一个设置。
    7. 返回 命令菜单 ，按 向上 箭头，然后按 向左箭头。
    8. 在"命令菜单"屏幕上，按 Enter。通过按回车键选择命令 PLASMA。系统将循环经历以下阶段:
      等离子泵送
      气体稳定:在此阶段，调整等离子清洁器上的 气体 1 旋钮，直到流量计达到 10 cc/min。
      等离子体时间
      吹扫抽空
      等离子循环完成
      腔室通风口
      注意:此过程大约需要 5-10 分钟才能完成。完成所有阶段后， 命令菜单 将再次显示在屏幕上。如果在等离子 体抽空 阶段，压力不够低，等离子清洁器将不会进入下一阶段，并且屏幕将显示错误消息。如果发生这种情况，请检查真空泵油。如果油位低或油浑浊/脏污，更换油可以使真空压力达到必要的水平。
    9. 关闭氧气罐上的主阀。
    10. 非常缓慢地将排气阀转到 ON 位置，并让氧气罐的调节器压力恢复为零。
    11. 将隔离阀转到 OFF 位置。
    12. 关闭真空泵和等离子清洁器。
      注意:等离子清洗器对多孔装置的亲水表面改性是暂时的，并且随着时间的推移（最多约2小时）逐渐变得不那么有效。尽快完成第 6 节和第 7 节。

6. 用 lmNGM 填充孔

注意:干珠浴培养箱应打开并从步骤5.1开始预热。确保浴液已达到90°C。

  1. 通过用 70% 乙醇喷洒托盘内部并用任务擦拭将其擦干，对每个设备一个单孔聚苯乙烯托盘进行消毒。
  2. 用戴手套的手从等离子清洁器中取出每个设备，然后将其放入清洁的托盘中。
  3. 将25mL一次性移液器盆加热至90°C后，将其放入珠浴培养箱中。
  4. 每个要填充的设备收集一管固化的lmNGM预混合物（参见步骤1.3）。
  5. 将 lmNGM 预混合试管放入 200 mL 玻璃烧杯中，取下盖子和封口膜。微波~20秒，直到介质充分融化以倒入（在此阶段存在一些固体介质是好的）。
  6. 将来自多个试管的熔融 lmNGM 预混合物混合到另一个无菌 200 mL 烧杯中。继续微波20秒，总共达到40秒。如果 lmNGM 预混合物开始沸腾，请停止微波，让 lmNGM 预混合物沉降，然后再继续。
  7. 从微波炉中取出熔融的lmNGM预混合物，使其冷却至~60°C。
    注意:在此阶段，培养基将在~5分钟后冷却并重新凝固。立即继续执行步骤 6.8 和步骤 6.9。
  8. 对于每 10 mL lmNGM 预混合物，添加以下内容（按顺序）:250 μL 1 M KPi、10 μL 1 M MgSO4、10 μL 1 M CaCl2 和 10 μL 5 mg/mL 胆固醇。
    1. 为了防止在设备上监测成虫时卵孵化，请添加 10 μL 的 50 mM 氟尿苷。
    2. 要选择 RNAi 质粒并诱导 RNA 的表达，请加入 5 μL 的 50 mg/mL 羧苄青霉素和 12 μL 的 1 mM IPTG。
      注意:抗生素或其他添加剂可以根据实验的设计进行更改。在此阶段，测试化合物/药物也可以添加到培养基中。
  9. 将熔融的lmNGM倒入珠浴中的25 mL盆中。
  10. 使用 200 μL 多通道中继器移液器用 lmNGM 填充设备孔。
    1. 将中继器设置为分液 14 μL（如果使用 200 μL 移液器吸头，最多可分液 14 μL 14 次）。
    2. 安装五个移液器吸头。该设备的孔具有与384孔板相同的间距。标准多通道移液器的间隔使得用户可以在行/列中移液到每隔一个孔中。
    3. 用熔融的lmNGM加载尖端。将前 14 μL 分液回含 lmNGM 的盆中。
    4. 快速但小心地将 14 μL 分配到内孔（图 1B 中为白色）中，从 图 1B 中标有"x"的孔开始，穿过板向右移动，然后向下移动，总共分配 12 次（60 孔）。
    5. 将剩余的lmNGM分装回盆中，因为最终等分试样通常小于14 μL。
    6. 重复步骤6.10.3-6.10.5，直到所有内孔都已填充。
    7. 接下来，将中继器设置为分配 15 μL 的等分试样。 重复步骤6.10.3-6.10.5，但不是内孔，而是填充最外层的孔环（图1B中的灰色），从图1B中标有"+"的孔开始，并围绕板的外边缘移动。
      注意:快速工作，使介质不会在移液器吸头中凝固。避免将任何 lmNGM 溢出到护城河中。外井往往干涸得更快。额外的 1 μL lmNGM 可使最终干燥孔在与内孔相同的干燥时间内具有水平表面。
  11. 作为质量控制步骤，检查每个孔以识别可能存在干扰成像的缺陷的孔，包括填充不足（lmNGM表面沉入孔边缘以下），过度填充（lmNGM表面具有圆顶顶部）以及包含气泡或碎屑的孔。
  12. 用短铂丝镐或真空吸气器从不满意的孔中取出固化的lmNGM。用新鲜熔融的lmNGM重新填充空井。此外，用短铂线镐或真空吸气器清除任何溢出到护城河中的介质。

