生物测定 - 通过薄层色谱法 - 直接生物自闭法鉴定用于生物防治的天然产物

真菌农业病原体对全球作物质量和产量造成重大损失，加剧了稳定的全球食品生产系统的经济和供应挑战 ^1,2。通过培育抗感染的栽培品种并使用综合作物管理系统（包括作物轮作和土地管理实践）来抑制病原体增殖，可以防止病原体损害 ^3,4。虽然这些方法减少了对作物的损害，但化学杀虫剂通常结合使用，以主动杀死田间的真菌生殖结构，并进一步防止损害和减产。虽然有效，但化学杀虫剂的使用有许多缺点，包括破坏周围生态系统、土壤肥力下降、相关的人类健康风险以及病原体耐药性的发展，后者导致每年需要更高剂量的杀虫剂 ^5,6,7。

长期以来，基于微生物的害虫和病原体管理产品一直被认为是合成杀虫剂的潜在替代品或补充。自 1900 年代初以来， 苏云金芽孢杆菌 已被广泛用于控制农业害虫和病原体，作为种子处理剂、叶面喷施和直接土壤处理⁸。此类产品被命名为生物杀虫剂，其特征是天然存在的微生物或生化物，可以杀死、抑制或降低目标害虫或病原体的活力。生物农药可以通过各种机制控制病原体的生长，但最常见的是通过分泌次生代谢物来实现⁹。次生代谢物，通常被称为天然产物，不参与初级代谢，而是作为一种进化优势产生的，以超越其他微生物¹⁰。

与合成农药相比，生物农药具有许多优势。与合成害虫管理产品相比，它们对环境、动物和人类的毒性风险较低 ^9,10。由于大多数生物农药在环境中自然存在了数千年，因此环境中存在微生物代谢物的生物降解途径，限制了土壤或生态系统污染的可能性，并缩短了导致合成农药对环境造成如此破坏的停留时间¹¹。此外，许多用于减轻病原体感染的生物农药也表现出促进植物生长的特性，这可以提高养分生物利用度并诱导植物系统性抗性¹²。

最常见的是，生物杀虫剂以微生物接种物的形式施用，NP 由活微生物原位分泌 ^12,13。在这种情况下，确定生物杀虫剂活性的来源具有很大的价值。这样做可以深入了解生物农药的作用机制，有助于为通过专利保护微生物建立案例，并且如果它们的结构新颖，则可以产生重大的科学影响。然而，最重要的是，生物活性来源的鉴定为下游生物农药产品的配方提供了信息。如果 NP 本身具有活性，则可以将微生物用作生物分子工厂，用于大规模生物农药生产。此外，许多已探索用于生物防治的 NP 在人类医学中也有潜在的应用，使其更具经济价值⁸。

薄层色谱-直接生物自闭法 （TLC-DB） 测定是一种廉价且直接的生物活性引导分离和鉴定生物农药代谢物的方法。虽然该技术通常用于从粗植物提取物中分离植物化学物质的生物活性测试，但它在微生物提取物分析方面也具有巨大潜力¹⁴。TLC 可快速且廉价地分离粗微生物提取物中的 NP，并且在用培养基病原体悬浮液包被后，很容易看到含有活性代谢物的区域。可以从板中刮下这些区域，然后通过超高效液相色谱-质谱联用 （UPLC-MS） 提取用于化学分析，以鉴定已知的代谢物。与先前报道的化合物不匹配的代谢物 可以通过液相 色谱法大量分离，以使用核磁共振波谱和 X 射线晶体学等技术进行结构解析研究¹⁵。

本文描述了一种使用 TLC-DB 与 芽孢杆菌 属和农业病原体 菌核病菌核瘤来发现和鉴定生物农药 NP 的模型系统。 图 1 提供了 TLC-DB 程序的示意图概述。

