Summary
현장에서 미성숙 테프리티드 초파리의 탐지를 증가시키면 이러한 파괴적인 해충의 개체군을 제거하기 위한 시기 적절한 노력을 촉발할 수 있습니다. 늦은 instar 유충을 검출하는 것은 숙주 과일을 가방에 넣고 펄프를 일련의 체를 통과시킬 때 손으로 자르고 육안 검사보다 더 빠르고 정확합니다.
Abstract
Tephritidae 계통의 초파리는 세계에서 가장 파괴적이고 침입적인 농업 해충 중 하나입니다. 많은 국가들이 초기 개체군을 제거하기 위해 값비싼 박멸 프로그램을 시행하고 있습니다. 박멸 프로그램 동안 유충을 탐지하기 위해 공동의 노력을 기울이는데, 이는 번식 개체군을 강력하게 나타내고 감염의 공간적 범위를 설정하는 데 도움이 되기 때문입니다. 미성숙 한 생애 단계를 감지하면 해충의 추가 확산을 억제하고 방지하기위한 추가 통제 및 규제 조치가 취해집니다. 전통적으로 유충 탐지는 개별 숙주 과일을 절단하고 육안으로 검사하여 수행됩니다. 이 방법은 제한된 수의 과일 만 처리 할 수 있고 유충을 놓칠 확률이 높기 때문에 노동 집약적입니다. i) 비닐 봉지에 숙주 과일을 뿜어내고, ii) 일련의 체를 통해 펄프를 걸러내고, iii) 잔류 펄프를 갈색 설탕 물 용액에 넣고, iv) 표면에 떠 있는 유충을 수집하는 추출 기술을 테스트했습니다. 이 방법은 플로리다에서 Anastrepha suspensa에 의해 자연적으로 감염된 현장 채취 구아바를 사용하여 평가되었습니다. 초파리 박멸 프로그램을 대표하는 낮은 개체군을 모방하기 위해 하와이의 망고와 파파야는 알려진 적은 수의 Bactrocera dorsalis 유충에 감염되었습니다. 이 방법의 적용 가능성은 B. dorsalis 에 의해 자연적으로 감염된 구아바에 대한 현장에서 테스트되어 비상 초파리 프로그램 동안 근로자가 경험한 조건에서 방법을 평가했습니다. 현장 및 실험실 시험 모두에서 펄프를 분쇄하고 체질하는 것이 과일을 자르는 것보다 더 효율적이고(더 적은 시간이 필요함) 더 민감했습니다(더 많은 유충이 발견됨). 갈색 설탕 물 용액에 펄프를 띄우면 초기 instar 유충을 감지하는 데 도움이되었습니다. 중요한 테프리티드 숙주의 과일 펄프를 씹고 체질하면 응급 프로그램 중에 유충을 탐지할 확률이 높아질 수 있습니다.
Introduction
테프리티드 초파리는 가장 파괴적인 농업 해충 중 하나이며, 아나스트레파(Anastrepha), 박트로세라(Bactrocera), 세라티스(Ceratitis) 속이 가장 큰 위험을 초래합니다1. 많은 지역이 1) 역사적 침입 및 관련 경계 및 박멸 프로그램, 2) 입국항에 초파리 숙주 물질의 높은 도착률, 3) 번식 개체군 확립에 유리한 기후 조건에 따라 이국적인 초파리 설립 위험이 높습니다. 캘리포니아 주에서는 매년 테프리티드의 여러 침입 및 탐지가 발생합니다2. 지난 세기 동안 전 세계적으로 테프리티드에 대한 200건 이상의 침입 및 박멸 프로그램이 있었으며 이는 최근 수십 년 동안 크게 가속화되었습니다3. 이러한 프로그램의 대다수가 침입하는 초파리를 근절하는 데 성공했지만3,4, 이러한 침입의 경제적, 환경적 부담은 여전히 높으며 설립 가능성은 항상 존재합니다. 최근의 치명적인 예는 아프리카 대륙에서 Bactrocera dorsalis의 감염입니다5.
비상 초파리 프로그램 동안, 침입 종의 번식 개체군을 탐지하고 통제하기 위해 공동의 노력이 이루어집니다. 예를 들어, 플로리다 주는 토양 도랑(열매를 맺는 숙주 식물의 물방울 아래)을 적용하고 짝짓기를 한 암컷 및/또는 유충이 발견되는 지역 주변 반경 200m에서 숙주 과일을 제거함으로써 테프리티드 침입에 대응한다6. 이러한 행동과 전술은 토양의 유충과 번데기를 죽이고 해당 지역의 과일에서 알과 유충을 제거하는 역할을 합니다. 일부 박멸 프로그램에서는 상당한 양의 숙주 과일이 제거됩니다. 2015 년 플로리다6의 B. dorsalis 박멸 프로그램 동안 100,000kg 이상의 과일이 파괴되었습니다. 격리 지역에서만 재배자 및 관련 산업에 대한 경제적 손실은 1,070만 달러 이상으로 추산되었습니다7.
