（紫外-可见）的紫外-可见光谱法

Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

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Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

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August 24, 2015

Overview

资料来源: 实验室的博士 B.吉尔 Venton-弗吉尼亚大学

（紫外-可见）的紫外-可见光谱法是最受欢迎的分析技术之一，因为它是非常多才多艺，能够检测到几乎每一个分子。紫外-可见光谱法，紫外-可见光光通过样品和样品的光透射率衡量。从透光率 (T)，可以作为 =-日志 (T) 计算吸光度。吸光度谱表明在不同波长的吸收的化合物。所用的任何波长处的吸光度是由于分子的化学结构。

紫外-可见可用于以定性的方式，确定官能团或通过匹配吸收谱确认身份的一种化合物。作为分析物的浓度与吸光度使用啤酒的法律，也可以以定量的方式，使用它。紫外-可见光谱法用于量化的 DNA 或蛋白质在示例中，水分析，以及对许多类型的色谱的检测器。化学反应动力学也通过随着时间的推移在重复的紫外-可见测量，测量与紫外-可见光谱。一般用分光光度计进行紫外-可见度量。紫外-可见也是非常受欢迎仪其他分析技术，如色谱法，因为它可以检测许多化合物。

通常，紫外-可见不是光的最敏感的光谱技术，因为不是光的很多被吸收在较短的路径长度。其他如荧光的光谱技术有较高的灵敏度，但他们不是作为一般适用，因为大多数分子不是荧光。紫外-可见到其他吸光度测量，如红外光谱相似的灵敏度。

Principles

紫外-可见通常被称为通用的技术，因为大多数分子将吸收在紫外-可见光波长范围内。Uv 光从 100-400 毫微米和可见光谱从 400-700 nm 延伸。100 — — 200 毫微米范围称为深紫外。光源是更难找到对此范围内，所以不经常被用于紫外-可见测量。典型的紫外可见光谱仪使用产生光从 350-2,500 纳米的紫外线，产生光从 170 — — 375 nm 和钨丝白炽灯为可见，氘灯。

当光子击中一种分子和被吸收时，分子被提升到更兴奋的饱满的精神状态。紫外-可见的光有足够的能量，促进电子到一个更高的电子状态，从最高的被占领分子轨道 (HOMO) 到最低空分子轨道 (LUMO)。HOMO 与 LUMO 之间的能量差称为带隙。通常情况下，这些轨道被称为成键和反键。光子的能量必须完全匹配带隙光子被吸收。因此，具有不同化学结构的分子有不同的能量带隙和不同吸收谱。最常见的转换，落在紫外-可见光范围内的 π-π * 和 n-π *。引起双键的 π 轨道和 n 轨道是为非成键电子。Pi 星是反键 π 轨道。因此，最好的紫外-可见吸收光谱是由含有双键的分子。彼此相邻的连接，称为共轭 π 轨道通常增加吸收。西格玛-σ * 跃迁，伴单键，是更高的能量和跌幅深紫外，所以他们都是常规使用的那么有用。广泛的乐队或肩膀上的紫外-可见结构的外观是由于许多振动和转动国家的一分子，这导致分离能源带隙的略有不同的能量。

与可见光区吸收的分子，化合物会经常出现彩色。然而，一个常见的误解是波长峰值吸收 (λ_最大) 的一种化合物是它出现的颜色。出现红色的化合物没有多吸收在红色区域的光谱。相反，λ_最大的一种化合物，看上去红是绿色的。一种化合物的颜色出现因为这些波长的光有选择性地传过样本，因此他们不是被吸收。色轮是有助于确定一种化合物会吸收什么颜色和什么 λ 范围_最大，将直接穿过车轮从观察到的颜色的颜色最被吸收的颜色。

吸收遵循定律，A = 的 εbC ε 是摩尔的衰减系数，b 是路径长度，，C 是浓度。摩尔的衰减系数是一种个人的化合物吸收特定波长的特点，此属性是由于官能团、共轭等。如果一种化合物不具有高的衰减系数，它可以使用适当的组来增加其吸光度标记。路径长度一般与试管的大小有关，是标准的分光光度计 1 厘米。