图 1:TLC-DB 程序步骤 4-7 的示意图概述。请单击此处查看此图的较大版本。

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 选择微生物生物防治候选者

1. 使用竞争板检测，选择对目标病原体表现出拮抗作用的微生物分离物。
   注:选择了 9 种表现出对菌核链球菌拮抗作用的芽孢杆菌分离株，包括萎缩芽孢杆菌、莫哈文菌和枯草芽孢杆菌物种，以证明该方案。

2. 培养基制备

1. 通过每升水溶解 39 g 培养基来制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA）。
2. 通过每升水添加 45 g 培养基来制备假单胞菌 F 琼脂。
3. 通过每升水添加 24 g 培养基和 0.24 g 琼脂，制备含有 1% 琼脂的马铃薯葡萄糖汤 （PDB）。
4. 准备酵母-葡萄糖-锰 （YGM） 肉汤。制备由 2.5 g KH₂PO₄ 和 2.5 g K₂HPO₄ 溶于 100 mL 水的缓冲溶液，以及由 0.58 g MnSO₄ 组成的盐溶液。H₂0、0.5 g NaCl 和 0.05 g FeSO 4.7H₂0 溶于 100 mL 水中。
   1. 接下来，加入 1 g 酵母提取物、1.25 g 葡萄糖、400 mL 水、5 mL 缓冲溶液、5 mL 盐溶液和 90 mL 水，以确保金属盐不会在溶液中沉淀。
5. 对培养基进行高压灭菌，将琼脂倒入 100 x 15 mm 培养皿中，并在使用前全部冷却至室温。

3. 病原体制备

1. 在 PDA 上培养五板菌核 病 菌（在步骤 2.1 中制备），并在 25 °C 下孵育 3 天。

4. 天然产物提取物制备

1. 在假单胞菌 F 琼脂（在步骤 2.2 中制备）上培养每个细菌分离物并生长直至观察到单个菌落。
2. 将单个细菌菌落传代培养到离心管或培养管中的 25 mL YGM 培养基中，并在振荡下孵育 3 天。
3. 将每种提取物的 5 mL 等分试样转移到 1 L YGM 中，并在相同条件下再孵育 3 天。
4. 将每种培养物在 25 °C 下以 3000 x g 离心 15 分钟以沉淀细胞。
5. 倒出并用乙酸乙酯洗涤上清液 3 次，以从培养基中提取代谢物。
6. 合并并使用旋转蒸发干燥每个乙酸乙酯层。
7. 将提取物重新溶解在最少的甲醇中，将其转移到一个小闪烁瓶中，然后通过旋转蒸发再次干燥。
   注:如果提取物干燥成油性或树脂状材料，请将材料冻干以获得可准确称量的干粉。

5. TLC 板制备

1. 通过在距板底部 20 厘米和距板顶部 2 厘米处画一条线来准备 20 厘米 x 20 厘米的 TLC 板。在底线上，放置 9 个点，相距 2 厘米。在顶线上方，放置四个相距 4 厘米的点。
2. 将 5 mg 每种提取物溶解在 15 μL 甲醇中，并使用移液管将 5 μL 每种提取物涂抹在底线上标记的九个点上。让每个提取物点在 TLC 板上干燥，然后将另外 5 μL 等分试样涂到同一点。重复直到所有材料都加载到 TLC 板上。
3. 使用二氯甲烷和甲醇的 1:2 溶液在显影槽中显影 TLC 板，直到溶剂到达距板顶部 2 cm 标记的线（约 45 分钟）。
4. 显影后，取出 TLC 板，并在溶剂线上方标记的四个点上涂抹一系列阳性对照。使用相同对照的四种浓度。对于 S. scl.， 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL 和 500 μg/mL 潮霉素 B 是阳性对照。
5. 在所有溶剂从板中蒸发之前，将其放入乙醇灭菌的 TLC 板盒中。