검역 구역에서 테프리티드 유충을 찾기 위해 소규모 곤충학자 팀이 암컷 파리 탐지 구역 주변 반경 200m에서 숙주 과일을 수집하고 각 과일에 유충이 있는지 절단하고 육안으로 검사합니다6. 제한된 인력 자원과 수백 명의 가능한 호스트로 인해 특히 상업 생산 지역과 주거용 야드 모두에서 식물 다양성이 높은 지역에서 작업이 어려워집니다. 또한 숙주 과일을 절단 할 때 유충을 놓칠 수 있습니다. 입국항에서 과일을 절단하는 것을 평가한 연구에서, 감염된 과일을 몇 주 동안 보관하고 번데기 기질에서 발견된 유충과 번데기를 세는 것과 비교했을 때, 과일 절단은 A. suspensa 를 검출하는 데 효과적이지 않은 것으로 나타났다8.
감염을 감지하기 위한 과일 절단에 대한 대안이 있습니다 9,10,11,12,13. 예를 들어, 갈색 설탕 부양법과 온수 방법은 수확 된 체리 9,10에서 서양 체리 초파리를 탐지하는 데 사용되는 절차입니다. 갈색 설탕 방법은 분쇄 된 과일을 설탕 물 용액에 넣고 위로 떠 다니는 유충을 모으는 것입니다. 흑설탕 부양법은 수출 체리에 대한 규제 규칙을 충족하기 위해 특별히 개발되었으며, 이는 포장 하우스에서 초파리 해충을 격리해야 합니다. 또한 식물 위생을 지원하기 위해 흑설탕 물 부양, 염수 부양 또는 끓이는 것을 포함하는 승인된 미국-캐나다 블루베리 인증 프로그램이 있습니다14. 설탕과 뜨거운 물 부양의 정확성을 테스트 할 때, 연구자들은 체질 방법을 사용하여 얼마나 많은 유충이 누락되었는지를 결정했습니다 9,10,11,12,13. 한 연구에 따르면 분쇄한 블루베리를 소금 용액에 섞고 재사용 가능한 커피 필터로 여과하는 것이 소금과 설탕 용액의 표면을 육안으로 검사하는 것보다 초파리 스즈키 유충을 검출하는 데 4배 더 우수하다고합니다 14. 또한, 감귤류15에서 A. suspensa 유충의 검출을 위해 가스 크로마토그래피를 사용하였다. 이러한 접근 방식은 현장 조사에 적용 할 수 있는지 테스트되지 않았습니다.
우리의 목표는 체질과 설탕물 부양을 사용하여 현장에서 테프리티드 유충을 찾는 방법을 개발하고 테스트하는 것이었습니다. 이 방법을 사용하면 기존의 과일 절단 방법보다 미성숙 초파리를 보다 효율적으로 감지할 수 있어 초파리 박멸 프로그램 동안 번식 개체군을 적시에 제어할 수 있습니다.
Protocol
1. 과일 선택
- 조사 대상 지역에서 어떤 과일을 구할 수 있는지 결정하십시오.
- 표적 테프리티드 종에 대해 알려진 숙주 목록을 기반으로 숙주 과일을 선택합니다.
- 망고, 파파야, 구아바와 같은 부드럽고 잘 익은 과일을 선택하십시오. 열대 아몬드와 같이 덜 익거나 단단한 과육 과일은 과일 절단과 같은 다른 방법으로 검사해야 합니다.
- 손상, 산란 흉터 및 부드러운 반점의 징후가 있는 나무에서 떨어지거나 너무 익은 과일 또는 잘 익은 과일을 선택하십시오.
- 한 번에 약 2L의 과일을 처리합니다(예: 구아바 5개 또는 중간 크기 망고 5개가 이 방법에 적합한 샘플이 됨). 한 번에 처리 할 수있는 과일의 수는 과일의 크기에 따라 다릅니다 (그림 1A).
2. 머싱
- 과일을 큰 조각으로 자르고 4L 지퍼 잠금 보관 가방에 넣습니다(그림 1B).
- 물이 다진 과일을 25-50mm 덮을 때까지 가방에 물을 추가합니다(그림 1C).
- 모든 과육이 껍질에서 빠지고 부드러운 농도(즉, 큰 덩어리가 없음)가 될 때까지 손으로 과일을 부드럽게 짜십시오(그림 1D).
3. 늦은 instar 수집을 위해 체질
- 체를 쌓으십시오. 많은 양의 과일(한 번에 ~ 5개의 과일)을 처리하려면 큰 체(직경 457mm)를 사용하고 개별 과일 또는 작은 샘플(과일 5개< 처리하려면 작은 체(직경 305mm)를 사용하십시오.
