一种标准化猪到猕猴异位心脏异种移植模型

心脏异种移植为需要移植但因供体短缺而无法获得合适供体器官的终末期心力衰竭患者带来了新的希望。在临床前评估研究中，维持生命的心脏异种移植的生存期长达九个月，符合启动人体临床试验所需的疗效标准¹。基于这些发现，美国食品和药物管理局 （FDA） 批准了使用基因编辑供体心脏进行心脏异种移植的两例临床病例的扩大访问使用。尽管这些临床病例已经证明了心脏异种移植的可行性，但已经出现了一些未解决的挑战，包括异常心脏肥大和抗体介导的排斥反应 2,3,4,5。因此，有必要在良好的实验室实践条件下对大型动物模型进行进一步的临床前研究，以提供额外的数据并开发新的免疫抑制方案，以确保未来人体临床试验的安全性。

原位心脏异种移植物的长期存活不仅受到排斥反应的限制，还受到原发性移植物功能障碍的限制。据报道，不同^{研究团队的}原发性功能障碍的总体发生率约为 40% 至 60% ^4,6,7。由于猪供体心脏对缺血性损伤的易感性增加，一些群体开发了低温灌注装置以降低原发性移植物功能障碍的发生率。然而，术后心脏肥大仍然难以控制。即使使用生长激素受体 （GHR） 敲除供体猪，心脏功能也可能因缺乏 GHR 而受到损害，从而限制长期移植物活力 ^2,3。在这种情况下，异位心脏异种移植具有几个优点：它避免了过大的前负荷和后负荷，简化了手术过程，并减少了总缺血时间 ^8,9。该模型更好地反映了异种排斥反应驱动的移植物损伤，与原位移植不同，异位心脏异种移植可实现移植物长期存活、重复剖腹手术进行体内活检，并延长免疫激活和动态免疫细胞功能的观察。它是研究异种免疫排斥机制和评估新免疫抑制策略的有效性和安全性的宝贵模型^10,11。

然而，大多数腹部异位心脏异种移植模型都利用狒狒作为受体，但在许多国家，狒狒作为实验动物的采购仍然具有挑战性。相比之下，猕猴是使用最广泛的非人类灵长类动物，与人类具有高度的系统发育同源性¹²，使其成为异种移植研究的实用替代品。然而，与狒狒相比，它们的体型明显较小，因此需要进行特定的手术方案调整，以适应它们独特的解剖尺寸。

本研究提出了 GTKO 猪到猕猴异位心脏异种移植的分步方案。使用α-Gal基因敲除猪（GTKO）的主要目的是防止超急性排斥反应，否则会导致心脏异种移植后几分钟内的移植物失败。其结构如下：（1）供体猪和受体猕猴之间的匹配原则;（2）异位心脏异种移植手术程序的优化;（3）围手术期管理。本研究旨在传播这些移植技术，以促进研究团队之间的可比性，并增强心脏异种移植研究的可重复性和转化相关性。

本研究获得阜外医院动物伦理委员会批准（FWAEC-JL-010-1/0-2020）。使用体重>9公斤、年龄10-15岁的雄性猕猴和体重5-6公斤（~60天龄）的雄性巴马小型猪，以尽量减少腹部压迫。体型较大的猕猴被优先考虑，以防止供体心脏压迫腹部并适应移植后的生长。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 捐赠者和受者选择标准

1. 接收者猕猴选择
   1. 预先存在的抗体筛选：使用流式细胞术评估预先形成的异种抗体水平，从而能够选择免疫风险较低的受体。
      注意：在该测定中，通过酶消化分离来自GTKO猪主动脉的GTKO猪内皮细胞，如前所述¹³。
      1. 将GTKO猪内皮细胞与受体血浆一起孵育。
      2. 使用针对猕猴 IgM 和 IgG 的荧光标记二抗来量化猕猴 IgM 和 IgG 与猪细胞的结合。选择预先形成的抗体水平较低的受体。
   2. 基线健康评估：进行血清生化、全血细胞计数和凝血功能测试，以确认足够的基线器官功能。
2. 供猪选择标准
   1. 超声心动图筛查：选择左心室和右心室功能正常、心脏瓣膜无结构或功能异常、射血分数大于65%、无肺动脉高压证据的供体猪。
   2. 性别匹配：选择与受赠者性别相同的供体猪。
   3. 血型：选择O型血的供体猪。

