揭开异食的复杂性：嗜肺军团菌的教训

耐药菌株的流行使得寻求新的抗菌方法来对抗传染病势在必行。自噬是细胞产生含有细胞蛋白质或细胞器的吞噬囊泡的基本真核过程，在调节细胞稳态和各种代谢过程中起着至关重要的作用¹。随着对自噬的了解不断加深，研究人员发现自噬囊泡可以选择性地靶向特定的细胞器、蛋白质或病原体²。异食是指细胞通过自噬选择性地识别细胞内病原体并将其输送到溶酶体进行清除的过程³。这一过程对于真核生物的先天免疫系统的防御机制至关重要⁴.因此，阐明其机制和调节是一个重要的研究领域，对开发新型抗感染策略具有重要意义。

嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性细胞内病原体，通常感染水生单细胞原生生物。然而，人类可能会因接触受污染的水而发生机会性感染，导致军团病，这是一种严重的肺炎⁵。进入宿主细胞后，军团菌利用 IV 型分泌系统 （T4SS） 转运大约 330 种效应蛋白，帮助逃避宿主免疫反应并确保细菌在细胞内的存活和增殖。军团菌与沙门氏菌一样，使用效应蛋白阻碍宿主异食，尽管精确的分子机制尚未确定⁶。例如，鼠伤寒沙门氏菌提供 III 型分泌效应子（例如 SopF），可使液泡 V-ATP 酶 ADP 核糖磺化并阻断自噬启动⁷，而嗜肺乳杆菌使用 T4SS 和 RavZ 和 SidE 等效应子来干扰异食的后期阶段 ^6,8。尽管有这些不同的策略，但这两种病原体最终都逃避了异食清除，凸显了自噬逃避的趋同策略。因此，研究这些毒力蛋白不仅有助于开发特定的抗感染疗法，而且还有可能揭示异食的分子复杂性。

异食清除病原体的机制

1984年，Rikihisa等人做出了一项重大发现，即立克次体感染的中性粒细胞产生自噬体，这标志着自噬参与细菌感染的首次^实例9。进一步研究发现，通过雷帕霉素诱导巨噬细胞自噬导致自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1与含有结 核分枝 杆菌的囊泡共定位，从而阻止细菌在细胞内增殖¹⁰。此外，已知细胞内病原体，如 伤寒沙门氏菌、 李斯特菌、 弗氏志贺氏菌和 马雷伯克霍尔德氏菌 ，诱导自噬，随后控制它们在宿主细胞内的生长¹¹。

异食是选择性自噬的一种形式，包括三个不同的过程：货物识别、自噬受体募集和溶酶体介导的降解（如图 1 所示）。然而，细胞识别入侵病原体（货物识别）并启动自噬的机制仍不清楚。研究表明，当细菌浸润细胞质时，泛素连接酶将泛素附着在病原体表面存在的病原体感染的液泡或蛋白质上 12,13,14。然后，这些标记的蛋白质组装成泛素外壳，包裹病原体并充当募集自噬适配体的信号平台，主要包括 p62/SQSTM1、NDP52、NBR1 和 optineurin。自噬接头通过LC3相互作用结构域（LIR）与蛋白质相互作用，除了介导泛素化蛋白结合的泛素结合结构域（UBD）¹⁵。例如，LRSAM1 和 Parkin 等宿主 E3 连接酶将泛素附着在入侵细菌上，从而产生泛素外壳信号，标记它们进行异食清除^16,17。此外，异食受体还可以通过与细菌吞噬体表面的半乳糖凝集素结合或直接与细菌表面蛋白相互作用来启动异食^18,19。另一种观点认为，吞噬体内的细菌可能通过破坏膜来改变囊泡的离子梯度，导致吞噬体膜上 V-ATP 酶的构象变化，吞噬体膜上 V-ATP 酶的构象发生变化，通过与^{ATG16L1 7,20} 的 WD40 结构域结合来募集 Atg5-Atg12-Atg16L1 复合物。ATG16L1还可以与通过其 WD40 结构域覆盖被吞没细菌的补体 C3 结合，将 Atg5-Atg12-Atg16L1 复合物募集到细菌吞噬体²¹ 上。目前尚不清楚这些不同的识别机制是否针对不同的细菌物种，或者它们是否发生在感染的不同阶段。为了充分了解这些机制，需要进一步的研究和探索。

