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基于薄层色谱-直接生物自显影技术的生物测定导向天然产物生防活性成分鉴定

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DOI：

10.3791/66967

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2024年7月26日

 ,  ,  , 
1Charlottetown Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2Department of Chemistry, University of Prince Edward Island, 3Saskatoon Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

本文内容

摘要

我们描述了使用薄层色谱直接生物自显影法和液相色谱-质谱联用技术，以植物病原真菌Sclerotinia sclerotiorum和具有生物杀虫活性的Bacillus菌株作为模式系统，鉴定对真菌病原体具有拮抗作用的微生物天然产物。

摘要

薄层色谱-直接生物自显影（TLC-DB）是一种成熟的生物活性检测方法，用于分离和鉴定对特定病原体具有拮抗作用的天然产物（NPs）。该方法快速、经济且操作简便，通过薄层色谱（TLC）分离后直接将目标病原体接种于色谱板上，以检测其生物活性，是天然产物生物导向分离与鉴定的有效手段。该技术通常用于分析具有生物活性的植物提取物，检测其对细菌、真菌及酶的抑制活性。尽管如此，该方法在细菌来源天然产物的发现中具有巨大潜力，尤其适用于评估细菌产生的天然产物对重要农业病原体的抑制作用，对于发现和开发新型生物农药具有重要意义。此外，该方法具有良好的可调性，可灵活应用于其他目标病原体或天然产物来源的研究项目中，以支持生物活性化合物的发现与鉴定。本文中，我们描述了一种利用TLC-DB技术发现和鉴定以芽孢杆菌属（Bacillus spp.）为来源、针对农业病原菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的生物农药天然产物的模型系统。

引言

真菌类农业病原体在全球范围内导致农作物品质下降和产量损失，加剧了全球粮食生产体系在经济和供应方面的挑战1,2。可通过培育抗感染的作物品种以及采用综合作物管理系统（包括轮作和土地管理措施）来抑制病原体的增殖，从而预防病原体造成的损害3,4。尽管这些方法能够减少作物损害，但通常仍需同时使用化学农药，以直接杀灭田间真菌的繁殖结构，进一步防止损害和产量下降。虽然化学农药有效，但其使用存在诸多弊端，包括对周边生态系统的破坏、土壤肥力下降、相关的人体健康风险，以及病原体抗药性的产生，后者导致每年需使用更高剂量的农药5,6,7。

基于微生物的病虫害管理产品长期以来被视为合成农药的潜在替代品或补充手段。自20世纪初以来，Bacillus thuringiensis 已被广泛用于农业病虫害和病原体的防治，可通过种子处理、叶面喷雾以及直接土壤处理等方式施用8。这类产品被称为生物农药，其特征是天然存在的微生物或生物化学物质，能够杀死、抑制或削弱特定害虫或病原体的活力。生物农药可通过多种机制抑制病原体的生长，但最常见的是通过分泌次级代谢产物来实现9。次级代谢产物通常被称为天然产物，不参与基础代谢，而是作为一种进化优势产生，以在竞争中胜过其他微生物10。

与合成农药相比，生物农药具有诸多优势。与合成害虫管理产品相比，其对环境、动物和人类的毒性风险较低9,10。由于大多数生物农药已在自然环境中存在数千年，环境中已存在可降解微生物代谢产物的生物降解途径，从而限制了土壤或生态系统污染的可能性，并缩短了残留时间，而残留时间正是导致合成农药对环境破坏严重的重要因素11。此外，许多用于控制病原体感染的生物农药还具有促进植物生长的特性，可提高养分的生物可利用性，并诱导植物系统抗性12。

最常见的是，生物农药以微生物接种剂的形式施用，而纳米颗粒由活的微生物分泌。 原位12,13在这种情况下，确定生物农药活性的来源具有重要价值。这不仅有助于阐明生物农药的作用机制，还能为微生物的专利保护提供依据，如果其结构具有新颖性，还可能产生重要的科学影响。然而最重要的是，确定生物活性来源能够指导后续生物农药产品的剂型开发。如果天然产物（NP）本身具有活性，则可利用该微生物作为生物分子工厂，用于大规模生产生物农药。此外，许多已被研究用于生物防治的天然产物在人类医学领域也具有潜在应用价值，从而进一步提升其经济价值8.

