本文介绍了一种经济高效的检测精液中过氧化物酶阳性白细胞的实验方案。借助计算机辅助精液分析（CASA）系统，可在总计60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，有效提高了男科实验室及男科医生的工作效率。
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本文内容
摘要
摘要
白细胞精子症可导致精子运动能力下降、精子形态异常率升高、精子DNA碎片化指数增加、精子顶体功能受损，甚至影响胚胎发育。该病症在临床实践中是一种常见的男性生殖系统疾病，也是男性不育的重要病因之一。在判断是否存在男性生殖道炎症时，男科医生常选择检测精液中的圆细胞或精浆弹性蛋白酶作为临床诊断依据。然而，圆细胞检测易受到脱落的生精细胞及生殖道上皮细胞的干扰，无法有效减少抗生素的滥用和不必要的使用。同时，弹性蛋白酶的检测过程相对复杂、耗时较长、报告结果较慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断与治疗。我们创新性地将计算机辅助精液分析（CASA）系统辅助检测精液中过氧化物酶阳性白细胞的方法应用于白细胞精子症的诊断标准，成功解决了上述问题。该检测仅需将由四种试剂组成的操作液加入标本中，在室温下总反应时间可控制在20至30分钟内。随后进行涂片和显微镜检查，可在总计60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，用于判断是否存在男性生殖道炎症。
引言
不孕症已成为影响约15%育龄夫妇的全球性公共卫生问题。男性因素约占所有生育力低下病例的50%，其中近20%至30%的病例可完全归因于男性因素1,2,3。男性生殖道感染（MGTIs）是导致男性不育的重要原因之一，约占病例总数的15%4,5。
大多数个体的精液中存在白细胞，占非精子细胞的13%，其中中性粒细胞占12%，巨噬细胞占0.9%，淋巴细胞占0.1%6,7。根据世界卫生组织（WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版），白细胞精子症通常定义为精液中白细胞浓度超过>1 × 106 个/mL8。该病症可由多种因素引起，如环境毒素、药物滥用、精索静脉曲张、男性生殖道感染（MGTIs）等，这些因素均可能导致精液中白细胞浓度异常升高9。白细胞可提高精液中活性氧（ROS）水平，引发脂质过氧化以及对蛋白质和DNA的氧化损伤，从而导致精子活力下降、精子形态异常增加、精子DNA碎片化指数升高、精子顶体功能受损，甚至对胚胎发育产生负面影响10,11。
目前，男科医生在识别生殖道炎症时，通常选择检查精液中的圆细胞或精浆中的弹性蛋白酶。然而，脱落的生精细胞与生殖道上皮细胞往往难以区分，这不利于减少抗生素的滥用和不必要的使用6。后一种检测方法相对复杂且耗时较长，报告结果缓慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断与治疗。美国泌尿协会（AUA）建议，当精液分析中圆细胞浓度超过 1 × 106 个/mL 时，应进一步区分白细胞与生殖道脱落细胞12。一些男科实验室采用流式细胞术13 或白细胞抗原（如 CD45）免疫细胞化学染色14 来检测白细胞。尽管这些方法较为精确，但成本高且耗时，难以在临床上大规模推广，尤其是在发展中国家。
过氧化物酶广泛分布于多种类型的细胞中，在抵抗氧化应激损伤中发挥关键作用。髓过氧化物酶（MPO）是过氧化物酶亚家族的成员，通常在免疫细胞中表达，其中在中性粒细胞的嗜天青颗粒中表达水平最高15,16，也在淋巴细胞17,18、单核细胞和巨噬细胞19中表达。通过检测精液中过氧化物酶阳性的圆形细胞，可获得白细胞（尤其是中性粒细胞）的浓度7,20。为了使精液中白细胞的检测过程更经济、便捷和高效，我们对检测方法进行了改进。借助计算机辅助精液分析（CASA）系统，可在60分钟内获得白细胞浓度。该新方法降低了患者的检测成本和等待结果的时间，减轻了实验室技术人员的工作负担，并缩短了医生诊断和治疗的等待周期。
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方案
本研究已通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会的审查与批准。
1. 工作溶液的配制
- 准备以下试剂以配制工作液：邻甲苯胺底物溶液、饱和氯化铵（NH4Cl）溶液、148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA）溶液和 6%（v/v）过氧化氢溶液。将这些试剂与所需工具（如移液器（1000 µL、200 µL、10 µL）和试管架）一同放置于室温（RT）实验台上。
注意：操作上述试剂前，请阅读安全数据表（SDS）。 - 准备一个不透光的棕色试剂瓶，用于储存配制好的工作液，并避免其暴露于光照下。
- 按照以下指定比例，将试剂转移至不透光的棕色试剂瓶中：
- 使用 200 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 100 µL，然后将 100 µL 的 NH4Cl 溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中。