各种仪器，从更多的现代天板读者传统分光光度计进行紫外-可见。必须选择吸收波长，使用筛选器或单色器。单色器是光的光的一种设备，空间上分离波长，然后将出射狭缝放置所需的波长在哪里。可以扫描单色仪提供整个的吸收光谱。或者，二极管阵列仪器允许所有颜色的光传输通过样品，然后光空间上分离成不同波长和检测到使用光电二极管。二极管阵列文书收集全谱速度更快，但是更复杂和更昂贵。

Procedure

1.校准分光计

紫外可见光谱仪打开，允许灯，以适当的一段时间（大约 20 分钟）以稳定他们热身。
试管装满样品的溶剂和确保外面是干净。这将作为一片空白，并有助于占光损失散射或吸收的溶剂。
将试管放在分光计。请务必正确对齐的试管，试管一样经常有两面，这意味着处理（可能槽）而不是通过的光芒。
以阅读为空白。吸光度应该很小，但任何吸光度应减去未来样品。一些文书可能将空白数据存储和自动执行减法运算。

2.执行吸收光谱

试管装满样品。若要确保转让是定量，冲洗两次与样本试管，然后填充它关于 ¾ 充分。请确保外面是清洁的任何指纹，等等。
将试管放在光谱仪在正确的方向。
盖试管以防止任何光线。
通过允许通过不同波长扫描和收集吸光度的手段来收集吸收谱。波长范围可以设置与信息有关该特定的示例，但一系列 200-800 nm 是标准。二极管阵列仪器是能够收集在一个运行整个吸收谱。
从收集的吸收光谱，确定吸光度最大值 (λ_最大)。重复的光谱，获得的错误估计在 λ_最大集合。
若要使校准曲线，收集各种不同浓度样品的紫外-可见光谱。光谱仪线性范围很有限，不能够测量吸光度值大于 1.5。如果样品的吸光度值超出仪器的线性范围，稀释的样本，以获取线性范围内的值。

3.动力学与紫外-可见光谱的实验研究

紫外-可见可以用于通过检查吸光度随时间变化的动力学实验研究。动力学实验中，采取样品初始阅读。
快速添加试剂开始的化学反应。
搅拌好，拌入样品。如果添加了少量，这样可在试管中。或者，与样品混合试剂，迅速倒一些在试管为一次测量。
衡量随着时间的推移在 λ_最大的利益被分析物的吸收。如果使用了被测量的试剂（即吸光度上涨由于还有少试剂吸收），然后衰变会指示反应的顺序。
用校准曲线，使情节的分析物浓度与时间，转换成浓度的吸光度值。从那里，此图可以符合适当的方程来确定反应速率常数。

紫外-可见，或紫外-可见光谱法是最受欢迎的分析技术，在实验室之一。

在紫外-可见光谱，光通过样品在特定波长的紫外或可见光谱。如果样品吸收一些光，并不是所有的光线将通过，或传输。传输与入射光的透射光的强度之比和吸光度密切相关。吸光度可以以定量的方式，用于获得样品的浓度。它也可以以定性的方式，用来识别一种化合物称为吸收光谱对已发布数据的波长范围内匹配测得的吸光度。这个视频将介绍紫外-可见光谱和论证在实验室中测定样品的浓度和反应动力学中的应用。

当光子击中一种分子和被吸收时，分子从其基态提升到一个更高的能量状态中。两者之间的能量差是带隙。光子的能量必须完全匹配带隙光子被吸收的顺序。化学结构决定了带隙;因此每个分子具有独特的吸收光谱。

吸光度遵循啤酒的法，哪个国家吸光度等于摩尔衰减系数时代路径长度和浓度。摩尔的衰减系数与个别化合物吸收特定波长的光的能力有关。路径长度是指光线穿过样品，通常是为标准小试管 1 厘米的距离。啤酒的法律可以用于计算样品浓度，如果吸收率已知的或可以使用的校准曲线。

紫外-可见通常被称为通用的技术，如大多数分子吸收阳光中的紫外-可见光的波长范围。紫外范围从 100-400 毫微米和可见光谱范围从 400-700 nm 延伸。然而，大多数分光光度计不要操作在 100 — — 200 毫微米，深紫外光范围内，在这个范围内的光源却很贵。大多数的紫外-可见分光光度计使用氘灯产生光从 170 — — 375 nm 和钨丝白炽灯为可见的范围，产生光从 350-2,500 nm 的紫外线范围。