薄层色谱-直接生物自显影（TLC-DB）分析是一种经济、简便的方法，可用于生物活性导向分离与鉴定具有生物农药活性的代谢产物。尽管该技术常用于从粗植物提取物中分离并检测植物化学成分的生物活性，但在微生物提取物分析方面也具有广阔的应用潜力。14薄层色谱法（TLC）可对微生物粗提物中的天然产物（NPs）实现快速且经济的分离，经病原菌悬浮液涂布后，含有活性代谢物的区域可被清晰观察。可将这些区域从板上刮下并进行提取，随后通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行化学分析，以鉴定已知的代谢物。对于与已报道化合物不匹配的代谢物，可进一步大量分离纯化 通过 采用液相色谱法进行分离，随后利用核磁共振波谱和X射线晶体学等技术开展结构解析研究15.

本文介绍了一种利用薄层色谱-生物检测法（TLC-DB）发现和鉴定以芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和农业病原菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为测试菌的生物农药天然产物的模型系统。图1展示了TLC-DB实验流程的示意图。

色谱过程示意图；包括样品制备、分液漏斗、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）分析。
图1：TLC-DB 方法步骤4-7的示意图概览。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 选择微生物生防候选菌株

  1. 使用竞争平板实验，筛选出对目标病原菌具有拮抗作用的微生物分离株。
    注意：九 芽孢杆菌属 对……表现出拮抗作用的分离株 S. sclerotiorum 包括被选中的 枯草芽孢杆菌黑色变种、摩氏芽孢杆菌 和 subtilis 物种，以演示本实验方案。

2. 培养基制备

  1. 通过将每升水中溶解 39 g 培养基，制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。
  2. 通过将每升水中加入 45 g 培养基，制备假单胞菌F琼脂（Pseudomonas F agar）。
  3. 通过将每升水中加入 24 g 培养基和 0.24 g 琼脂，制备含 1% 琼脂的马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）。
  4. 制备酵母-葡萄糖-锰（YGM）肉汤。配制缓冲液：将 2.5 g KH2PO4 和 2.5 g K2HPO4 溶于 100 mL 水中；配制盐溶液：将 0.58 g MnSO4.H20、0.5 g NaCl 和 0.05 g FeSO4.7H20 溶于 100 mL 水中。
    1. 然后加入 1 g 酵母提取物、1.25 g 葡萄糖、400 mL 水、5 mL 缓冲液、5 mL 盐溶液以及 90 mL 水，以确保金属盐在溶液中不发生沉淀。
  5. 将培养基进行高压灭菌，倒入 100 × 15 mm 的培养皿中，所有培养基冷却至室温后方可使用。

3. 病原体制备

  1. 在PDA培养基（步骤2.1中制备）上培养五块Sclerotinia sclerotiorum菌株，并于25 °C下培养3天。

4. 天然产物提取物的制备

  1. 将每种细菌分离物接种于假单胞菌F琼脂培养基（按步骤2.2制备）上培养，直至观察到单个菌落。
  2. 挑取单个细菌菌落，接种至含有25 mL YGM培养基的离心管或培养管中，振荡培养3天。
  3. 取5 mL上述培养物转移至1 L YGM培养基中，在相同条件下继续培养3天。
  4. 在25 °C条件下，以3000 × g 离心15分钟，使菌体沉淀。
  5. 倾去上清液，并用乙酸乙酯洗涤沉淀物三次，以从培养基中提取代谢产物。
  6. 合并各次乙酸乙酯层，使用旋转蒸发仪干燥。
  7. 将提取物重新溶解于少量甲醇中，转移至小玻璃闪烁瓶内，再次通过旋转蒸发干燥。
    注意：若提取物干燥后呈油状或树脂状，需进行冷冻干燥以获得可准确称重的干燥粉末。

5. 薄层色谱板的制备

  1. 取一块20 cm × 20 cm的薄层色谱板，在板底部上方2 cm处和顶部下方2 cm处各画一条线。在底部的线上，每隔2 cm标记一个点，共标记九个点。在顶部线的上方，每隔4 cm标记一个点，共四个点。
  2. 将每种提取物各5 mg溶于15 µL甲醇中，用移液器取5 µL每种提取物溶液点样于底部线上标记的九个点上。待每个样品点在薄层色谱板上干燥后，再向同一位置点加5 µL等份溶液。重复此操作，直至所有样品完全上样至薄层色谱板。
  3. 将薄层色谱板放入展开槽中，使用体积比为1:2的二氯甲烷-甲醇溶液进行展开，直至溶剂前沿到达距板顶部2 cm的标记线处（约需45分钟）。
  4. 展开完成后，取出薄层色谱板，并将一系列阳性对照品点样于溶剂前沿线上方标记的四个点上。使用同一对照品的四个不同浓度作为阳性对照。对于S. scl.，阳性对照分别为0.5 µg/mL、5 µg/mL、50 µg/mL和500 µg/mL的潮霉素B。
  5. 在所有溶剂从板上完全挥发之前，将薄层色谱板放入经乙醇灭菌的薄层色谱板盒中。