7.在护城河中加入硫酸铜

注意:该设备的井被连续的护城河包围。在这里，护城河充满了硫酸铜，硫酸铜起到驱虫剂的作用，阻止蠕虫逃离井。

  1. 使用 200 μL 移液器，将 200 μL 硫酸铜溶液（参见步骤 1.6）分配到每个角的装置护城河中，每个角 2 次。这应该是一个足够大的体积，硫酸铜流过整个护城河。注意不要在任何时候将护城河装满;硫酸铜不应接触井的顶面。
  2. 如果硫酸铜不容易流过整个护城河，请使用短铂丝镐来帮助打破张力并将硫酸铜拖过护城河。
  3. 硫酸铜流过整个护城河后，使用 200 μL 移液器或真空抽吸液从护城河中去除尽可能多的硫酸铜。留下的残留物足以阻止蠕虫离开井。让护城河充满硫酸铜溶液可能会使硫酸铜溢出到井中，从而导致蠕虫逃跑。

8. 添加高压灭菌水晶体

注意:为了保持板内的湿度并防止lmNGM干燥，每个设备都被饱和吸水聚丙烯酰胺晶体包围。

  1. 准备水晶体（见步骤1.7）。
  2. 使用挤压瓶，在设备和托盘壁之间的空间中添加水晶体。合上托盘盖，用一块封口膜包裹所有四个面。再添加两片石蜡膜以完全密封板。
    注意:水晶体可以在烧杯中制备，然后用无菌刮刀舀入托盘中。但是，这会增加程序的时间，并增加每个托盘打开并暴露于潜在污染物的时间。
  3. 将密封装置放在工作台上，直到第二天准备好发现细菌。确保在添加 lmNGM 后，设备在孔朝上的情况下存放。

9. 年龄同步蠕虫种群的制备

注意:以下步骤产生同步的蠕虫群，准备在第四个幼虫阶段（L4）添加到多孔装置中。但是，也可以添加处于不同发育阶段的蠕虫。如果需要 L4，应在将蠕虫添加到设备之前 2 天完成此步骤。调整所需生命周期阶段的同步时间。

  1. 为了进行一致的老化研究，将 秀丽隐杆线虫 保持在标准NGM板上（在喂食良好的条件下，在20°C下参见步骤1.2）。
  2. 通过标准方法 从 畜牧板获得同步的动物种群，例如漂白17 或定时产卵1。
  3. 将分离的鸡蛋添加到带有细菌的NGM平板中。卵将在这个盘子上孵化，对于野生型动物，蠕虫将在 2 天内达到 L4 幼虫阶段。

10. 接种细菌培养物

注意:细菌被用作 秀丽隐杆线虫的主要食物来源，最常见的 是大肠杆菌 菌株OP50或HT115。细菌浓缩10倍，这应该在制备的培养物的体积中考虑。在发现设备前一天准备细菌培养物。

  1. 从步骤4中制备的LB板中，选择一个菌落，并为每个要点样的装置接种12mL无菌LB。必要时包括用于所用细菌菌株的选择性试剂。
  2. 在37°C培养箱中以~250rpm振荡培养细菌培养物过夜（~18小时）。