由于光源通常是一盏灯与宽广的波长范围，使用筛选器或单色器选择特定吸收波长。单色器是光的光的一种设备，空间，分离波长，然后将出射狭缝放置所需的波长在哪里。单色器可以在一个波长范围，以提供整个的吸收光谱扫描。这使得这项技术对于量化和识别的分子种类繁多非常有用。

既然概述了紫外-可见光谱的基本知识，让我们看看一个简单的紫外-可见实验在实验室里。

之前开始测量，分光光度计，打开，允许灯，以适当的一段时间，以稳定他们热身。

备清洁试管装满样品溶剂，一片空白，然后擦去外面起毛的纸来删除任何指纹。

确保试管正确对齐与任何槽边从梁路径，并将其插入到分光光度计。安全盖，防止光线进入系统。

测量在一个波长，或在一个波长范围内的空白吸光度。记录或保存吸光度，因为它必须减去样品的吸光度。

接下来，放弃了空白并冲洗两次与样本试管。然后，填写关于 ¾ 满样本试管。擦去外面的试管再一次，以确保它是清洁和畅通的指纹。

将试管放在正确的方向，分光光度计和安全盖。

收集作为空白吸光度测量或在同一波长或波长范围的频谱。减去空白频谱或测量，如果仪器没有自动这样做。

从收集的吸收光谱，确定吸光度最大值，或 λ_最大。

以量化的抽样分析物的量，请创建使用一系列已知的分析物浓度的校准曲线。有关如何构建和使用的校准曲线的更多信息，请观看此集合的视频的”校准曲线”。

吸光度测量也可以用于计算反应动力学测定增加或减少整个反应的化合物浓度。开始采取样品，初始阅读时吸光度最大反应前后的在这种情况下，蓝色染料。

接下来，快速添加试剂，在此情况下，开始化学反应漂白。搅拌均匀，所以，它混合了与样品。

随着时间的推移测量吸光度最大处的吸光度。

所示的蓝色染料样品初始吸收光谱。背景颜色显示在可见光谱的光的颜色。蓝色染料有吸光度最大值在约 630 nm。

随着时间的推移，测定了蓝色染料和漂白剂之间反应的动力学。蓝染料的吸光度随时间的推移，它的反应与漂白剂。吸光度达到接近于零后 300 s，指示反应已接近完成。对动力学和反应的详细信息，请看朱庇特科学教育视频”反应速率定律”。

在许多不同的研究领域中大量使用紫外-可见光谱识别或量化的样本。

例如，紫外-可见光谱用于大量生物领域量化样品中蛋白质的量。布拉德福德测定常用来量化蛋白质，借助一种染料。首先，准备好了已知的蛋白质浓度的校准曲线，通常使用牛血清白蛋白或牛血清白蛋白。然后考马斯亮蓝染色被添加到每个标准和样品。吸收的蛋白质染料复杂然后测量在 595 nm。

或者，可以直接由他们 280 处的吸光度测量蛋白质毫微米。在此示例中，蛋白质浓度被量化用超低容量分光光度计。对于许多蛋白质，浓度为 1 毫克/毫升 1 相关因素的吸光度。

紫外-可见光谱还用于确定细胞培养液中的细菌细胞的数量。这种测量方法、吸光度，或光密度，衡量在 600 毫微米。通常情况下，1 OD₆₀₀测量指示 8 x 10⁸每毫升细菌细胞的存在。整个文化生长的细胞密度测量使细菌的生长曲线，测定和可有助于确定当一种文化是在其呈指数级增长阶段。

一氧化氮和二氧化氮或没有_x，是汽车尾气的副产品，可以是对环境有害的因为它形成破坏性的对流层臭氧。没有_x可测定反应它与对氨基苯磺酸酸和观察其乙二胺的溶液。最终的解决方案是粉红色色偶氮类染料分子，其中强度直接与 NO_x浓度相关。然后可以使用紫外可见分光光度计确定此浓度。