2. 术前准备

1. 麻醉和镇静
   1. 麻醉：用氯胺酮 （10 mg/kg） 和咪达唑仑 （1 mg/kg） 诱导猕猴（遵循机构批准的方案）。诱导后，用异氟醚 （2%-3%） 加右美托咪定 （1 μg/kg/h） 和异丙酚 （1-2 mg/kg/h） 维持麻醉。
   2. 插管：用5.0毫米气管插管插管供猪。用 5.5 毫米气管插管给受体猕猴插管。
   3. 输尿管导管插入：在猕猴体内插入一根 6-F 双腔导尿管;在供体猪中省略。
2. 准备和消毒手术区域
   1. 皮肤准备：剪掉胸部、颈部、腹部、背部和四肢的毛发。
   2. 消毒：用聚维酮碘擦洗剃须区域，包括蹄（猪）或手脚（猴子）。
3. 在接受者中放置中心静脉导管
   1. 定位：将接受猕猴置于肩部抬高的部分左侧卧位中，以优化右侧颈部区域的暴露。选择正确的颈内静脉作为中心静脉通路的首选部位。
   2. 灭菌和覆盖：按照标准无菌程序，用聚维酮碘对手术区域进行消毒和覆盖。
   3. 切口和血管暴露：在胸锁乳突肌内侧约 1 厘米处做一个 5 厘米的切口，平行于其内缘。对筋膜进行钝性解剖并横向缩回肌肉。
      1. 识别颈外静脉，它位于颈动脉鞘的浅表和外侧。小心地结扎颈内静脉的小交通分支。打开颈动脉鞘，露出颈内静脉、迷走神经和颈动脉。
   4. 导管插入：使用逆行隧道技术插入 8-F 三腔中心静脉导管。在无菌条件下将导管的近端连接到隧道针，并将其穿过隧道拉入颈部切口。
      1. 在肩胛骨中点将远端外部化。将导管修剪成适当的长度，以确保其尖端到达上腔静脉和右心房的交界处。
   5. 切口闭合：分层闭合伤口。用3-0可吸收缝合线闭合筋膜和皮下组织，用1-0丝缝合线闭合皮肤。确保导管完全覆盖并牢固固定在筋膜层下方，以最大限度地降低感染风险。
      1. 使用中心静脉导管作为猕猴术后药物给药和容量复苏的关键液体通路。每天进行聚维酮碘消毒和无菌纱布敷料，以保持导管完整性并预防感染。
      2. 将中心静脉导管原位维持，直到最后的牺牲手术，以确保可靠的血管通路。

3. 受体手术（植入前阶段）

1. 腹部中线切口
   1. 切口选择：做一个长约12-15厘米的中线腹部切口（图1A）。
   2. 切口细节：依次切开皮肤、浅筋膜、白线、横筋膜、腹膜下筋膜（包括腹膜外脂肪），然后切开壁腹膜进入腹腔。使用#23手术刀片进行皮肤切口，使用电灼进行更深层次的组织解剖，以实现同时切割和止血。
2. 腹部探查和肠道管理
   1. 粘连松解：探索腹腔以评估粘连，重点关注肠道和腹壁之间是否存在粘连。如果存在，请使用电烙仔细解剖粘连，以尽量减少组织损伤并降低术后机械性肠梗阻的风险。
   2. 肠道保护：轻轻地将小肠外化，放在无菌湿纱布上进行保护，以暴露腹主动脉和下腔静脉。
3. 腹主动脉和下腔静脉暴露
   1. 活动腹主动脉和下腔静脉：仔细解剖腹主动脉和下腔静脉的周围组织，最大限度地减少血管损伤和出血的风险。尽可能充分地暴露肾动脉起点和髂动脉分叉处之间的腹主动脉和下腔静脉。
   2. 处理血管分支：在解剖过程中保留肠系膜下动脉及其伴随静脉。精心保存所有腰支。