- 更换移液器吸头，使用上述 200 µL 移液器将 100 µL 的 148 mmol/L Na2EDTA 溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中，随后轻轻吹打混匀，并充分均质化溶液。
- 使用 1000 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 900 µL，然后将 900 µL 的邻甲苯胺底物溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中，轻轻吹打混匀，并充分均质化溶液。
- 使用 10 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 5 µL，然后将 5 µL 的 6%（v/v）过氧化氢溶液转移至不透光的棕色试剂瓶中。
- 使用 1000 µL 移液器，通过旋转调节旋钮将刻度调至 1000 µL。更换移液器吸头，轻轻吹打混匀，并充分均质化不透光棕色试剂瓶中的溶液。
- 将配制完成的工作液储存于不透光的棕色试剂瓶中，在室温下避光保存。该工作液在 24 小时内具有反应活性。
- 每个精液样本需使用 900 µL 工作液。确保每日配制的工作液量与当日检测样本数量相匹配。
2. 精液样本的制备
- 在采集精液样本前，应确保患者按照世界卫生组织（WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）8的要求，禁欲2至7天。推荐采用手淫方式获取精液样本。为提高检查的准确性，应指导患者收集全部射出的精液。
- 提前打开恒温台并预热至37 °C，以确保后续精液样本的液化过程顺利进行。
- 收到患者的精液样本后，应仔细记录详细信息，包括识别编号、采集时间、禁欲时长及其他相关信息，标注在聚合物材质容器的外壁上。
- 将盛有精液样本的聚合物容器置于已预热至37 °C的恒温台上，有助于精液的液化。
- 用聚合物材质的移液管吸取精液样本，每隔5分钟观察一次液化状态，直至精液完全液化。
- 若精液样本在30分钟内未完全液化，暂不进行检查；继续等待30分钟。若60分钟后仍未完全液化，可加入等体积的磷酸盐缓冲液进行1:1稀释，并轻轻振荡以促进液化。
- 充分振荡并均匀混匀后，保留已完全液化的精液样本，用于后续检查步骤。
3. 过氧化物酶阳性白细胞的染色及原始精液样本的分析
- 采样前，使用聚合物材质的移液器反复吹打，充分混匀待检测的精液样本。
- 使用200 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为100 µL。更换移液器吸头，然后将100 µL精液样本转移至离心管中。
- 使用1000 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为900 µL。更换移液器吸头，然后将900 µL上述工作液转移至离心管中。
- 使用1000 µL移液器反复吹打，充分混匀由精液样本与工作液组成的反应液。
- 将离心管放入试管架中，置于二维摇床上，在室温下以200 rpm持续振荡30分钟。
- 在等待染色反应的同时，使用CASA系统分析精液样本，测定聚合物容器中原始精液样本的精子浓度。
- 打开CASA系统的电源开关，双击SCA SCOPE图标以启动应用程序软件。
- 采样前，再次使用聚合物材质的移液器反复吹打，充分混匀原始精液样本。
- 使用10 µL移液器，通过旋转调节旋钮将量程设为10 µL。更换移液器吸头，吸取10 µL原始精液样本，加入SCA计数板中。静置60秒，待精液样本停止漂移。
- 将SCA计数板放置于CASA系统的样本载架上，在应用程序软件的对话框中输入患者信息，准备正式检测。
- 点击开始按钮，使用CASA系统检测SCA计数板中的原始精液样本，并记录必要的数据，如精子浓度。
4. 过氧化物酶阳性白细胞与精子的观察
- 使用 1000 µL 移液器，通过旋转刻度调节至 1000 µL。更换移液器吸头，反复吹打并充分混匀反应物，该反应物为 30 分钟反应过程结束时离心管中的精液样本与工作液的混合物。
- 使用 10 µL 移液器，通过旋转刻度调节至 10 µL。更换移液器吸头，吸取上述反应物 10 µL，转移至精子计数室中。最后，用专用盖玻片覆盖精子计数室。
- 将精子计数室置于显微镜载物台上，打开配备两个 10x 目镜的光学显微镜电源开关。随后等待 60 秒，使反应样本停止漂移。
- 在等待期间，将显微镜转换器切换至 10x 物镜。然后依次调节粗调旋钮和微调旋钮。最后在 10×10 倍放大倍数下观察精子和圆形细胞。
- 确定待分析视野后，将显微镜转换器切换至 40x 物镜，在 10 × 40 倍放大倍数下观察精子和呈棕色的过氧化物酶阳性白细胞。
- 使用电子计数系统，在相应视野内至少计数 200 个精子以及棕色过氧化物酶阳性白细胞的数量。
5. 过氧化物酶阳性白细胞浓度的计算
- 通过使用以下公式计算过氧化物酶阳性白细胞的浓度：