你刚看了紫外-可见光谱的朱庇特的简介。现在，您应该了解紫外-可见操作、如何衡量使用紫外-可见的示例以及如何关联到样品浓度的吸光度基本的知识。

谢谢观赏！

Results

紫外-可见可以用于获取各种有色化合物。在图 1A，所示的蓝色染料的吸收光谱。背景显示在可见光谱的光的颜色。蓝色染料在橙红色的 λ_最大吸光度。图 1B显示频谱的一种红色染料，与 λ_最大的绿色。

可以从情节随着时间的推移在一个波长吸光度测量动力学。图 2显示了一块蓝染料的吸光度 (在 630 nm) 因为它反应与漂白剂。

图 1。紫外-可见吸收光谱。A.蓝色染料 #1 在橙红色有最大吸收。B.红色染料 #40 具有最大吸光度在绿色。请点击这里查看此图的大版本。

图 2。紫外-可见的动力学。作为它的 #1 蓝染料的吸光度与漂白反应。曲线可以符合指数衰减，指示第一阶动力学。请点击这里查看此图的大版本。

Applications and Summary

紫外-可见用于许多化学分析。它用来定量的大量蛋白质在溶液中，大多数蛋白质强烈吸收在 280 nm。图 3显示一个示例谱细胞色素 C，具有高吸光度亚铁血红素基团在 450，280。紫外-可见也用作为一种标准技术量化的 DNA 样本，因为所有的垒强烈吸收在 260 nm。RNA 和蛋白质也吸收在 260 nm，所以可以测量其他波长处的吸光度，检查是否有干扰。具体而言，蛋白质强烈吸收在 280 nm，所以 280/260 吸收比率能样品中 DNA 的蛋白质比措施。

大多数简单分析一次测量吸光度一个波长。然而，更多化学信息如果是存在很多波长同时进行测量。二极管阵列文书捕获所有光线的传输，分成不同的颜色使用棱镜或全息光栅光和不同波长处的吸光度的捕捉到，然后线性阵列的光电二极管。此方法的优点是有用同时测量许多不同的分子。

图 3。紫外-可见光谱的一种蛋白质。峰值在 280 nm 是指示性的一种蛋白质。在 450 峰为吸收的亚铁血红素基团中细胞色素 c。

Transcript

Ultraviolet-visible, or UV-Vis, spectroscopy is one of the most popular analytical techniques in the laboratory.

In UV-Vis spectroscopy, light is passed through a sample at a specific wavelength in the UV or visible spectrum. If the sample absorbs some of the light, not all of the light will be pass through, or be transmitted. Transmission is the ratio of the intensity of the transmitted light to the incident light, and is correlated to absorbance. The absorbance can be used in a quantitative manner, to obtain the concentration of a sample. It can also be used in a qualitative manner, to identify a compound by matching the measured absorbance over a range of wavelengths, called the absorbance spectrum, to the published data. This video will introduce UV-Vis spectroscopy, and demonstrate its use in the laboratory in determining sample concentration and reaction kinetics.

When a photon hits a molecule and is absorbed, the molecule is promoted from its ground state into a higher energy state. The energy difference between the two is the band gap. The energy of the photon must exactly match the band gap in order for the photon to be absorbed. The chemical structure determines the band gap; therefore molecules each have unique absorbance spectra.

Absorbance follows Beer’s Law, which states absorbance equals the molar attenuation coefficient times the path length and concentration. The molar attenuation coefficient is related to the individual compound’s ability to absorb light of a specific wavelength. Path length refers to the distance traveled by light through the sample, which is typically 1 cm for standard cuvettes. Beer’s law can be used to calculate sample concentration, if the absorptivity is known, or a calibration curve can be used.

UV-Vis is often called a general technique, as most molecules absorb light in the UV-visible wavelength range. The UV range extends from 100–400 nm, and the visible spectrum ranges from 400–700 nm. However, most spectrophotometers do not operate in the deep UV range of 100–200 nm, as light sources in this range are expensive. Most UV-Vis spectrophotometers use a deuterium lamp for the UV range, which produces light from 170–375 nm, and a tungsten filament lamp for the visible range, which produces light from 350–2,500 nm.