- 작은 메쉬(8번, 2.36mm) 체 위에 큰 메쉬(20번, 0.85mm) 체로 체를 쌓습니다. 초기 별을 감지하려면 스택 바닥에 세 번째 체 (No. 45, 0.35mm)를 놓습니다 (그림 1E).
- 펄프를 상단 체에 붓습니다(그림 1F).
- 미세한 펄프가 체를 통과할 때까지 수도꼭지, 호스 또는 병의 물을 사용하여 체 더미를 통해 펄프를 철저히 씻습니다(그림 1G).
- 껍질이나 큰 과일 조각과 함께 남아 있을 수 있는 후기 유충이 있는지 상단 체를 육안으로 스캔합니다(그림 1H).
- 조심스럽게 두 번째 체에 늦은 instar 애벌레가 있는지 검사하십시오. 다량의 미세 펄프를 사용하면 추가 헹굼이 필요할 수 있습니다.
- 유충 집게로 체에서 유충을 수집하고 70 % EtOH가 함유 된 바이알에 넣습니다.
4. 초기 instar 수집을 위한 설탕 부양
- 짙은 갈색 설탕 453g(1상자)을 수돗물 2L에 녹여 설탕 용액을 미리 혼합하면 Brix 수치가 19°10이 됩니다.
- 더 미세한 메쉬 체(예: 20번 및 45번)에서 펄프를 체 가장자리까지 수돗물로 씻은 다음 재료를 플라스틱 접시 냄비(11L)로 옮깁니다.
- 펄프를 25-50mm 덮을 때까지 갈색 설탕 용액을 넣고 소포제 2 방울을 첨가하십시오. 과육을 흑설탕 용액에 약 5분 동안 그대로 두십시오.
- 유충 집게로 용액 표면에 떠 있는 유충을 70% EtOH가 함유된 바이알에 수집합니다.
5. 애벌레 큐레이션
- 나중에 검사하고 식별할 수 있도록 수집 위치, 날짜, 과일 유형 및 수집기로 바이알에 라벨을 붙입니다.
Representative Results
초기 및 후기 instar Anastrepha suspensa 밭에서 채취 한 과일 추출
이 실험에서 우리는 발견된 유충의 비율과 이를 검출하는 데 필요한 평균 시간과 관련하여 과일 절단과 MSF(mushing, s체질, 부유) 방법을 비교했습니다. Anastrepha suspensa의 유충에 심하게 감염된 구아바는 플로리다 주 홈스테드의 열대 연구 및 교육 센터 인 플로리다 대학교 식품 농업 과학 연구소에 위치한 식물에서 수집되었습니다. 열매는 무작위로 5 개의 그룹으로 분류되어 2 가지 유충 추출 방법 중 1 가지에 할당되었습니다 : 1) 손으로 자르거나 2) MSF 방법. 각 추출방법을 이용하여 육안으로 보이는 모든 유충을 채취하는 시간을 기록하였다.
손 절단 방법은 현재 박멸 프로그램에서 사용되는 방법을 따랐습니다. 5명의 작업자(n=5) 각각에게 5개의 과일을 할당하여 과일을 더 작은 조각으로 자르고 과육을 육안으로 검사하여 유충의 모든 단계를 검색했습니다. 육안 검사에서 유충이 누락되었는지 여부를 확인하기 위해 손으로 자른 과일 조각을 해부 현미경(10x)을 사용하여 다시 검사했습니다.
MSF 방법의 경우 5개의 과일을 큰 조각(50-80cm)으로 자르고 지퍼백에 넣고 껍질에서 모든 과육이 제거되고 과육이 부드러운 농도(즉, 큰 덩어리가 없음)가 될 때까지 손으로 부드럽게 짜냈습니다. 으깬 과일은 일련의 큰(45.7cm) 놋쇠 체를 통해 걸러졌습니다. 가장 큰 메쉬 (8 번)가 상단에 쌓이고 20 번과 45 번 메쉬 체가 뒤 따랐습니다. 이 처리에 배정 된 직원은 싱크대 수도꼭지에 연결된 호스의 물을 사용하여 메쉬를 통해 펄프를 세척했습니다. 늦은 instar 애벌레는 체에서 분명했다. 작은 별은 펄프와 혼합되어 보고 제거하기가 어려웠습니다. 따라서 체의 펄프/유충 혼합물을 1L의 흑설탕수 용액과 함께 양동이에 넣었습니다. 유충은 즉시 표면으로 떠올랐다. 용액을 부드럽게 교반하고, 5분 후, 유충을 버킷으로부터 제거하고, 계수하였다. 과일을 처리하는 시간은 설탕물 용액에서 유충을 썩고, 체질하고, 제거하는 조합이었습니다. 손으로 자르거나 체질하고 부양하는 방법을 통해 발견된 유충 수에 대한 데이터는 Kruskal-Wallis 비모수 검정(p = 0.05)16을 사용하여 분석되었습니다.