11.发现含有浓缩细菌的井

注意:向每个孔中添加少量浓缩细菌，这足以在设备上的整个生命周期内喂养蠕虫。在将蠕虫添加到孔中之前，需要干燥细菌培养物。由于每个孔中的培养基体积相对于添加的细菌体积（5 μL）很小（14-15μL），因此细菌培养基的化学含量会影响孔的化学环境。为了解释这一点，将细菌浓缩并重悬在盐水中以去除耗尽的LB，同时避免低渗透应激。在此阶段添加的 lmNGM 配方中没有添加盐（参见步骤 1.3-1.4）。

  1. 如第10节所述将细菌培养过夜后，将细菌培养物浓缩10倍。通过以~3，400× g 离心20分钟来沉淀细菌，处理上清液，并将沉淀重悬于原始培养体积142.8mM NaCl的1/10中（参见步骤1.4）。例如，要发现一个 240 孔装置，请旋转 12 mL 培养物并重悬于 1.2 mL 的 142.8 mM NaCl 中。
    注意:在点样之前，可以将测试化合物/药物添加到重悬的细菌培养物中。
  2. 使用重复移液器，用 5 μL 浓缩细菌点样每个孔。避免与lmNGM表面直接接触，因为移液器尖端会刺穿lmNGM，并使蠕虫在井表面以下挖洞。小心不要让细菌溢出到护城河中，因为蠕虫会被它吸引并逃入护城河。
  3. 取下托盘盖擦干斑点细菌。此步骤对于井环境的长期完整性很重要，并且有多种方法可以干燥斑点装置。无论使用哪种方法，请确保设备保持在无菌环境中，因为它需要在细菌干燥时不加盖地放置。增加的气流大大减少了干燥时间。干燥可以按照以下步骤进行:
    1. 将设备放在干净的密封容器中，例如用 10% 漂白剂清洁的塑料箱，然后用 70% 乙醇清洁。这种干燥方法可能需要几个小时。
    2. 将未覆盖的设备放在无菌层流罩中（类似于下面的首选方法）。
    3. 使用定制的"干燥盒"（本研究中遵循的优化方法）干燥设备，可以使用计算机机箱风扇和HEPA过滤器以最低的成本构建设备（请参阅 补充文件1）。
      注意:无论使用哪种方法，干燥步骤都必须针对当地环境进行优化。经常监控孔的干燥速度，直到确定典型的干燥时间。在低湿度环境中，使用干燥箱会导致~30-40分钟的干燥时间。不要让板太干，因为孔中的介质会收缩和下沉。最好在几个井仍然潮湿时将设备从干燥中取出，而不是让它干燥更长时间并可能过度干燥大量孔。
  4. 检查水晶体。如果托盘中的大部分水晶体在干燥过程中变干并失去体积，请在托盘中添加更多。
  5. 细菌干燥后，立即添加蠕虫（第 12 节）或密封托盘以备后用。要密封，请合上托盘盖，并用一块封口膜包裹所有四个侧面。重复两次，总共三层石蜡膜。完全包裹托盘后，可以在室温下将设备留在工作台上长达 4 天，然后再添加蠕虫（第 12 节）。

12. 将蠕虫添加到多孔装置中

  1. 使用铂镐手动将每个孔一个蠕虫添加到每个孔中，以从第9节中制备的蠕虫板中转移动物。只选择处于所需生命阶段和年龄的蠕虫。
    注意:将蠕虫添加到设备中需要 1 小时以上可能会导致 lmNGM 干燥，因此应尽快添加蠕虫。在将它们添加到设备孔之前，一次拾取多个蠕虫 （20+） 可以帮助提高速度。

13.完成长期使用设备的准备工作

注意:这些步骤可确保设备孔在实验期间保持水合。

  1. 检查水晶体。确保水晶体与设备顶部齐平，但不会溢出到设备上。如有必要，在托盘中添加额外的水晶体。
  2. 将一滴准备好的洗涤剂溶液（见步骤1.5）添加到托盘盖的内侧，并用工作擦拭物擦拭，直到洗涤剂溶液干燥。这可以防止设备密封在托盘内后盖子上起雾，以便蠕虫清晰可见。
  3. 使用特定技术用三片石蜡膜包裹托盘，以促进石蜡膜密封的长期完整性。
    1. 稍微拉伸一块石蜡膜，使其仅覆盖托盘的两侧。用第二张石蜡像重复此操作以覆盖其他两面。
    2. 在第一层石蜡膜的顶部，取最后一块石蜡膜，将其完全拉伸，然后包裹所有四个侧面。如果密封得当，设备孔应保持水合~2个月。
      注意:封口膜的完整性应每 1-2 周监测一次，如果石蜡膜破损，应更换。
  4. 使用用 70% 乙醇润湿的任务擦拭布从托盘顶部去除任何指纹。

