（紫外-可见） 的紫外-可见光谱法

紫外-可见光谱 （UV-Vis） 是实验室中最流行的分析技术之一。

在紫外-可见光谱中，光以紫外或可见光谱中特定波长的波长穿过样品。如果样品吸收了一些光，则并非所有光都会通过或透射。透射率是透射光强度与入射光的强度之比，与吸光度相关。吸光度可以定量使用，以获得样品的浓度。它也可以以定性方式使用，通过将在一定波长范围（称为吸光度光谱）上测得的吸光度与已发布的数据相匹配来鉴定化合物。本视频将介绍紫外-可见光谱法，并演示其在实验室中测定样品浓度和反应动力学的应用。

当光子撞击分子并被吸收时，分子从其基态被提升到更高的能量状态。两者之间的能量差就是带隙。光子的能量必须与带隙完全匹配，才能使光子被吸收。化学结构决定带隙;因此，每个分子都有独特的吸光度光谱。

吸光度遵循比尔定律，该定律指出吸光度等于摩尔衰减系数乘以光程和浓度。摩尔衰减系数与单个化合物吸收特定波长光的能力有关。光程是指光穿过样品的距离，标准比色皿通常为 1 cm。如果吸收率已知，可以使用比尔定律来计算样品浓度，也可以使用校准曲线。

紫外-可见光通常被称为通用技术，因为大多数分子吸收紫外-可见光波长范围内的光。紫外范围为 100-400 nm，可见光谱范围为 400-700 nm。然而，大多数分光光度计不在 100-200 nm 的深紫外范围内工作，因为这个范围内的光源很昂贵。大多数紫外-可见分光光度计在紫外范围内使用氘灯，可产生 170-375 nm 的光，在可见光范围内使用钨丝灯，可产生 350-2,500 nm 的光。

由于光源通常是波长范围较宽的灯，因此使用滤光片或光栅选择特定的吸光度波长。光栅是一种在空间上分离光的波长，然后在所需波长的光处放置一个出口狭缝的装置。可以在一个波长范围内扫描光栅，以提供完整的吸光度光谱。这使得该技术可用于定量和鉴定各种分子。

现在，已经概述了紫外-可见光谱的基础知识，让我们看一下实验室中的一个简单紫外-可见分

在开始测量之前，打开分光光度计，让灯预热适当的时间以稳定它们。

在干净的比色皿中填充样品溶剂，准备空白样品，然后用无绒纸擦拭外部以去除任何指纹。

确保比色皿与光束路径外的任何凹槽侧面正确对齐，然后将其插入分光光度计。盖紧盖子以防止环境光进入系统。

测量空白样在一个波长或某个波长范围内的吸光度。记录或保存吸光度，因为必须从样品的吸光度中减去吸光度。

接下来，弃去空白物，用样品冲洗比色皿两次。然后，将比色皿填充约 ？装满样品。再次擦拭比色皿的外部，以确保其干净且无指纹。

将比色皿以正确的方向放入分光光度计中，并盖紧盖子。

在与空白相同波长或波长范围收集吸光度测量值或光谱。如果仪器没有自动减去空白光谱或测量值。

从收集的吸光度光谱中，确定最大吸光度或 ？max。

为了定量样品中的分析物量，使用一系列已知的分析物浓度创建校准曲线。有关如何构建和使用校准曲线的更多信息，请观看此集合的视频"校准曲线"。

吸光度测量还可用于通过测量整个反应过程中化合物浓度的增加或减少来计算反应动力学。首先在反应前以最大吸光度对样品（在本例中为蓝色染料）进行初始读数。

接下来，快速添加试剂，在本例中为 bleach，以开始化学反应。充分搅拌，使其与样品混合。

随时间在最大吸光度处测量吸光度。

显示了蓝色染料样品的初始吸光度光谱。背景色显示可见光谱中光的颜色。蓝色染料的最大吸光度约为 630 nm。

随时间测量蓝色染料和漂白剂之间的反应动力学。蓝色染料的吸光度会随着时间的推移而降低，因为它会与漂白剂发生反应。吸光度在 300 秒后接近零，表明反应已接近完成。有关动力学和反应的更多信息，请观看 JoVE 科学教育视频"反应速率定律"。

紫外-可见光谱法在许多不同的研究领域中被广泛用于识别或定量样品。

例如，紫外-可见光谱法在生物领域中被广泛使用，以量化样品中的蛋白质含量。Bradford 分析通常用于在染料的帮助下定量蛋白质。首先，制备已知蛋白质浓度的校准曲线，通常使用牛血清白蛋白 （BSA）。然后将考马斯蓝染色剂添加到每个标准品和样品中。然后在 595 nm 处测量蛋白质 - 染料复合物的吸光度。

或者，可以通过蛋白质在 280 nm 处的吸光度直接测量蛋白质。在这个例子中，使用超低体积分光光度计定量蛋白质浓度。对于许多蛋白质，吸光度 1 与 1 mg/mL 的浓度相关。

紫外-可见分光光度法还用于定量细胞培养物中细菌细胞的数量。对于此测量，吸光度或光密度在 600 nm 处测量。通常，OD600 测量值为 1 表示每 mL 存在 8 x 108 个细菌细胞。在整个培养物生长过程中测量细胞密度可以确定细菌生长曲线，并有助于确定培养物何时处于指数生长期。

氮氧化物和二氧化氮 （NOx） 是汽车尾气的副产品，可能对环境有害，因为它会形成破坏性的对流层臭氧。NOx 可通过与次伜酸和萘基乙二胺溶液反应来测量。所得溶液是粉红色偶氮染料分子，其强度与 NOx 浓度直接相关。然后可以使用 UV-Vis 分光光度计测定该浓度。

您刚刚观看了 JoVE 的紫外-可见光谱介绍。现在，您应该了解紫外-可见分光光度计作的基础知识，如何使用紫外-可见分光光度计测量样品，以及如何将吸光度与样品浓度相关联。

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