MSF 방법은 손으로 자르는 것보다 더 많은 수의 유충(그림 2A)과 분당 더 많은 유충(그림 2B)을 산출했습니다. 이 연구에서 다른 instars의 검출이 정량화되지는 않았지만, 우리는 모든 instars (첫 번째, 두 번째 및 세 번째)가 체를 사용하여 발견 된 반면, 나중에 instars (두 번째 및 세 번째)는 손으로 절단하여 관찰되었습니다. 이전에 절단하고 육안으로 검사한 샘플을 해부 현미경 스코프로 다시 검사했을 때 과일에 감염된 후기 유충의 40%가 누락되었습니다. 그러나 초기 instars는 주로 재검사에서 발견되었습니다.
이 실험은 MSF 방법을 사용하는 것이 감염이 심한 과일에서 유충을 찾는 데 더 효과적이고 효율적이라는 것을 보여주었습니다. 그러나 적은 수의 유충에 감염된 과일은 침입 종이 매우 드문 박멸 프로그램에서 발생할 가능성이 더 큽니다. 따라서 우리는 숙주 과일이 알려진 적은 수의 유충에 감염된 실험실 연구를 수행했습니다.
낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위한 망고와 파파야의 수동 감염
이 실험은 발견된 유충의 비율과 감염이 상대적으로 낮을 때 발견하는 데 필요한 시간과 관련하여 과일 절단 및 MSF 방법을 비교했습니다. 수동 감염은 존재하는 유충의 수가 확실하게 알려져 있기 때문에 각 방법의 효능을 평가하기 위한 실험 도구로 사용되었습니다.
코르크 천공충(직경 1.0cm)을 사용하여 초파리 유충이 없는 개별 망고와 파파야 과일에 5개의 구멍을 만들었습니다. 두 번째 후반에서 세 번째 초반에 한 마리의 instar B. dorsalis 유충을 과일 하위 집합의 5개 구멍 각각에 넣었습니다. 구멍은 과일에서 뚫린 조각을 사용하여 캡을 씌웠고 나머지 과일은 수동 감염을 시각적으로 시뮬레이션하기 위해 유충을 삽입하지 않고 캡을 씌웠습니다. 과일을 유충 발달을 허용하기 위해 27°C에서 48시간 동안 유지했습니다. 실험은 하와이 섬 힐로에 있는 ARS 연구소(n=5명)와 하와이 오아후 섬에 있는 APHIS-PPQ 연구소(n=4명)에서 수행되었습니다.
과일 절단을 위해 각 작업자에게 망고 5개(유충 1마리, 감염되지 않은 4개)와 파파야 4개(감염 1개, 감염되지 않은 3개)를 제공했습니다. 작업자는 각 과일을 개별적으로 더 작은 조각으로 자르고 미성숙 초파리가 있는지 펄프를 지속적으로 검사했습니다. 펄프가 철저히 검사되었을 때 검색이 중단되었습니다. 발견된 총 유충 수와 각 작업자가 절단하여 모든 과일을 처리하는 데 소요된 시간을 기록했습니다(그림 3) 및 (그림 4).
각 작업자는 머싱 또는 체질(과일 절단 없음)을 위해 또 다른 유사한 과일 세트(망고 5개와 파파야 4개)를 받았으며 앞서 설명한 대로 2개가 감염되었습니다. 펄프를 상부 체에 붓고, 프로토콜에 기재된 바와 같이, 수도꼭지로부터의 물 및 제거된 유충을 사용하여 체의 스택을 통해 세척하였다. 실험은 당 부양과 당 부화 없이 두 번 수행되어 부양 단계를 제거하면 감도를 잃지 않고 공정 속도가 증가하는지 여부를 결정했습니다(즉, 모든 또는 대부분의 유충이 발견됨)(그림 3). 발견된 유충의 수와 절단, MSF 또는 MS 방법을 통해 과일을 가공하는 데 각 작업자가 소요한 시간을 기록했습니다.
망고와 파파야 모두 전체 MSF 방법(부유 포함)이 더 많은 유충 검출 횟수를 가져왔고 과일 절단보다 빨랐습니다(표 1). 전통적인 과일 절단 방법을 사용하는 작업자는 망고와 파파야에 각각 배치된 유충의 32%와 35%를 놓쳤습니다(표 1). 국경없는의사회 기법을 사용하여 과일을 대량으로 가공하는 데 걸리는 시간은 망고를 개개로 자르는 것보다 30%, 파파야를 자르는 것보다 35% 더 짧은 시간이 소요되었습니다(그림 3). 과일 절단 방법과 비교할 때 파파야(그림 3C)와 망고(그림 3D)에 대해 MSF 방법을 사용하여 분당 더 많은 유충이 발견되었습니다. 발견 된 모든 유충은 살아있었습니다.