4. 供体心脏采购

1. 正中胸骨切开术和血管动员术
   1. 正中胸骨切开术：进行中线胸骨切开术以进入胸腔（图1B）。使用 Lebsche 胸骨刀小心地分开供体胸骨。
   2. 血管动员：暴露胸腔后，切开心包，仔细解剖，将升主动脉和肺主动脉分开。
2. 血管夹紧和心脏冷却
   1. 血管夹紧：在主动脉根部放置4-0荷包缝合线，然后插入一次性顺行心脏停搏插管以进行心脏停搏（图1C）。依次夹紧上腔静脉和下腔静脉，然后交叉夹紧升主动脉。
      1. 主动脉夹紧后立即切开肺静脉和下腔静脉进行减压，确保切口足够大以充分引流。
   2. 心脏降温：抽吸心包腔排出残血，然后立即将心脏浸入无菌冰冷盐水中，达到低温环境（0-4°C）。
3. 心脏停搏和灌注监测
   1. 心脏麻痹：使用压力袋将灌注压维持在 150 mmHg。用30mL / kg体重的HTK溶液灌注供体心脏（例如，5kg猪150mL）。
   2. 灌注监测：同时触诊主动脉根部和左心室，以验证心脏停搏输送压力是否合适，防止心室扩张。完成心脏停搏输注后，通过触诊和目视检查确认心脏骤停。确保没有任何心肌颤动，然后进行供体心脏切除。
4. 心脏切除和保存
   1. 心脏切除术：心脏停搏后，在心包腔上额外冰敷（图1D）。轻轻抬高心脏，并使用手术剪刀依次横切下腔静脉和肺静脉。在分开右上肺静脉时，要特别注意避免损伤上腔静脉和右心房。
      1. 保护气管，同时解离左心房后壁。一旦夹层达到左心房顶和肺动脉的水平，将心脏暂时放回心包腔。
      2. 解离并横切近端主动脉弓和上腔静脉以暴露肺干。继续沿组织平面朝左心房顶解剖，从而切除心脏及其大血管。
         注意：心脏切除术后牢固地结扎奇静脉残端以防止出血。
   2. 心脏保存：立即将移植的心脏浸入冰冷的盐水中保存。此外，用另一种体积为30mL / kg的威斯康星大学（UW）溶液灌注供体心脏，因为UW溶液提供卓越的心肌保护（图1E）。
5. 与人类供体心脏采购的主要区别
   1. 输液压力设置：将压力袋中的灌注压力设置为 150 mmHg，这被认为是心肌灌注的最佳选择。
   2. 主动脉交叉夹位置：由于猪只有主动脉弓的两个主要分支，即左右头臂干，因此将交叉夹放在这些分支之间。在交叉夹紧之前用丝线结扎右头臂干，以保留更长的供体主动脉长度。
   3. 心室减压策略：为了尽量减少心室过度扩张并限制缺血时间，请常规仅对左心室进行减压。如果右心室开始肿胀，请打开奇静脉上方的上腔静脉。如果左心室肿胀，切开右肺静脉并将切口向右肺门延伸。

5. 供体心脏植入术

1. 供体心脏准备
   1. 供体心脏准备：使用 4-0 prolene 缝合线牢固地闭合供体上腔静脉、下腔静脉和左心房的肺静脉口。
   2. 保留窦房结：保留供体上腔静脉和位于右心耳附近的窦房结。
2. 肺动脉与下腔静脉的端对侧吻合术
   1. 肝素化：在供体心脏吻合术之前，向受体猕猴静脉注射 5,000 单位肝素钠，以防止血栓形成。
   2. 肺动脉吻合术：在受体下腔静脉上放置 DeBakey 无创切向夹。创建一个略大于供体肺动脉的纵向切口，以尽量减少术后狭窄。
      1. 使用双臂 5-0 prolene 缝合线，从受体血管的内侧（管腔侧）向外插入一根针，在 12 点钟位置开始吻合。从供体肺动脉侧插入另一根针头，在相应的 12 点钟位置从管腔向外穿过。
      2. 在外血管壁上打起初始结。反转针头方向，从外侧穿过回供体肺动脉管腔。继续顺时针向 6 点钟位置连续缝合，使用神经钩保持缝合张力。
      3. 旋转心脏露出对侧，换用另一根针头，在受体血管上以从外到内、供体血管从内到外的进针模式从12点到6点钟方向缝合对侧壁，完成端对侧吻合。
   3. 空气排出：在固定最后一个结之前，将生理盐水注入吻合口部位，以确保空气完全排出。使用无创伤血管夹闭塞供体肺动脉，然后依次释放下腔静脉血管夹（图1F）。
3. 供体主动脉与受体腹主动脉的端对侧吻合
   1. 主动脉吻合口：使用 DeBakey 无创切向夹部分夹住受体腹主动脉。做一个略大于供体主动脉直径的纵向切口，以防止术后狭窄。
      1. 使用双臂 5-0 prolene 缝合线，将针头从受体主动脉内侧（管腔侧）向外插入 12 点钟位置开始吻合。将另一根针从供体主动脉插入 12 点钟位置，同样从内到外，并将第一针扎在外血管壁上。
      2. 反向针头方向，在供体血管上从外向内穿过，连续顺时针缝合至6点钟位置，用神经钩保持缝合张力。翻转心脏露出另一侧，相应地反转针头方向（供体血管从外到内，受体血管从内到外），从12点到6点钟方向连续缝合，完成端对侧吻合。
   2. 空气排出：在打最后一个结之前，将生理盐水注入吻合口以去除空气。依次松开腹主动脉血管夹以恢复循环（图1G）。
4. 再灌注和除颤
   1. 预防心室颤动：再灌注前静脉注射 3 mg/kg 利多卡因，以预防心室颤动。在 2 分钟内观察供体心脏是否有自发收缩。
   2. 除颤：如果发生心室颤动，请将桨叶与两个心室表面（左侧和右侧）直接接触来进行直接除颤，并进行双相 5 焦耳电击。供体心脏的总缺血时间约为 57.5 分钟± 6.1 分钟（表 1）。
5. 排水管放置
   1. 负压引流：在腹腔内放置负压引流管，防止术后积液，监测活动性出血。
   2. 引流管移除指征：监测术后引流量，当 24 小时输出量低于 25 mL 时取出腹腔引流管。
6. 腹部闭合
   1. 腹部闭合和超声检查：分层闭合腹壁，用3-0条可吸收缝线近似筋膜和皮下组织，用1-0条丝线缝合皮肤。进行术后腹部超声检查以评估心脏活动（图1H）。