6. 直接生物自显影实验

  1. 将实验所需的材料（色谱喷雾器的玻璃部件、金属刮刀、四张纸巾、纤维素纸或滤纸、水和培养基）放入一个用锡箔纸覆盖的大烧杯中进行高压灭菌。
    注意：纸质材料（纸巾、纤维素纸）应包裹在锡箔纸中，以防止在高压灭菌过程中受潮。
  2. 使用经乙醇灭菌的聚四氟乙烯（PTFE）管将气源、压力表和色谱喷雾器连接起来。在色谱喷雾器与压力表之间连接一个HEPA过滤器。
  3. 用无菌金属刮刀收集五块病原菌平板上的菌丝垫，并转移至50 mL离心管中。
    注意：如有需要，可加入少量液体培养基帮助松动菌丝，并用无菌移液器转移。
  4. 向50 mL离心管中加入25 mL添加了琼脂和无菌玻璃珠的PDB培养基，涡旋振荡5分钟，以打散菌丝垫。
  5. 使用带针头的无菌注射器将菌丝悬液转移至色谱喷雾器中，以确保较大的菌丝碎片不会堵塞喷雾器。
  6. 将预先制备好的薄层色谱（TLC）板放置于超净工作台内的无菌纸巾上，以减少在施加菌悬液过程中手部对板的接触。
  7. 将气压调至约4 bar，向TLC板均匀喷施三层悬液，每次喷施后需待板面完全干燥。
    注意：研究发现三层为最佳喷施量。若少于三层，病原菌缺乏足够的培养基生长；若多于三层，培养基过厚，可能阻碍病原菌与活性代谢产物的接触。
  8. 向已灭菌的塑料培养皿盒中加入500 mL无菌水，并在两侧放置灭菌后折叠的纤维素纸或滤纸以保持湿度。
  9. 将完成处理的检测板置于盒内的四个空培养皿上。
  10. 将检测板在适宜条件下孵育3天至1周，或直至TLC板表面形成均匀的菌丝层，仅在阳性对照周围及抑菌圈（ZOIs）区域无菌丝生长为止。

7. 液相色谱质谱分析

  1. 使用摄影方法对完成的检测进行成像。
  2. 通过将从底线到抑菌区的距离除以从底线到顶线的距离，计算每个抑菌区的比移值（Rf值）。
  3. 刮下抑菌区上的硅胶，并将其放入微量离心管中。
  4. 向每根管中加入 500 µL 甲醇，涡旋振荡以从硅胶中提取代谢物。
  5. 在 20 °C 下以 8,500 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至小瓶中。
  6. 通过旋转蒸发或氮气流吹干至完全干燥。
  7. 将提取物重新溶解于 50 µL 甲醇中，置于液相色谱小瓶内。
  8. 通过液相色谱-质谱法（LC-MS）分析抑菌区中的代谢物，并将其与粗提物中的代谢物进行比较，以确定粗提物中哪些代谢物对病原菌的抑制起作用16。
  9. 根据来源微生物的属名和种名，以及在抑菌区中鉴定出的质荷比，查阅文献及相关数据库（如Antibase和Natural Products天然产物字典），鉴定这些代谢物。

结果

采用薄层色谱法（TLC）分离微生物提取物后，代谢物应沿TLC板垂直方向分散分布。在可见光下，难以观察到不在可见光范围内吸收的代谢物。因此，通过紫外光（UV）成像有助于观察代谢物的分离情况，如图2A、B所示。经过孵育后，除阳性对照及含有活性代谢物的抑菌区域外，病原菌应在整个平板上均匀生长，如图2C所示。

薄层色谱结果，荧光化合物分离；在紫外光下观察。
图 2：通过薄层色谱分离微生物提取物。（A）在可见光下成像的含有九种 Bacillus 提取物的展开后薄层色谱板；（B）在接种真菌前于320 nm紫外光下成像的结果。（C）完成的生物自显影实验，病原菌在整个平板上生长，但在阳性对照周围以及各提取物产生抑菌圈（ZOI）的位置无菌生长。请点击此处查看该图的放大版本。

