通过高通量免疫磁珠分离从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞

外周血单核细胞 （PBMC） 分离是一种将淋巴细胞和单核细胞与其他全血成分分离和分离的技术。PBMC 是一种用途广泛的细胞类型，可用于多种应用，包括但不限于免疫疗法、疫苗开发、靶标或生物标志物鉴定以及抗体/小分子药物开发 ^1,2。这些细胞可以从健康或患病个体中分离出来，可以立即用于下游工艺或冷冻保存以备将来研究³。在某些情况下，下游目的已知，而在其他情况下，如生物样本库的常见情况，PBMC 被分离并储存起来以备将来未指定的应用⁴。

密度梯度离心是从全血中分离 PBMC^5、6、7 的传统技术，利用离心过程中基于细胞密度的组成细胞类型的差异分离。虽然这种方法可能存在一些变化，但全血通常用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释，在专用或标准离心管中的密度梯度介质上分层，然后旋转。结果有四个不同的层:顶层血浆富含血小板，密度梯度培养基上方有一层薄的 PBMC，最后，底层由红细胞 （RBC） 和粒细胞组成。尽管这种方法以前被称为"金标准"⁸，但放大生产存在局限性，例如处理时间长、离心机容量大、难以分装其他血液制品（即血浆和红细胞）以及难以实现自动化。虽然这种方法⁹ 可以实现自动化，但它确实需要对液体处理器进行全面编程（离心模块完全自动化），并且仍然是一个漫长的过程。

此后，提出了一种替代工作流程，该工作流程使用免疫磁珠分离，使用八支架磁力架进行手动处理，或使用仪器进行全自动处理。该方法利用添加到细胞中的抗体混合物并结合不需要的细胞群，在本例中为血小板、粒细胞和红细胞。随后通过磁分离去除这些不需要的细胞群，留下阴性组分中的单核细胞和淋巴细胞群，这些细胞群可用于下游处理¹⁰。这种阴性选择方法比阳性选择方法更快，后者需要额外的步骤才能从 PBMC 中去除抗体和磁珠复合物。阴性选择还具有优势，因为它已被描述为保持细胞功能的一种方式^11,12。

质量控制血液标本和内部生成的数据（例如细胞计数、活力和处理时标本的年龄）来自皇家阿尔弗雷德王子医院新南威尔士州卫生全州生物银行的同意研究（HREC 批准:2019/ETH06776）。在 EDTA 管中收集经过处理（即血浆耗尽）、未筛查和去识别化的成人血液样本。这些质控血液标本在采集后不到 72 小时内进行处理，并用于比较密度梯度和基于磁珠的方法的 PBMC 分离实验。有关代表性结果中使用的密度梯度分离方法，请参见 补充文件 1 中的程序。用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 全血制备

1. 在室温下轻轻倒置 10 mL 全血管（包被乙二胺四乙酸 [EDTA]、酸-柠檬酸盐-葡萄糖 [ACD] 或肝素锂）10 次。
2. 可选:如果要储存全血，请分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。
3. 使用水平转子在 22 °C 下以 800 x g 离心试管 10 分钟，同时打开制动器（9 加速/9 减速）。

2. Buffy 外套系列

1. 离心后，将样品放入生物安全柜中，检查三个不同的层（如图 1 所示）。
   注意:红细胞位于离心管的下部深红色层中。包含白细胞和血小板的白色不透明层位于 RBC 层上方，称为血沉棕黄层。顶部黄色层包含等离子体。
2. 可选:如果要储存血浆，请将血浆分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。
3. 从 10 mL 采血管中吸取 1 mL 血沉棕黄层（起始材料），然后转移到分别在步骤 3.1 和步骤 4.1 中指定和标记的试管中，用于手动和自动方法。使用移液器吸头旋转血沉棕黄层（白色不透明层），并通过吸出收集血沉棕黄层。
   注:抽吸过程中血浆和红细胞少于 100 μL 是可以接受的。如果为一名参与者收集了多支血管，则可以合并血沉棕黄层;但是，这可能会影响血小板浓度¹³。
4. 对于手动处理，请继续执行第 3 部分。对于自动处理，请继续执行第 4 部分。
5. 可选:如果要储存红细胞，请将红细胞分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。