病原体逃避异食的策略

在与宿主共同进化的过程中，细胞内病原体已经发展出各种机制来抑制异食 22,23,24。这导致感染期间的吸异反应较弱，因此难以观察²⁵。例如，β-溶血性链球菌分泌一种称为 SpeB 的半胱氨酸蛋白酶，该蛋白酶靶向 p62、NDP52 和 NBR1 进行降解。SpeB缺失的突变体无法抵抗自噬，它们在细胞内的生长受到抑制。这些发现证实了这些自噬接头在异食中的重要作用。已发现 Shigella flexneri 的毒力蛋白 VirG 通过将 Atg5 募集到细菌表面来诱导异食¹⁹。然而，该细菌还利用 III 型分泌系统来转运效应蛋白 IcsB，从而抑制 ATG5 与 VirG¹⁹ 的结合。因此，防止自噬发生¹⁹.细菌蛋白和自噬机制之间的这种竞争表明，Atg 蛋白可以直接识别细菌表面蛋白以启动异食。同样，肺炎链球菌的毒力蛋白 CpbC 通过形成 p62-CpbC-Atg14 复合物诱导 Atg14 的自噬降解，进而降低 Atg14 的水平。这会影响介导溶酶体相互作用的 Atg14-STX17 复合物，从而抑制异食²⁶。

在一项利用 沙门氏菌 作为模式细菌的研究中，Xu等人发现，V-ATP酶检测到感染引起的膜囊泡损伤，通过与ATG16L1⁷的WD40结构域结合导致异食激活。这种激活不是典型自噬途径的一部分。此外，毒力蛋白SopF具有介导V-ATP酶的ADP-核糖基化（ADPRylation）的能力，并抑制其引发异食的能力⁷。这说明了细菌及其分泌的毒力蛋白如何被用作研究和理解自噬的复杂现象和机制的宝贵工具，这些现象和机制在正常生理条件下通常难以探索。

军团菌 和外食

嗜肺乳杆菌通过纵宿主泛素化²⁷、囊泡转运²⁸、能量代谢²⁹ 和细胞运动³⁰ 等基本生物活性，建立称为含军团菌液泡 （LCV） 的复制生态位。尽管细胞内细菌中存在许多泛素化蛋白质³¹，但军团菌已经发展出各种机制来抵消自噬，阻止 LCV 与溶酶体融合 ^6,8。

RavZ 通过裂解 LC3-II 抑制自噬

第一个发现调节自噬的军团菌效应蛋白是 RavZ （Lpg1683）。作为半胱氨酸蛋白酶，RavZ 裂解碳末端甘氨酸与 LC3 先前氨基酸残基之间的酰胺键，导致 LC3 脂质化的不可逆损害⁸。与野生型军团菌相比，RavZ缺失的突变株（ΔravZ）在感染后宿主细胞中的LC3-II水平和LC3点数显著^增加8。转基因李斯特菌菌株（ΔhlyΔprfAcLLO）在进入细胞时可以引发强烈的吸异反应。当共感染细胞时，野生型军团菌可以抑制 ΔhlyΔprfAcLLO 菌株周围 LC3 的积累，但 ΔravZ 失去抑制菌株诱导异食的能力⁶。此外，RavZ在宿主细胞中的瞬时表达抑制饥饿诱导的自噬^8。这些结果表明，RavZ发挥广泛的反式作用作用（即在细胞质中弥漫作用）来拮抗自噬。令人惊讶的是，ΔravZ突变体的复制在宿主细胞中没有受到影响，并且在含有ΔravZ突变体^的LCV膜上没有明显的LC3募集^6,8。这些发现表明，除了 RavZ 之外，军团菌还可能利用其他效应蛋白来逃避宿主异食。