通过LC-MS分析抑菌圈中提取的代谢物，并与粗提物进行比较，以确定对病原菌具有拮抗作用的天然产物（NPs）。匹配的代谢物应具有相同的保留时间和分子离子种类，方可视为匹配。一旦鉴定出活性代谢物，即可大量培养细菌，以分离目标活性代谢物，用于结构化学或生物学研究。

讨论

TLC-DB 是一种有价值且已被广泛认可的天然产物研究工具，也是微孔板生物测定导向分离方法的一种简单且低成本的替代方案17。与需要采用液相色谱技术进行代谢物分离的微孔板测定相比，该方法所需的时间和材料资源极少。它是一种高度通用的检测方法，除酶抑制剂外，还可用于检测具有抗菌、抗真菌、抗寄生虫和抗氧化活性的天然产物18,19,20,21,22,23。尽管该方法最常用于检测和鉴定植物来源的生物活性化学成分，但本实验方案中所探讨的同样适用于细菌来源的天然产物18。此外，该方案可针对多种天然产物来源和靶标病原体进行优化，有助于发现和评估新型生物活性天然产物。

用于细菌培养的培养基以及用于提取的溶剂会显著影响天然产物的发现结果。本方案所用的培养基针对产环脂肽类物质的细菌进行了优化，包括 假单胞菌 和 芽孢杆菌属 种（复数形式）. 但若研究其他属的微生物，则应考虑使用其他培养基和营养来源。研究者可选择利用同一种微生物在不同培养基中培养，以完成TLC-DB实验，从而评估单一分离株产生的代谢物多样性；也可对多种分离株采用相同的培养条件进行比较。提取溶剂的选择同样会影响检测到的天然产物。通常认为大多数具有生物活性的天然产物极性较低至中等，因此乙酸乙酯是较为合适的选择，因其沸点较低，易于去除。然而，若还需分析极性与非极性组分，可使用其他溶剂进行多次提取。 Alternatively，可将无细胞提取物冻干后用于检测，以观察释放到培养基中的全部代谢物。但此时通常需要在TLC板上点样更多材料，以抵消冻干样品中干燥培养基成分的干扰。同样地，若将该方法用于其他病原体（如接种物），则必须优化所用培养基和培养条件，以获得TLC-DB实验所需的5块菌丝琼脂平板。

与接触法和浸入法生物自显影相比，TLC-DB具有优势，因其使用最薄的琼脂层和接种物，最大限度地减少了代谢物向琼脂层扩散的依赖性，从而使更少量的天然产物即可诱导病原菌抑制17。先前发表的研究在使用TLC生物自显影方法时，采用病原菌的孢子悬浮液完成检测17。尽管这种方法能够精确控制悬浮液浓度，但诱导某些真菌产孢可能极为困难且耗时24。该改进显著简化了检测流程，使得难以产孢的真菌病原体也可用于该方法，而这些病原体此前可能因技术限制而被避免使用。

实验中所用细菌提取物的质量可能影响结果。若涂布到薄层色谱（TLC）板上的提取物过少，则可能无法超过活性化合物的最低抑菌浓度，从而无法检测到生物活性。因此，在某些情况下，如图1和图2所示，适当过量上样是值得的，尽管这会牺牲一定的分离效果，但有助于更易检测到活性。同样，喷洒到板上的病原菌接种量也不宜过低，否则将无法提供足够的培养基以支持病原菌生长。本方法可轻松调整以适应多种细菌提取物和病原菌；本方案中所述的微生物提取物和接种物用量已确保能够检测到多种病原菌和微生物提取物的生物活性。若在实验结束后未观察到抑制圈，则可能表明以下情况之一：首先，所用提取物中可能不含活性代谢物，原因可能是细菌培养时使用了不合适的培养基，或该细菌的活性并非由天然产物（NP）的产生所致。可通过使用该提取物进行纸片扩散实验，以确认或排除提取物中存在活性天然产物的可能性。若纸片扩散实验未显示对病原菌的抑制作用，则可测试其他培养基，以确定不同培养条件下是否可产生具有生物活性的天然产物。若纸片扩散实验表明提取物确实能抑制病原菌，则可能需要在TLC板上施加更大质量的细菌提取物，此时可重新尝试一次实验。