유충 형태학적 식별은 후기 별에서만 가능합니다. 위의 실험을 반복하되 유충의 회수율이 높게 유지되고 과실 가공 속도가 빨라졌는지를 확인하기 위해 부양 과정을 생략하였다. MS 방법(부유 생략)은 절단 및 육안 검사에 비해 파파야(그림 4A) 및 망고(그림 4B)에 대해 더 많은 유충 검출을 가져왔습니다. 또한 이 기술은 파파야(그림 4C)와 망고(그림 4D)를 절단하고 육안으로 검사하는 것보다 빨랐습니다. MSF 방법에서 부유 단계를 제거하면 파파야의 경우 90%, 망고의 경우 48% 늦게 유충을 찾는 시간이 단축되었습니다(표 2). 발견된 유충의 비율은 두 방법 모두에서 높았고 MS의 경우 일관되게 더 높았습니다(부유 생략). 파파야의 경우 유충의 80%와 85%가 각각 MSF와 MS 방법에서 회수되었습니다(표 1 및 표 2). 망고의 경우, 88%와 95%가 각각 MSF 및 MS 방법에서 회수되었다(표 1 및 표 2).
과일 절단 및 MSF 방법의 현장 비교
이 실험의 목표는 현장 조건에서 과일 절단과 국경없는의사회 방법을 비교하여 비상 초파리 프로그램을 모방하는 것이었습니다. 과일 가공은 두 가지 유충 추출 방법의 현장 준비 상태를 테스트하기 위해 실험실의 편의성과 인프라 없이 수행되었습니다. 작업은 힐로 근처의 USDA-ARS 열대 식물 유전자원 및 질병 연구 부서 생식질에 위치한 구아바 과수원에서 수행되었습니다. 감염 징후를 보이는 총 40마리의 구아바를 수집하여 2개 그룹으로 나눴습니다. 총 20마리의 구아바를 절단/육안 검사에 이어 MSF(부유 포함)를 실시하여 MSF 방법과 비교하여 절단 방법의 민감도를 평가할 수 있었습니다. 해부는 전술한 바와 같이 진행되었다. 발견되면 유충을 제거하고 계산했습니다. 4 명의 작업자가 각각 5 개의 구아바를 해부하고 각 작업자에 대해 절단 및 검사에 필요한 시간을 기록했습니다. 절단 후 MSF는 더 작은 유충을 수집하기 위해 8 호 및 20 호 체 외에 세 번째 작은 메쉬 체 (No. 40, 0.420 mm)를 사용한 것을 제외하고는 위와 같이 수행되었습니다. 두 번째 구아바 20개 세트는 지퍼백(봉지당 과일 10개)에 담아 국경없는의사회만 적용(즉, 자르지 않음)하여 과일 절단에 필요한 시간과 국경없는의사회를 비교할 수 있었습니다. 위와 같이 이 절차에는 3개의 체가 사용되었습니다. 발견된 유충의 수와 과일을 처리하는 총 시간(봉지/체질/설탕 용액에 떠 있는 동안 과일을 5분 동안 머무는 것)을 기록했습니다.
실험실에서 발견된 바와 같이, 과일 절단은 과일 감염을 과소평가했으며 매우 가변적이어서 MSF 방법으로 회수할 수 있는 것보다 25%-83% 적은 유충을 검출했습니다(표 3). 또한, 유충 수가 적은 샘플에서 국경없는의사회는 500% 더 많은 유충을 회수하여 분석 민감도를 높이고 감염 유기체를 식별할 수 있는 더 큰 기회를 제공했습니다. 과일은 절단에 비해 MSF 방법을 사용하여 훨씬 빠르게 처리되었습니다. 5개의 과일을 자르고 검사하는 데는 국경없는의사회를 통해 10개의 과일을 가공하는 것과 거의 같은 시간이 필요했습니다.