Since the light source is usually a lamp with broad wavelength ranges, the specific absorbance wavelength is selected using filters or a monochromator. A monochromator is a device that separates the wavelengths of light spatially, and then places an exit slit where the desired wavelength of light is. The monochromator can be scanned over a wavelength range to provide an entire absorbance spectrum. This makes the technique useful for quantifying and identifying a wide range of molecules.

Now that the basics of UV-Vis spectroscopy have been outlined, lets take a look at a simple UV-Vis experiment in the laboratory.

Before beginning the measurement, turn on the spectrophotometer, and allow the lamps to warm up for an appropriate period of time to stabilize them.

Prepare a blank by filling a clean cuvette with the sample solvent, and then wipe the outside with lint-free paper to remove any fingerprints.

Ensure that the cuvette is aligned properly with any grooved sides out of the beam-path, and insert it into the spectrophotometer. Secure the lid to prevent ambient light from entering the system.

Measure the absorbance of the blank at one wavelength, or over a wavelength range. Record or save the absorbance, as it must be subtracted from the absorbance of the sample.

Next, discard the blank and rinse the cuvette twice with sample. Then, fill the cuvette about ¾ full with sample. Wipe the outside of the cuvette again, to ensure that it is clean and free of fingerprints.

Place the cuvette in the spectrophotometer in the correct orientation, and secure the lid.

Collect an absorbance measurement or spectrum at the same wavelength or wavelength range as the blank. Subtract the blank spectrum or measurement, if the instrument does not automatically do so.

From the collected absorbance spectrum, determine the absorbance maximum, or λmax.

To quantify the amount of analyte in the sample, create a calibration curve using a range of known analyte concentrations. For more information on how to construct and use a calibration curve, please watch this collection’s video “Calibration Curves”.

The absorbance measurement can also be used to calculate reaction kinetics by measuring the increase or decrease in a compounds concentration throughout the reaction. Begin by taking an initial reading of the sample, blue dye in this case, at the absorbance maximum before the reaction.

Next, quickly add the reagent, bleach in this case, to start the chemical reaction. Stir it well, so that it mixes with the sample.

Measure the absorbance at the absorbance maximum over time.

The initial absorbance spectrum of the blue dye sample is shown. The background colors show the colors of light in the visible spectrum. The blue dye has an absorbance maximum at about 630 nm.

The kinetics of the reaction between blue dye and bleach was measured over time. The absorbance of blue dye decreases over time, as it reacts with the bleach. The absorbance reaches near zero after 300 s, indicating that the reaction has neared completion. For more information on kinetics and reactions, please watch the JoVE Science Education video “Reaction Rate Laws”.

UV-Vis spectroscopy is used heavily in many different research areas to identify or quantify a sample.

For example, UV-Vis spectroscopy is used heavily in biological fields to quantify the amount of protein in a sample. A Bradford assay is often used to quantify proteins, with the aid of a dye. First, a calibration curve of known protein concentrations is prepared, typically using Bovine Serum Albumin, or BSA. Then Coomassie blue stain is added to each of the standards and to the sample. The absorbance of the protein-dye complex is then measured at 595 nm.

Alternatively, proteins can be measured directly by their absorbance at 280 nm. In this example, protein concentration is quantified using an ultra low volume spectrophotometer. For many proteins, an absorbance of 1 correlates to a concentration of 1 mg/mL.

UV-Vis spectroscopy is also used to quantify the amount of bacterial cells in a cell culture. For this measurement, the absorbance, or optical density, is measured at 600 nm. Typically, an OD600 measurement of 1 indicates the presence of 8 x 108 bacterial cells per mL. Measuring the cell density throughout culture growth enables the determination of the bacterial growth curve, and can help to identify when a culture is in its exponential growth phase.

Nitrogen oxide and nitrogen dioxide, or NOx, is a by-product of automobile exhaust, and can be harmful to the environment because it forms damaging tropospheric ozone. NOx can be measured by reacting it with a solution of sulfanilic acid and napthyl-ethylenediamine. The resulting solution is a pink colored azo dye molecule, the intensity of which is directly correlated to NOx concentration. This concentration can then be determined using a UV-Vis spectrophotometer.

You’ve just watched JoVE’s introduction to UV-visible spectroscopy. You should now understand the basics of UV-Vis operation, how to measure a sample using a UV-Vis and how to correlate absorbance to sample concentration.

Thanks for watching!