6. 直接生物自闭造影测定

1. 将用于测定的材料（色谱喷雾器的玻璃成分、金属刮刀、四张纸巾、纤维素或滤纸、水和培养基）在覆盖有锡纸的大烧杯中高压灭菌。
   注意:纸质材料（纸巾、纤维素纸）应用锡箔包裹，以避免在高压灭菌器中受潮。
2. 使用乙醇灭菌的 PTFE 管连接气源、压力表和色谱喷雾器。在色谱喷雾器和压力表之间连接 HEPA 过滤器。
3. 使用无菌金属刮刀将五个病原体板的菌丝垫收集到使用无菌刮刀的 50 mL 离心管中。
   注意:如果需要，使用少量液体肉汤帮助去除菌丝体，并使用无菌移液管转移。
4. 将 25 mL 用琼脂和无菌玻璃珠修饰的 PDB 添加到 50 mL 离心管中，涡旋 5 分钟以打碎菌丝垫。
5. 使用带有针尖的无菌注射器将菌丝体悬浮液转移到层析喷雾器中，以确保大块菌丝体不会堵塞层析喷雾器。
6. 将先前开发的 TLC 板放在层流罩中的无菌纸巾上，以减少在应用培养基悬浮液时手与板的接触。
7. 将气压增加到大约 4 巴，并在 TLC 板上涂上三层悬浮液，让板在两次应用之间完全干燥。
   注意:发现三层是最佳量。小于这个值，病原体就没有足够的培养基来生长。不仅如此，培养基太厚，可能不允许病原体与活性代谢物接触。
8. 将 500 mL 无菌水加入消毒过的塑料板盒中，并在每侧放置消毒过的折叠纤维素片或滤纸以保持水分。
9. 将完成的分析板放在盒子中的四个空培养皿上。
10. 孵育测定 3 天至 1 周，或直到均匀的菌丝体层在 TLC 板上均匀生长，阳性对照和抑制区 （ZOI） 周围除外。

7. 液相色谱质谱分析

1. 使用摄影对完成的分析进行成像。
2. 通过将底线到 ZOI 的距离除以底线到底线的距离来计算每个抑制区的保留因子。
3. 从抑制区刮下二氧化硅，并将其放入微量离心管中。
4. 向每个试管中加入 500 μL 甲醇并涡旋以从二氧化硅中提取代谢物。
5. 在 20 °C 下以 8,500 x g 离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个小瓶中。
6. 通过旋转蒸发或在氮气流下蒸发至干。
7. 将提取物重悬于 LC 样品瓶中的 50 μL 甲醇中。
8. 通过 LC-MS 分析抑制区的代谢物，并将其与粗提取物中的代谢物进行比较，以确定粗提取物中的哪些代谢物负责抑制病原体¹⁶。
9. 使用 ZOI 中鉴定的源微生物的属和种以及质量，搜索文献和相关数据库（如 Antibase 和 Dictionary of Natural Products）以鉴定代谢物。

通过 TLC 分离微生物提取物后，代谢物应沿 TLC 板垂直分散。在可见光下，可能很难看到在可见光范围内不吸收的代谢物。因此，在紫外光下成像可以帮助查看代谢物的分离，如图 2A、B 所示。 孵育期后，病原体应在整个板中均匀生长，除了阳性对照和活性代谢物所在的抑制区，如图 2C 所示。

图 2:通过 TLC 分离微生物提取物。 （A） 开发的 TLC 板包含九种 芽孢杆菌 提取物，在可见光下成像，（B） 在施用真菌接种物之前在 320 nm 紫外光下成像。（C） 完成生物自发分析，在整个板中观察到病原体生长，除了阳性对照周围生长受到抑制的地方，以及每种提取物的 ZOI。 请单击此处查看此图的较大版本。

通过 LC-MS 分析从抑制区提取的代谢物，并与粗提取物进行比较，以确定负责拮抗病原体的 NP。匹配的代谢物应具有相同的保留时间和分子离子种类，才能被视为匹配。一旦鉴定出活性代谢物，就可以批量培养细菌培养物，以分离感兴趣的活性代谢物，用于结构化学或生物学研究。

Susan Boyetchko 博士在提交这项工作之前（2023 年 2 月 8 日）去世。所有其他作者均已声明没有利益冲突。