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结果
实施上述操作后，离心管中的反应物通常呈现半透明、乳光状外观（图1）。若观察到明显的棕色，则提示白细胞可能发生脱颗粒，可能导致液体着色。因此，染色过程可能失败，需重新染色或采集新的精液样本重新检测21。
过氧化物酶阳性的白细胞呈棕色，与未染色的普通圆形细胞形成对比（图2，普通载玻片）。随后，在转换至一个全新的视野进行连续观察和计数之前，需对当前显微镜视野下的每个精子和棕色白细胞进行计数。为确保最佳准确性，必须计数至少200个精子以及相应视野中存在的白细胞。
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讨论
邻甲苯胺和过氧化氢具有光敏性，暴露在光线下可能发生分解。为确保检测试剂的有效性，建议将配制好的工作液保存在避光处。
精液样本通常表现出异质性特征。在精液样本制备过程中，正确判断精液的液化状态，并在每次取样前充分均质化精液样本，对于提高检测结果的可靠性至关重要。精液样本通常在15分钟内完全液化。若超过60分钟仍未完全液化，应考虑采用机械均质或酶消化处理。在液化过程中，使用二维摇床持续轻轻振荡样本容器，可获得更均匀的精液样本8。
本文介绍的检测方法具有操作简便、快速且成本低廉的优点。然而，在某些情况下该方法可能存在局限性：过氧化物酶储存在嗜天青颗粒中，当细胞活化时，会通过脱颗粒或胞吐作用将酶释放到细胞外间隙21,22。因此，中性粒细胞可能无法被染色，从而难以识别。在此类情况下，需重复染色过程，甚至要求患者重新提供精液样本进行复检。为尽量减少此类情况的发生，建议尽可能使...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢中山大学附属第三医院生殖医学中心男科实验室为本研究提供了实验设施。本文撰写过程中未涉及任何资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) 溶液 | 深圳华康生物医学工程有限公司 | 20230301 | 试剂 B |
| 6% (v/v) 过氧化氢溶液 | 深圳华康生物医学工程有限公司 | 20230301 | 试剂 D |
| 自动精子分析仪 – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996；型号：SCA-SCOPE-H | 计算机辅助精液分析 (CASA) 设备 |
| 一次性离心管 (1.5 mL) | 浙江拱东医疗器械有限公司 | 2210009 | 染色过程用离心管 |
| 一次性移液管 (3 mL) | 江苏康健医疗用品有限公司 | 20221101 | 聚合物材质移液管 |
| 电子计数器 | 无 | 无 | 多通道计数器 |
| 电子天平 | 上海良平仪器仪表有限公司 | D9008084 | 最大称量 = 100 g，e = 10 d，d = 0.01 g |
| Makler 计数板 | Makler | MQ30004 | 0.01 平方毫米，深度 10 μm |
| 光学显微镜 | Olympus | 3G41067201307 | CX31，10×40 |
| 邻甲苯胺底物溶液 | 深圳华康生物医学工程有限公司 | 20230301 | 试剂 C |
| 移液器吸头 (1 mL) | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | 02923205 | 每单位 1000 个吸头，每箱 5 单位 |
| 移液器吸头 (10 µL) | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | 00323961 | 每单位 1000 个吸头，每箱 20 单位 |
| 移液器吸头 (200 µL) | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | 32822810 | 每单位 1000 个吸头，每箱 20 单位 |
| 饱和氯化铵 (NH4Cl) 溶液 | 深圳华康生物医学工程有限公司 | 20230301 | 试剂 A |
| SCA 计数板 | Microptic S.L. | 102230608 | 厚度 10 µm，双腔 |
| 精液样本容器 | 江苏康健医疗用品有限公司 | 20230701 | 用于精液样本的聚合物材质容器 |
| 恒温台 | 深圳市妙泉仪器有限公司 | MQ30004 | MQ-300 |
| 移液管 (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| 移液管 (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| 移液管 (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| 二维摇床 | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
参考文献
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