SidE 家族和异食

SidE 家族由四种大小超过 170 kDa 的同源蛋白质组成，分别命名为 SdeA、SdeB、SdeC 和 SidE³²。这些毒力蛋白在结构上相似，具有功能冗余，所有这些蛋白都含有单 ADP-核糖基转移酶 （mART） 结构域和磷酸二酯酶 （PDE） 结构域。研究发现，在没有泛素激活酶（E1）和泛素偶联酶（E2）的情况下，SidE家族作为独立的泛素连接酶（E3）发挥作用，催化底物独特的磷酸核糖基泛素化（PR-Ub）修饰^33,34,35。此过程分两步进行。以SdeA为例，首先，SdeA利用其mART结构域将泛素（Ub）的Arg42残基与源自NAD+的二磷酸腺苷核糖（ADPR）基团修饰，生成ADPR-Ub^33,36的中间产物。然后，ADPR-Ub的磷酸二酯键被SdeA的功能PDE结构域裂解，导致AMP的释放，PR-Ub与底物蛋白的丝氨酸残基连接³⁶。

SidE 家族具有许多真核蛋白质底物。除了介导 Rab1A、Rab6A 和 Rab33B 等 GTP 酶的磷酸核糖基泛素化干扰囊泡转运 ^33,37 外，最近的研究发现 SidE 家族还具有对异食的拮抗功能 ^6,38,39,40。与野生型军团菌相比，缺乏 SidE 家族编码基因 （ΔsidE） 的突变菌株显示出 LCV⁶² 上 p62 的募集显着增加。与在反式中起作用的 RavZ 不同，SidE 家族在顺式（在 LCV 局部作用于）中工作，以保护军团菌自身的液泡免受异食。转运 SidE 家族蛋白的军团菌不能抑制共感染的 ΔhlyΔprfAcLLO 李斯特菌菌株周围 p62 的募集⁶.与 ΔravZ 菌株类似，ΔsidEs 突变体也可以逃避宿主异食。SidE拮抗异食的机制尚不清楚，可能与其对磷酸核糖基泛素化介导的宿主泛素化系统的干扰有关。例如，SidE 对泛素的磷酸核糖基化可以阻止泛素结合受体识别 LCV，从而阻止 NDP52 或优化神经磷酸酶等衔接子募集到液泡中。

其他从事异食的效应器

除了 RavZ 和 SidE 之外， 嗜肺乳杆菌 还编码其他效应子，包括 LpSpl、Lpg1137 和 Lpg2936，这些效应子靶向自噬途径的各个阶段。LpSpl 是一种分泌酶，可模拟鞘氨醇-1-磷酸裂解酶，将鞘氨醇-1-磷酸 （S1P） 裂解成代谢物⁴¹。LpSpl 对 S1P 的消耗阻止了鞘氨醇积累并导致 mTORC1 激活，从而抑制自噬⁴¹ 的启动。Lpg1137 是一种蛋白酶，可裂解 SNARE 蛋白构合蛋白 17 （Stx17），这是自噬体-溶酶体融合所必需的⁴²。通过降解 Stx17，Lpg1137 干扰自噬体成熟并阻断异食⁴² 的最终融合步骤。Lpg2936 是一种核效应子，可引起自噬相关基因（例如 ATG7 和 LC3B）的表观遗传修饰，导致其表达减少⁴³。核心自噬成分的这种下调在转录水平上抑制了自噬体的生物发生⁴³。然而，人们对 LpSpl、Lpg1137 和 Lpg2936 在 军团菌 感染中的作用知之甚少;它们对 体内 逃避异食的贡献仍有待充分阐明。