그림 1: 초파리 유충 추출 프로토콜의 단계. (A) 한 번에 약 2L의 과일을 처리합니다(예: 구아바 5개 또는 중간 망고 5개가 이 방법에 적합한 샘플을 구성함). (B) 과일을 큰 조각으로 자르고 4L 지퍼 잠금 장치 보관 가방에 넣습니다. (C) 물이 다진 과일을 25-50mm 덮을 때까지 백에 물을 추가합니다. (D) 모든 과육이 껍질에서 제거되고 부드러운 농도(즉, 큰 덩어리가 없음)가 될 때까지 손으로 과일을 부드럽게 짜냅니다. (E) 큰 메쉬(8번, 2.36mm) 체와 함께 체를 쌓고 그 위에 작은 메쉬(20번, 0.85mm) 체를 쌓습니다. 초기 instars의 경우 스택 바닥에 세 번째 체 (No. 45, 0.35mm)를 놓습니다. (F) 펄프를 상단 체에 붓습니다. (G) 미세한 펄프가 첫 번째 체를 통과할 때까지 수도꼭지, 호스 또는 병의 물을 사용하여 체 더미를 통해 펄프를 철저히 씻습니다. (H) 껍질이나 큰 과일 조각과 함께 남아 있을 수 있는 후기 유충이 있는지 상단 체를 육안으로 스캔합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 초기 및 후기 instar Anastrepha suspensa 추출물 밭에서 수집 한 과일. 구아바 열매 5개에서 추출한 Anastrepha suspensa 유충의 평균 수±(평균[SE]의 표준 오차)는 절단 및 육안 검사(절단: 70.4 ± 11.9)하거나 일련의 3개의 체를 통해 펄프를 세척한 다음 펄프를 설탕물 용액(MSF: 175.6 ± 21.91)(A)에 담궈 채취한 것입니다. 절단 (1.21 ± 0.16) 및 MSF (3.71 ± 0.50)에 의해 처리 된 5 개의 구아바에서 분당 수집 된 평균 유충 수 (±SE). 각 방법은 5회 복제되었으며, 막대 위의 별표는 Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 한 유충 수(χ2 = 6.81, p < 0.01)와 처리 시간(χ2 = 6.80, p < 0.01)에 대해 유의미한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위해 망고와 파파야의 수동 감염을 사용한 전체 mushing-sieving-floatation 방법의 검증. (A) 및 망고(절단: 3.4 ± 0.51, MSF: 4.4 ± 0.4)에서 발견되는 Bactrocera dorsalis 유충(±SE)의 평균 수(절단: 0.±51 MSF: 4.4± 0.4) (B) 과실과 파파야(절단: 0.21± 0.1, MSF: 0.4± 0.15)에서 발견된 평균 유충수(±SE)와 망고(절단: 0.14± 0.01, MSF: 0.21± 0.03)(D). 절단 또는 MSF 방법(부양 포함, n = 5)을 사용하여 가공된 과일은 5마리의 세 번째 유충으로 수동으로 감염되었습니다. 막대 위의 별표는 Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 한 과일 절단과 비교할 때 파파야(χ 2 = 5.39, p = 0.02)와 망고(χ2 = 3.94, p = 0.05)에서 발견되는 유충 수에 대해 상당한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위해 망고와 파파야의 수동 감염을 사용한 mushing-sieving 방법(부유 제거)의 검증. 파파야에서 발견되는 평균 유충 수(±SE)는 파파야(절단: 0.48±, MS: 4.25± 0.48)(A) 및 망고(절단: 2.5± 0.5, MS: 4.75± 0.25)(B) 과실에서 발견된 평균 유충 수(±SE)와 파파야(절단: 0.15± 0.05, MS: 0.76± 0.15)(C) 및 망고(절단: 0.16± 0.04, MS: 0.44± 0.04)(D). 열매는 5 개의 제 3 instar Bactrocera dorsalis 유충으로 수동으로 감염되고 절단 및 육안 검사 (절단)에 의해 처리되거나 봉지에 담겨 체로 세척되었습니다 (부양 없이 분출 및 체질만, n = 4). 막대 위의 별표는 파파야에서 발견되는 유충의 수에 대한 유의미한 차이를 나타냅니다 (χ 2 = 5.46, p = 0.02) 및 망고 (χ 2 = 5.25, p = 0.02) 파파야 처리 시간 (χ 2 = 5.39, p = 0.02) Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 과일 절단과 비교했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 과일 | # 과일 가공 | #Larvae 추가되었습니다 | 처리 방법 | #Larvae 찾았습니다. | 처리 시간(분)* | % 회복 |
| 망고 | 25 | 25 | 절단 | 17 | 158 | 68% |
| 망고 | 25 | 25 | 국경없는의사회 | 22 | 113 | 88% |
| 파파야 | 16 | 20 | 절단 | 13 | 62 | 65% |
| 파파야 | 16 | 20 | 국경없는의사회 | 16 | 40 | 80% |
| *총 시간은 5명 이상의 근로자를 합산했습니다. | ||||||
표 1: 회수된 유충의 수와 절단 및 육안 검사(절단) 또는 전체 분쇄, 체질 및 부유(MSF) 방법에 의한 과일 처리 시간. 테스트 과일은 지루하고 뚜껑이 있는 과일(망고 5개 중 1개, 파파야 4개 중 1개)과 혼합된 5개의 세 번째 인스타 유충으로 수동으로 감염되었습니다.