6. 术后管理和移植物监测

1. 监测和一般护理指南
   1. 行为和症状监测：使用视频监控在术后前两周持续监测接受者的状态。对行为、食欲、腹胀、呼吸困难、水肿以及正常排便和排尿进行日常评估。
      1. 监测体重、一般身体状况、手术切口愈合、潜在的中心静脉导管感染、粘膜外观和腹腔内积液。
   2. 超声评估：使用超声评估异位移植心脏的功能，如果存在异常，则检测周围任何积液。 图 2 显示了术后第 1 天 （POD） 舒张期和收缩期异种移植物的超声心动图图像，以及在实验 M3 中观察到的移植物失败。红线表示失败的异种移植物的左心室壁明显肥大。

基于 图1所示的程序步骤，成功建立了可重复的猪到猕猴异位心脏异种移植模型。手术过程包括对受体猕猴进行中线剖腹手术以进入腹腔，并在供体猪中进行正中胸骨切开术以获取心脏。心包切开术后，使用 HTK 溶液停搏供体心脏，并在局部低温下用 UW 溶液进一步保存。在供体肺动脉和受体下腔静脉之间以及供体主动脉和受体腹主动脉之间以端对侧的方式进行血管吻合。术后超声心动图评估证实，供体心脏恢复收缩活动，收缩和舒张功能得以保留，表明移植物再灌注成功和活力。这些结果证明了该模型的技术可行性及其在非人灵长类动物中异种移植物长期功能监测的潜力。

图1：猪到猕猴异位心脏移植：手术步骤和术后超声。 （A）猕猴的腹腔通过中线剖腹手术进入分层解剖。（B） 进行正中胸骨切开术以进入猪供体的胸腔，然后进行心包切开术。（C） 将灌注插管插入供体心脏的主动脉根部。（D）HTK溶液灌注诱导心脏骤停后，用盐水冰泥局部冷却供体心脏。（E）随后用威斯康星大学（UW）保存液进行灌注。（F） 在猪肺动脉和受体的下腔静脉之间建立端到侧吻合口。（G） 在猪主动脉和受体腹主动脉之间构建端对侧吻合口。（H）术后超声心动图评估供体心脏的收缩和舒张功能。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：M3 的时间序列超声心动图图像。 （A） 术后 （POD） 舒张期和收缩期异种移植物的超声心动图图像 1.（B） POD 3 舒张期和收缩期异种移植物的超声心动图图像。（C） POD 10 时舒张期和收缩期异种移植物的超声心动图图像。（D） 移植物失败时舒张期和收缩期异种移植物的超声心动图图像。红线表示舒张期左心室壁厚度显着增加。 请点击此处查看此图的大图。

表 1：供体心脏的总缺血时间。

作者声明没有利益冲突。