3. PBMC 纯化 - 手动方法

注:每个磁体架最多可由一名操作员处理 8 个样品。

1. 用字母 A-C 标记 3 x 5 mL 聚苯乙烯管。
   注:如果执行多个样品，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C，请使用顺序编号。
2. 将 60 μL 的 0.1 M EDTA（EDTA 终浓度为 6 mM，pH 值为 8.0，参见 配方补充文件 2 ）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。
3. 将 50 μL 鸡尾酒混合管（参见 材料表）添加到管 A 中，通过上下吹打至少 3 次混合，并在室温下孵育 5 分钟。
4. 将 890 μL PBS 添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。
5. 涡旋磁珠管（参见材料表）30 秒。
6. 将 50 μL 磁珠添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。
7. 立即将试管 A 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。
8. 小心地将富集的细胞悬液移液到试管 B 中，收集不含/少量 （<100 μl） rbc 的透明组分，以实现最佳的 pbmc 回收率。
   注意:请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。
9. 从磁铁架上取下管 A 并丢弃。
10. 将 50 μL 磁珠添加到试管 B 中的细胞悬液中，并通过上下吹打至少 3 次混匀。
11. 立即将试管 B 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。
12. 小心地将富集的细胞悬液移液到管 C 中，仅收集透明组分。
    注意:请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。
13. 从磁铁架上取下管 B 并丢弃。
14. 立即将试管 C 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。
15. 小心地将富集的细胞悬液移液到标记的离心管中，并用 PBS 加满至 2 mL。
16. 将 50 μL 细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。对于 1:10 稀释的细胞计数，添加 450 μL PBS。继续第 5 节了解细胞计数步骤。

4. PBMC 纯化 - 自动化方法

注: 一台自动化 PBMC 仪器最多可处理 4 个样品。单个操作员可以并行运行多台仪器。

1. 用字母 A 和 B 标记 2 x 14 mL 离心管，用字母 C 标记 1 x 50 mL 离心管，用"废液"标记 1 x 50 mL 离心管。
   注:在自动化 PBMC 仪器上每次运行只需要一个废液容器。如果执行多个样品，请使用 Sequences，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C。
2. 将 60 μL 的 0.1 M EDTA（最终 EDTA 浓度为 6 mM）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。
3. 涡旋磁珠管（参见材料表） 30 s。
4. 通过打开仪器前部的电源来打开自动 PBMC 仪器。
5. 在自动 PBMC 仪器主屏幕上，选择 Profile（ 配置文件 ）并选择所需的方案。
   注: EasySep Direct 人 PBMC 分离 19654 - 血沉棕黄层 是为此 PBMC 分离选择的方案配置文件。请参阅协议报告¹⁴ 中此配置文件的制造商标准程序。
6. 输入起始体积（吸入试管 A 中的血沉棕黄层量），并对每个样品重复上述步骤。
7. 选择将使用相同试剂盒的所有象限。
   注:如果对多个象限使用相同的方案，自动 PBMC 仪器将建议对所有象限¹⁴ 使用相同的试剂盒。
8. 将带标签的耗材、滤光片吸头和缓冲液容器装入仪器的转盘中。包含磁珠管和混合物管的试剂盒将加载到象限 1 中。
   注:仪器将询问用户是否希望对所有象限使用 1 个试剂盒。选择"是"并使用试剂盒突出显示所有象限。
9. 上样完成后，取下耗材和试剂的盖子，然后在仪器屏幕上选择运行。
10. 运行完成后，从仪器转盘中选择 卸载 和取出样品（包含试管 C 中标记的 PBMC 悬浮液）。将磁珠管、混合物管和缓冲容器储存在 4 °C 下。 丢弃标记为 A、B 和废液的试管（参见步骤 4.1）和过滤吸头。
    注:自动化方法无需加注 PBS，因为 PBMC 悬浮液产生的最终体积为 7 mL。
11. 将 500 μL 细胞转移到样品杯中，进行不稀释细胞计数。继续第 5 部分进行细胞计数。

5. 细胞计数

1. 按照制造商的说明¹⁵ 使用台盼蓝染料排除法进行细胞计数和活力。
   注:对于作者的内部过程，使用具有以下设置的自动细胞计数器进行细胞分析，以获取 PBMC。
   稀释因子 = 10（对于手动方案，如果细胞悬液体积较低）或 1（对于自动方案）
   细胞类型:PBMC
   浓度范围 = 5 x 10⁴ 至 1 x 10⁷ 个细胞/mL
   尺寸范围（直径）= 8 μm 至 50 μm
   图像数量 = 50

6. 冻存制备

1. 在22°C下以300 x g 离心（使用摆动桶转子）样品管8分钟，同时打开制动器（9加速/ 9减速）。
2. 离心后，将样品放回生物安全柜中。
3. 使用移液管小心去除上清液。PBMC 沉淀可以留下少量上清液，以确保其不受干扰。
4. 将沉淀重悬于 3 mL 冷冻存培养基中。缓慢而轻柔地上下混合悬浮液，直到均匀。
   注:Cyropreservation 培养基的体积可以根据所需的最终 PBMC 浓度进行调整。
5. 将 1 mL 重悬的 PBMC 分配到预先分配的冻存管中，并将其置于控制速率冷冻容器中，在 -80 °C 下至少 4 小时。
   注意:等分到每个冷冻管的 PBMC 的体积可以根据研究者的偏好进行调整。
6. 将冻存管在 -80 °C 下存放至少 4 小时后，将冻存管转移到液氮气相罐中进行长期储存。