14. 数据收集

注意:本研究的目的是描述培养方法。一旦填充，多孔设备与各种表型的纵向监测兼容。这里提供了测量几个最常见参数的基本指导。

  1. 寿命:通过敲击板或每 1-3 天将蠕虫暴露在明亮的蓝光下来监控寿命。如果没有观察到移动，则得分为死亡。这些多孔设备还与自动成像和分析管道兼容，用于估计寿命13，18。
  2. 活动:通过拍摄设备井中动物的静态图像或视频并评估行进距离、速度或其他运动指标，监测个体动物一生的活动。这些设备还与用于估计活动13，18 的自动成像和分析管道兼容。
  3. 体型和形状:通过拍摄设备孔中动物的静态图像并使用标准成像技术量化视觉参数来监测体型和形状的变化。原则上，这种培养方法应与现有软件兼容，以便对蠕虫体型进行更复杂的评估19，20，21。

15. 重复使用设备

注意:实验完成后，多孔设备最多可以清洁和重复使用三次。额外的重用开始影响蠕虫表型，可能是由培养基中的化学物质或PDMS材料壁中积聚的细菌引起的。

  1. 丢弃封口膜，然后从托盘中取出设备。检查设备右上角的凹口，指示它已被使用多少次。如果已使用三次，请丢弃该设备。如果使用次数少于三次，请清洁并重复使用。
    注意:托盘由聚苯乙烯制成，不直接与lmNGM，细菌或介质的任何添加剂接触。只要它们保持视觉清晰，它们可以多次重复使用。
  2. 冲洗掉托盘中残留的水晶体。用10%漂白剂溶液喷洒托盘内部，静置10分钟。用去离子水冲洗并立即干燥以避免水斑。
  3. 将设备放在流水下，开始清洁孔中的介质。在水下轻轻弯曲和扭转设备，以帮助从井中松开介质，但不要弯曲得太远以至于设备撕裂。用 200 μL 移液器吸头挑选出卡在孔中的任何剩余培养基。
  4. 用去离子水填充一个 2 L 烧杯~3/4 满，并在热板上煮沸。
  5. 在沸水中加入一个或两个多孔装置和一个搅拌棒。将磁力搅拌器打开至低速（~200 rpm），以轻轻搅拌水中的设备。让设备煮沸 10 分钟。
  6. 用金属镊子将设备从水中取出，然后将它们面朝下放在纸巾上沥干。让设备至少干燥过夜。
  7. 当设备完全干燥时，用箔纸包裹，并用高压釜胶带密封。在高压灭菌器胶带上写下设备的使用次数。在121°C下干循环高压灭菌15分钟以灭菌。这些设备现在可以重复使用了。

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Results

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WorMotel培养系统可用于收集各种数据，包括有关寿命，健康寿命和活动的数据。已发表的研究利用多孔设备来研究寿命和健康寿命13，14，静止和睡眠22，23，24以及行为25。寿命可以手动评分，也可以通过图像集合和下游成像分析进行评分。在前一种方法中，可以在刺激（例如，敲击平板或暴露在蓝光下）后每 1-3 天手动观察蠕虫，如果没有观察到运动，则评分为死亡，类似于培养皿1 上的标准方法。后一种方法类似，不同之处在于可以通过比较施加刺激后拍摄的图像之间的帧间差异来确定蠕虫运动。这提供了一个额外的好处，因为运动提供了关于该时间点个体动物活动水平的信息，并提供了一个指标，通过该指标可以确定寿命（例如，运动停止）和健康寿命（已提出多个定义）。这些图像可...