表1 总结了参与异食抑制的关键嗜 肺乳杆 菌效应子、它们的靶点和功能，以及它们影响的异食阶段。

未来展望

主要的不确定性仍然存在，并提出了具体的下一步行动。首先，作用于异食的军团菌效应子的时间层次结构尚未解决（早期 LpSpl/mTORC1 与中/晚期 RavZ、SidE）;其次，几种自噬调节效应子（例如，LpSpl、Lpg2936）缺乏 体内 验证;第三，巨噬细胞亚群、上皮细胞和中性粒细胞之间食异性反应的细胞类型异质性映射不佳。我们提出了时间分辨感染图谱（脉冲追踪、LC3 脂质组学、PR-泛素蛋白质组学、实时报告者）来订购效应子作用;细胞类型特异性小鼠模型中的配对效应子缺失菌株（ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936）以建立因果关系;以及专注于 V-ATPase-ATG16L1 轴、LRSAM1/Parkin 标记和适配器模块 （OPTN/NDP52/p62） 的单细胞/空间多组学加 CRISPR/扰动-seq。在翻译上，我们设想了阻断RavZ（半胱氨酸蛋白酶活性位点）或SidE（mART / PDE PR-泛素化）的效应定向抑制剂，以恢复LCV上的LC3-II池和接头募集，以及增强货物标记（激活LRSAM1 / Parkin），稳定接头-LC3接合，并瞬时调整通量（TFEB激活，调节mTORC1）的宿主定向增强剂。肺靶向递送（例如，将抗 RavZ/SidE 药物与 TFEB 激动剂相结合的吸入纳米颗粒）应以带时间戳的细胞类型分辨读数（LC3 通量、PR-Ub 占用率、接头募集、融合指标）和体内功效（细菌载量、病理学、存活率）为基准。

嗜肺乳杆菌 已经进化出一系列令人印象深刻的策略来逃避异食，主要是通过其干扰货物识别、泛素化、自噬体成熟和溶酶体融合的多种效应蛋白。这些机制不仅使病原体能够在宿主细胞内生存和复制，而且还揭示了自噬调节的新方面。了解这些规避策略可以为了解宿主防御和微生物适应之间复杂的相互作用提供宝贵的见解。未来的研究应侧重于识别其他效应子，阐明其分子靶标，并阐明它们在感染过程中的时间调节。此外，利用这些机制见解可以指导开发以宿主为导向的疗法或恢复异食功能的新型抗菌药物。先进成像、结构生物学和组学方法的持续整合对于剖析嗜 肺乳杆菌 和自噬机制之间的动态相互作用至关重要，从而有可能带来对抗细胞内病原体的创新策略。

最后，许多军团菌效应子是多功能的，影响自噬以外的多个宿主过程。帮助嗜肺乳杆菌逃避异食的相同效应子也可以调节宿主细胞死亡（细胞灭亡）和免疫信号通路，进一步促进细菌存活 23,30,35,44,45。自噬逃避与其他宿主防御机制之间的串扰强调了全面研究军团菌毒力策略的必要性。探索自噬靶向效应子如何同时影响细胞凋亡和炎症将提供对宿主-病原体相互作用的更全面的了解，并可能揭示治疗干预的新靶点。

图1：异食机制示意图。 当细菌侵入细胞质时，泛素通过泛素连接酶与病原体表面或病原体感染液泡上存在的蛋白质偶联，然后形成包裹病原体的泛素外壳。这种泛素外壳充当募集自噬接头的信号平台。此外，自噬受体可以通过与细菌吞噬体表面半乳糖凝集素结合或直接与细菌表面蛋白相互作用来启动异食。 请点击此处查看此图的大图。

表1： 嗜肺乳杆菌 效应子的异食规避策略。该表列出了选定的 嗜肺乳杆菌 效应蛋白、它们的分子靶标或活性，以及它们破坏的异食途径的阶段。