| 과일 | # 과일 가공 | #Larvae 추가되었습니다 | 처리 방법 | #Larvae 찾았습니다. | 처리 시간(분)* | % 회복 |
| 망고 | 20 | 20 | 절단 | 10 | 66 | 50% |
| 망고 | 20 | 20 | 미시시피 | 19 | 44 | 95% |
| 파파야 | 16 | 20 | 절단 | 5 | 38 | 25% |
| 파파야 | 16 | 20 | 미시시피 | 17 | 25 | 85% |
| *총 시간은 4명 이상입니다. | ||||||
표 2: 회수된 유충의 수와 절단 또는 분쇄 및 체질만으로 과일을 처리하는 시간, 부유 생략(MS). 테스트 과일은 지루하고 뚜껑이 있는 과일(망고 5개 중 1개, 파파야 4개 중 1개)과 혼합된 5개의 세 번째 인스타 유충으로 수동으로 감염되었습니다.
| 작업자/방법 | 처리#Fruit | 처리 시간(분) | #Larvae 절단을 발견했습니다. | #Larvae MSF * 발견 | 절단을 통해 발견된 전체 유충의 % |
| 작업자 1 : 절단 | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| 작업자 2 : 절단 | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| 작업자 3 : 절단 | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| 작업자 4 : 절단 | 5 | 20 | 24 | ||
| 노동자 5: 국경없는의사회 | 10 | 22 | 해당 없음 | 22 | 해당 없음 |
| 노동자 6: 국경없는의사회 | 10 | 18 | 해당 없음 | 37 | 해당 없음 |
| * 절단 및 육안 검사에서 펄프는 MSF 방법을 사용하여 다시 처리하여 놓친 후기2-3 번째 instar 유충의 수를 결정합니다 | |||||
| ** MSF 방법을 사용하여 가공하기 전에 풀링된 작업자 2 및 3 과일의 펄프 | |||||
표 3: 열매를 절단하고 육안으로 검사(절단) 또는 열매를 으르렁거리고, 체질하고, 떠다니는(MSF) 통해 현장에서 채취한 구아바에서 발견된 유충의 수.
Discussion
우리의 목표는 현장에서 테프리티드 유충을 찾는 효율적이고 효과적인 방법을 개발하는 것이었습니다. 박멸 프로그램을 시작하거나 격리 구역을 설정하는 동기는 번식 개체군을 나타내는 짝짓기 암컷 또는 유충6의 탐지이다. 과일을 자르고 육안으로 검색하는 현재의 방법은 일반적으로 개별적으로 검사할 수 있는 것보다 더 많은 숙주 과일이 존재하기 때문에 유충을 찾는 데 비효율적입니다. 또한, 테프리티드의 개체수는 새로운 침입 지역에서 낮을 가능성이 높기 때문에 많은 양의 과일에서 유충을 찾는 것이 매우 어렵습니다. 예를 들어, 플로리다의 2015 Bactrocera dorsalis 박멸 프로그램에서 54 개의 다른 숙주 종이 확인되었고 4,000 개 이상의 과일이 절단되었습니다. 이 박멸 프로그램에서는 망고에서 소수의 유충만이 발견되었으며 다른 숙주는 감염된 것으로 발견되지 않았습니다6. 우리는 MSF/MS 방법이 과일 절단에 비해 대량으로 많은 양의 펄프(망고, 구아바, 파파야)가 있는 과일을 가공할 때 A. suspensa 및 B. dorsalis 유충을 검출하는 데 더 민감하고 빠르다는 것을 발견했습니다. 희귀 유충의 검출 증가와 함께 mushing 및 체질 방법을 사용하여 검사할 수 있는 숙주 과일의 양이 많을수록 감염이 조기에 발견될 확률이 높아질 수 있습니다. 번식 개체군을 조기에 발견하면 박멸 가능성이 높아지고 프로그램 비용이 절감 될 수 있습니다.
우리의 실험은 과일을 자르고 육안으로 검사하는 작업자가 발견 한 유충의 수가 상당히 다양하다는 것을 보여주었습니다. 과일을 자르는 노동자들은 망고와 파파야에 각각 넣은 B. dorsalis 유충의 50%와 75%를 놓쳤습니다. 대조적으로, 망고와 파파야 열매를 각각 처리하기 위해 MS 방법을 사용하여 유충의 5%와 15%만이 누락되었습니다. 마찬가지로, 입국항에서 과일 절단을 평가한 연구에서도 검사관이 발견한 감염된 과일과 유충의 수에 상당한 차이가 있는 것으로 나타났다8. 이 연구에 따르면 숙련 된 항만 검사관은 과일을 자르고 육안으로 검사했을 때 A. suspensa 유충의 64 % -99 %와 감염된 과일의 16 % -82 %를 놓친 것으로 나타났습니다8. 우리의 결과는 썩고 체질하는 방법이 작업자가 감염된 과일을 감지하지 못할 가능성을 줄일 수 있음을 시사합니다.