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Discussion

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WorMotel系统是一个强大的工具，可以随着时间的推移收集数百个孤立的 秀丽隐杆线虫 的个性化数据。继早期使用多孔装置应用于发育静止、运动行为和衰老的研究之后，这项工作的目标是优化多孔装置的制备，以便以更高的通量方式长期监测活动、健康和寿命。这项工作提供了制备多孔设备的详细协议，该协议优化了原始协议13的许多步骤，突出了可能存在技术困难的关键点，并提供了有关重复使用板和其他材料的讨论。

为了扩展 - 作为一个目前在典型的一周内准备10到20台设备的实验室 - 首要考虑因素是这些设备是否可以重复使用，如果是，在多大程度上重复使用。与在培养皿上进行传统培养相比，制备PDMS设备的时间和金钱成本更高，但是通过重复使用PDMS或系统的其他组件可以降低这些较高的成本。随着多次重复使用，PDMS开始形成黄色，可能反映了lmNGM培养基或细菌中化合物的积累。在这些盘子上培养的动物也表现出更高的逃跑率和缩短的寿命。基于数十个实验，三种用途是重复使用这些PDMS器件的最佳用途，允许评估与年龄相关的表型，而不会因PDMS降解而产生可...

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Disclosures

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提交人表示，他们没有任何利益冲突需要披露。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了NIH R35GM133588对GLS，美国国家医学院催化剂奖对GLS，亚利桑那州技术和研究倡议基金的支持，由亚利桑那州董事会和埃里森医学基金会管理。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2.5磅重量CAP杠铃RP-002.5
亚克力板（6英寸x 4英寸x 3/8英寸）Falken DesignACRYLIC-CL-3-8/1224板切割成小尺寸？
氨苄青霉素钠盐Sigma-AldrichA9518
可高压灭菌挤压瓶Nalgene2405-0500
Bacto 琼脂BD Difco214030
Bacto 蛋白胨Thermo Scientific211677
盆，25 mLVWR89094-664一次性移液盆 
柜式真空干燥器 SP Bel-ArtF42400-4001不需要使用干燥剂，只需用作真空室即可。
CaCl2Acros Organics349615000
秀丽隐杆线虫N2隐杆线虫遗传学中心 （CGC）N2野生型菌株
羧青霉素 GoldBioC-103-25
离心机贝克曼360902
胆固醇ICN Biomedicals Inc101380
压缩氧气罐AirgasUN1072
CuSO4Fisher ChemicalC493-500
干珠浴培养箱Fisher Scientific11-718-2
大肠杆菌 OP50 遗传学中心 （CGC）OP50秀丽隐杆线虫的标准实验室食品
乙醇Milliporeex0276-4
氟尿苷研究产品国际F10705-1.0
杂交炉Techne731-0177用于固化 PDMS 混合物，任何类似的烘箱都足够
培养箱Shel Lab202020 >C 培养箱，用于维持蠕虫菌株和 37 °C 培养箱培养细菌 
异丙基和szlig;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KH2PO4Fisher ChemicalP286-1
KimwipesKimTech34155湿巾
LB肉汤，LennoxBD Difco240230
低熔点琼脂糖研究产品国际A20070-250.0
MgSO4Fisher ChemicalM-8900
微波 夏普R-530DK
多通道重复移液器，20–200 和微量;L LTS EDP3 Rainin17013800使用的确切型号已不再销售，已提供类似型号的目录号
NaClFisher 生物试剂BP358-1
Nunc OmniTrayThermo Scientific264728透明聚苯乙烯托盘
Parafilm MFisher Scientific13-374-10双宽（4 英寸）
培养皿，100 mM VWR25384-342
培养皿，60 mM Fisher ScientificFB0875713A
等离子清洗机Plasma Etch， Inc.PE-50
PLATINUM 真空泵JB IndustriesDV-142N 
PolyJet 3D 打印机Stratasys Objet500 Connex3PolyJet 3D 打印服务（原文：Vero Rigid;表面处理：哑光;颜色：光泽;分辨率：X 轴：600 dpi，Y 轴：600 dpi，Z 轴：1600 dpi）
振荡培养箱Lab-Line3526CC
smartSpatulaLevGo， Inc.17211一次性抹刀
高吸水性聚合物 （AgSAP S型）M2 聚合物技术S型在正文中称为"水晶体"
SYLGARD 184 有机硅弹性体基陶氏化学公司2065622
SYLGARD 184 有机硅弹性体固化剂陶氏化学公司2085925
注射器过滤器（0.22 µm）Nest Scientific USA Inc. 
注射器，10 mL 费舍尔科学14955453
吐温20Thermo ScientificJ20605-AP洗涤剂
真空泵油VWR54996-082
VeroBlackPlusStratasys RGD875刚性 3D 打印耗材
ThermoScientificWB30304称重船 足够大，适用于 PDMS 混合物体积
大秀丽隐杆线虫了 任务ProtoCAM 提供的 料 380111

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