7. 统计数据分析

1. 使用 补充文件 3 中指定的统计和绘图软件分析代表性结果数据。

当使用基于微珠或密度梯度分离方法分离 PBMC 时，测量 PBMC 分离前（即全血中）和分离后淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例。两种方法均显著富集淋巴细胞和单核细胞的比例（图 2A、B）。此外，在通过基于微珠的方法分离的 PBMC 中，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞（即粒细胞）的比例显着降低（图 2C-F）。密度梯度和基于微珠的方法之间淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞的比例没有显著差异（图 2）。此外，还计算了上面列出的细胞类型的回收率百分比（参见补充图 1）。两种方法的平均细胞活力均超过 95%，并且没有显着差异（图 3A）。还使用 8 μm 至 50 μm 的尺寸范围（直径）对 PBMC 进行计数，其中密度梯度分离方法产生的细胞总数大约高出两倍（图 3B）。

接下来，将基于磁珠的自动方法与手动方法进行了比较。使用手动或自动方法未发现细胞活力（图 4A）或总细胞计数（图 4B）的显著差异。比较了处理这 8 个样品的时间，包括无需人工干预的免提时间。8 个样品的总处理时间为 43 min ，而 8 个样品的总处理时间为 43 min。手册 57 分钟 vs.自动化方法。自动化方法包括 35 分钟的免提处理（图 4C）。

PBMC 分离的基于微珠的工作流程（全血和血浆等分）进行了 9 个月的试点，其中前 820 名参与者使用手动平台从未经筛选的人血中分离 1410 个 PBMC 样本，然后在接下来的 590 名参与者使用自动化方法。根据研究验收标准，处理在采集当天或采集后最多 10 天内进行，处理延迟主要是由于样品运输时间。使用手动或自动方法，在收集后 24 小时内处理的 PBMC 具有最高的活力和回收率（图 5）。5 天内加工的 PBMC 的平均细胞活力为 >90%，10 天内加工的 PBMC 的平均细胞活力为 >70%（图 5A）。与在 24 小时内处理的标本相比，5 天后平均 PBMC 产量下降了 50%（图 5B）。

图 1:从血沉棕黄层中分离微珠的 PBMC 方案的示意图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:通过密度梯度和基于微珠的方法分离 PBMC 前后全血中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞的比例。匹配全血 PBMC 前分离（正方形）和分离后通过密度梯度（空心圈）或基于珠子（闭合圈）方法 （n = 8） 确定的 PBMC 中淋巴细胞 （A）、单核细胞 （B）、中性粒细胞 （C）、嗜酸性粒细胞 （D）、嗜碱性粒细胞 （E） 和粒细胞 （F） 的百分比。ns = 不显著，*p < 0.05，由单因素方差分析（A 和 B）或 Friedman 检验 （C- 确定）F） 的请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:通过密度梯度和基于磁珠的方法分离的 PBMC 的活力和总细胞计数。 （A） 使用密度梯度（正方形、深色条）处理的样品的平均 （± SD） 细胞活力与基于 beads（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。ns = 配对 t 检验不显著。（B） 使用密度梯度（正方形、深色条）处理的样品的总细胞计数 与基于 beads（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。*p < 0.05 使用配对 t 检验确定。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:手动和自动基于微珠的方法的比较。 （A） 使用手动（正方形、深色条形）处理的样品的平均 （± SD） 细胞活力与基于 Beads 的自动化（圆圈、Open Bar）方法，用于 8 个配对样品。ns = Mann-Whitney 检验不显著。（B） 使用手动（正方形）处理的样品的总细胞计数 与基于 8 个配对样品的基于微珠的自动化（圆圈）方法。ns = 配对 t 检验不显著。（C） 使用手动处理的 8 个样品的处理时间 与自动化方法，包括手动操作（浅色条形）和无需干预的时间段（深色条形）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:根据样品采集和 PBMC 储存之间的时间，手动或使用自动化方法分离的 PBMC 的活力和产量。 （A） 使用手动（深色条）处理的参与者样品的平均 （± 95% CI） 细胞活力与基于微珠的自动化（Open Bar）方法。详细说明参与者编号的表格。ns = 不显著。na = 不适用。*p < 0.05（通过 Tukey 多重比较检验）。（B） 使用手动（深色条形）处理的参与者样品的总细胞计数 与基于微珠的自动化（Open Bar）方法。详细说明参与者编号的表格。ns = 不显著。na = 不适用。*p < Tukey 多重比较检验的 0.05。由于重复数小于 3，因此 Automated Day 10 没有值。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1: 使用密度梯度和基于磁珠的方法获得的差异细胞百分比回收图。 使用密度梯度法（正方形、暗条形）和基于磁珠的方法（圆圈、开放条形）（n = 8）使用全血分离前的绝对细胞计数和分离后的细胞悬液计算百分比。ns = 不显著，*p < 0.05，由未配对 的 t 检验确定。 请点击此处下载此文件。

补充文件 1:密度梯度协议。请点击此处下载此文件。

补充文件 2:在 PBS 中制备 0.1 M EDTA，pH 值为 8.0。请点击此处下载此文件。

补充文件 3:为生成代表性数据而执行的详细过程。请点击此处下载此文件。

作者声明没有利益冲突。