将抑菌圈（ZOI）中的代谢物与粗提物进行比较，对于鉴定活性天然产物（NPs）至关重要。在实验中，粗提物中的代谢物可能被病原体代谢或修饰，这一现象可通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）观察到。因此，只有在粗提物和抑菌圈中均出现的代谢物，才可被视为由所研究细菌产生的天然产物。如果无法将从抑菌圈中提取的代谢物与粗提物中的代谢物相对应，可按照步骤5所述制备薄层色谱（TLC）板。无需完成生物自显影实验，只需从TLC板上与已完成实验中相同保留时间的位置提取代谢物。这将有助于更清晰地关联抑菌圈与粗提物中的代谢物，从而实现对病原体的抑制作用。

TLC-DB 的一个缺点是，薄层色谱（TLC）的分辨率明显低于使用传统微孔板筛选技术所能达到的水平，后者通常需要液相色谱进行分离。因此，在抑菌区域中常存在多种代谢物，其中部分代谢物可能并不贡献生物活性。这一问题还可能因过度点样以更清晰地观察生物活性而加剧。近期已有研究采用高效薄层色谱（HP-TLC），显著提高了分辨率，并可实现薄层色谱展开过程的自动化，而这是常规 TLC 无法实现的14,21,22,23。此外，还可通过二维薄层色谱（2D-TLC）对具有相似保留时间的代谢物进行进一步分离。然而，应评估采用 HP-TLC 和 2D-TLC 所带来的更高时间和材料成本是否值得换取更高的分辨率25。

披露

Susan Boyetchko 博士于本作品提交前已去世（2023年2月8日）。其余所有作者均声明无利益冲突。

致谢

我们衷心感谢加拿大农业与农业食品部提供的资助，使本研究得以开展（项目编号：J-001843 和 J-002021）。感谢Brett van Heyningen为本实验方案拍摄视频内容。我们还要感谢以往的研究生（Jennifer Vacon 和 Mark Nabuurs）对本文所述方法所提供的宝贵见解。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5-5 mL 单通道移液器VWRCA11020-004
10 mL 薄层色谱喷雾器VWRKT422530-0010
100 x 15 mm 培养皿VWR89038-970
100-1000 µL 移液器吸头VWR76322-164
100-1000 µL 单通道移液器VWR76169-240
15 mL 无菌离心管VWRCA21008-918
1 L 玻璃瓶Millipore SigmaCLS13951L必须耐高压灭菌
1 mL 带针头的无菌注射器Thomas Scientific8935L75建议使用可拆卸针头
2 mL 微量离心管VWR87003-298
50 mL 无菌离心管VWRCA21008-940
5 mL 移液器吸头VWRCA11020-008
7 mL 闪烁瓶VWR76538-962
95% 乙醇Thermo Fisher ScientificA412-500
高压灭菌器Cole-ParmerUZ-01850-348 L，115 VAC
细菌学琼脂VWR97064-336
分样器Thomas Scientific1216H91
D-葡萄糖VWRBDH9230-500G
二氯甲烷 ≥99.8% ACSVWRBDH1113-4LG
乙酸乙酯 ≥99.8% ACSVWRBDH1123-4LG
滤纸VWRCA28297-846
研磨珠VWR12621-148
潮霉素 BVWRCA80501-074
七水合硫酸亚铁VWR97061-542
超净工作台CleanTech1000-6-A
LC-MSWatersLITR10064178UPLC/MS/MS TQD 系统
冷冻干燥机Labconco700201000冷凝器温度 -50 °C 
水合硫酸锰VWRCAAA10807-14
甲醇 ≥99.8% ACSVWRBDH2018-5GLP
纸巾VWR89402-824
马铃薯葡萄糖琼脂VWRCA90000-758
马铃薯葡萄糖肉汤VWRCA90003-494
磷酸氢二钾VWR470302-246
磷酸二氢钾VWR470302-252
压力表 6 mm 直通接头 0-10 bar (0-145 psi)TamesonF25U6
假单胞菌 F 琼脂VWR90003-352又称 Flo 琼脂
PTFE 管Sigma Aldrich58697-U内径 1/16 英寸 
氯化钠VWRBDH9286-500G
刮勺VWR82027-490
带针头的无菌接种环VWR76534-512
锡箔纸Thomas Scientific1086F24可从超市购买
TLC 硅胶 60 RP-18 F254S 25 片玻璃板 20 X 20 cmThomas Scientific1205Q12
真空泵Labconco147210098 L/min
涡旋振荡器VWR76549-928必须能适配 15 mL 和 50 mL 离心管
Whatman 在线 HEPA-VENT 过滤器Millipore SigmaWHA6723500010 个滤芯，1/4 至 3/8 英寸进出口
VWR97063-370

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