Summary

原代小鼠视网膜神经胶质 Müller 细胞的分离

Published: August 30, 2024
doi:

Summary

本手稿描述了从小鼠眼睛中分离视网膜神经胶质 Müller 细胞的详细方案。该方案从小鼠眼睛的摘除和解剖开始,然后是 Müller 细胞的分离、接种和培养。

Abstract

视网膜的主要支持细胞是视网膜神经胶质 Müller 细胞。它们覆盖整个视网膜表面,并且靠近视网膜血管和视网膜神经元。由于它们的生长,Müller 细胞在健康的视网膜中执行几项关键任务,包括神经递质、视黄酸化合物和离子(如钾 K+)的摄取和回收。除了调节血液流动和维持血视网膜屏障外,它们还调节新陈代谢和视网膜的营养供应。本手稿介绍了分离原代小鼠 Müller 细胞的既定程序。为了更好地了解各种眼部疾病小鼠模型所涉及的潜在分子过程,Müller 细胞分离是一种很好的方法。本手稿概述了从小鼠中分离 Müller 细胞的详细程序。从去核到播种,整个过程持续大约几个小时。接种后 5-7 天内,不应更换培养基,以使分离的细胞不受阻碍地生长。接下来使用形态学和不同的免疫荧光标记物进行细胞表征。细胞的最大传代次数为 3-4 次。

Introduction

Müller 细胞 (MCs) 是在视网膜组织中发现的主要和最丰富的神经胶质细胞。它们是在视网膜内提供结构完整性和代谢功能的关键参与者1。MC 的战略结构分布在整个视网膜厚度上,从而为视网膜提供支持。除了支架状特性外,它们还具有视网膜神经元的代谢功能,为它们提供能量底物,包括葡萄糖和乳酸。这些功能对于维持健康的神经元功能至关重要。据报道,受损的 MC 会导致各种视网膜疾病,包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和青光眼 2,3。MC 可以是视网膜再生治疗的内源性细胞来源1。它们也构成了视网膜的很大一部分,强有力的证据表明,在几个物种中,这些细胞可以被刺激以替代缺失的神经元2。它们与神经元有益地合作,圆锥形分支的 Müller 细胞末端密集地展开血管并连接视网膜的神经成分。为了维持神经元发育和神经元可塑性,Müller 细胞充当神经元的软基质,保护它们免受机械损伤3。此外,在病理情况下,Müller 细胞可能会分化为神经祖细胞或干细胞,复制或再生丢失的光感受器和神经元 2,3,4。Müller 细胞保留了视网膜干细胞的特性,包括不同程度的自我更新和分化潜力 5,6。Müller 神经胶质细胞具有重要的视网膜谱系,可产生神经营养因子、摄取和回收神经递质、在空间上缓冲离子并维持血视网膜屏障,以保持视网膜处于体内平衡 7,8,9。这凸显了 Müller 细胞作为治疗视网膜变性相关疾病的细胞疗法中一种有前途的工具的潜力。Müller 细胞是分布在整个视网膜中的原代神经胶质细胞,与神经元和血管相连。它们起着至关重要的保护作用,提供必要的结构和代谢支持,以维持视网膜细胞的活力和稳定性。遗憾的是,在文献中发现的从视网膜中分离原代 Müller 细胞的方案很少 10,11

我们提出了一种可靠的分离和培养小鼠原代 Müller 细胞的增强方法。我们小组使用该方案从野生型 C57BL/6 小鼠和转基因小鼠中分离 Müller 细胞12,13。年龄在 5 至 11 天之间,无性别偏好的小鼠用于该方案。细胞已传代多达 4 次;然而,在 P4 时,它们不再粘附在培养瓶上,因此很难培养出健康的培养物。培养物通常被视网膜色素上皮 (RPE) 细胞污染,因此在对细胞系进行任何其他实验之前,细胞应至少传代一次。传代允许进一步分离污染物。因此,提出的方案提供了一种快速有效的方法来分离小鼠 Müller 细胞,然后可以将其用作研究治疗靶点和评估视网膜疾病潜在治疗方法的可靠平台14

Protocol

所有动物实验均符合 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明,并按照动物护理和使用研究所委员会 (IACUC) 和奥克兰大学政策(协议编号 2022-1160)批准的动物协议进行 1. 培养基和溶液制备 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM,材料表中的详细信息)中补充 1:1000 稀释的青霉素/链霉素来制备 Müller 细胞眼溶液。例如,对于 10 mL 的 DMEM,添加 10 μL ?…

Representative Results

验证分离的 Müller 细胞的特异性、纯度和屏障功能为了确认分离的 Müller 细胞的活力、形态和独特品质,在光学显微镜下检查了这些细胞。记录 P0 和 P1 图像(图 1A)。为了检查分离的 Müller 细胞是否受到 RPE 细胞的污染并确认其纯度,使用对 RPE 细胞标志物 RPE65 具有特异性的抗体进行免疫荧光染色 (IF)。人视网膜色素细胞 (ARPE -19) 用作阳性对照。RPE65 ?…

Discussion

我们实验室先前记录了从小鼠中分离出原代视网膜色素上皮 (RPE)。本手稿描述了原代 Müller 细胞分离的详细演示方案。该程序包括从小鼠眼睛中分离的 Müller 细胞的摘除、处理、解剖、收集、接种、培养和表征。它基于先前在早期出版物中发现的成功方案以及我们在最近出版物中使用的修改后的方案12,13.虽然步骤很简单,但成功…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了国家眼科研究所 (NEI)、国家眼科研究所 (NEI) 基金 R01 EY029751-04 的支持。我们要感谢 Sylvia B. Smith 博士,因为该方案是基于她的 Müller 细胞分离方案的修改版本。

Materials

Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase IV  Worthington  LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM (1X)  Thermo Scientific 11885084 Media to grow Müller cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase Cell signalling 80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Pen Strep gibco 15140-122 For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS) Thermo Scientific J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Vimentin  invitrogen MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

References

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Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P., Abdelkarim, R., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Glial Müller Cells. J. Vis. Exp. (210), e66237, doi:10.3791/66237 (2024).

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