설탕과 뜨거운 물 부양은 체리와 블루베리에 초파리가 없도록 하기 위한 시스템 접근 방법에서 허용되는 프로토콜이다14. 선적물의 일부가 용액으로 분쇄되면 검사관이 설탕 용액 표면을 육안으로 스크리닝하여 알과 유충이 있는지 확인합니다. 개별 과일을 절단하는 것에 비해 더 많은 수의 과일을 가공할 수 있지만, 이러한 기술을 사용하여 유충을 발견할 확률은 여전히 검사관의 능력, 존재하는 유충의 단계와 수, 과일의 종류에 의해 영향을 받는다8. 우리는 다른 테프리티드와 마찬가지로 B. dorsalis와 A. suspensa가 과일 펄프에서 떨어져 표면으로 떠오르는 것을 발견했습니다. 흥미롭게도, 우리는 설탕 부양을 포함하여 형태학적으로 식별될 수 있기 때문에 비상 및 박멸 프로그램의 표적이 되는 더 큰 후기 인스타 유충의 경우 방법의 정확성을 증가시키지 않는다는 것을 발견했습니다. 실제로 부양 방법을 추가하면 파파야의 경우 처리 시간이 90%, 망고의 경우 48% 증가했습니다. 처리 시간이 길어지고 추가 재료(예: 물, 통, 설탕 등)가 필요하면 현장에서 큰 인스타를 검색할 때 이 단계를 추가하는 것이 운영상 지원되지 않습니다. 설탕 부양 방법은 입국항 및 포장 하우스와 같은 초기 별을 포함한 모든 단계를 감지하는 것이 목표일 때 적절할 수 있습니다. 미세한 메쉬 체로 설탕 용액을 여과하면 알과 초기 애벌레 instars11,12를 가장 정확하게 검출 할 수 있습니다.
MS 및 MSF 기술은 쉽게 으깬 과일과 잘 어울리고 많은 양의 과육이 있습니다. 테프리티드 유충은 과일 펄프에 파묻히는 경향이 있어 육안 감지가 어렵습니다. MS 및 MSF 방법의 중요한 측면은 펄프에서 유충을 분리하는 것입니다. 체질 과정은 펄프를 제거하여 체 스크린에 유충을 노출시킵니다. 유사하게, 설탕물 방법은 유충을 뜨게 하여 유충을 펄프에서 분리하고 펄프는 팬 바닥으로 가라앉습니다. MS 또는 MSF 방법에 의해 펄프로부터 분리된 유충은 체 스크린 또는 수면 상에서 이동하는 것을 쉽게 관찰할 수 있다. 머싱, 체질 및 선택적으로 부유하는 방법이 중요한 숙주 과일에서 테프리티드 유충을 검출하는 속도와 정확도를 크게 향상시켰지만 이 과정이 모든 과일에 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 녹색 아보카도와 같이 단단한 펄프가 있는 숙주 과일 또는 열대 아몬드와 같이 큰 종자/구덩이와 상대적으로 적은 양의 펄프가 있는 과일은 손으로 자르고 육안 검사를 통해 가공하기가 더 쉬울 수 있습니다.
우리는 MS 및 MSF 방법이 상대적으로 적은 수의 과일 (5-10)을 처리 할 때 더 빠르다는 것을 발견했습니다. 더 많은 양의 과일이 가공되면 그 차이가 더 커질 수 있으며, 이는 비상 초파리 프로그램의 필요하고 전형적일 수 있습니다. 부유 단계를 제거하면 큰 테프리티드 유충(>3mm)을 찾는 정확도를 손상시키지 않으면서 검출 속도가 더욱 빨라졌습니다. 우리는 이러한 기술을 현장으로 가져갈 수 있음을 보여 주었고, 이는 비상 초파리 프로그램 중에 근로자가 경험 한 조건을 시뮬레이션했습니다. 우리의 연구에 따르면 MS 방법은 후기 instar 유충의 적시 검출과 테프리티드 번식 개체군의 후속 박멸을 허용할 수 있습니다. 국경없는의사회는 현재 박멸 프로그램의 대상이 아닌 알과 초기 별을 탐지하는 데 사용될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
플로리다 대학교에서 구아바 가공에 도움을 준 실비아 듀란드, 테리 앨런, 호세 알레그리아, 알레한드라 캐논, 하와이에서 인위적으로 감염된 과일을 평가하는 데 도움을 준 릭 쿠라시마, 진 오트, 브루스 이나후쿠, 그리고 이전 버전의 원고에 대한 유용한 의견을 주신 마이클 스툴버그에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 USDA APHIS 및 University of Florida Cooperative Agreement에서 부분적으로 자금을 지원하고 USDA-ARS(프로젝트 2040-22430-027-00D)에서 부분적으로 지원했습니다. 이 예비 간행물의 결과와 결론은 USDA에 의해 공식적으로 배포되지 않았으며 기관의 결정이나 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 이 간행물에서 상호나 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 USDA의 권장 또는 보증을 의미하지 않습니다. USDA는 평등한 기회 제공자이자 고용주입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
